Här beskriver vi syntesen av narkotikabelastade liposomer och deras mikroinjektion i larv zebrafisk i syfte att rikta läkemedelsleverans till makrofag-härstamning celler.
Zebrafisk(Danio rerio)larver har utvecklats till en populär modell för att undersöka värdpatogeninteraktioner och bidraget från medfödda immunceller till inflammatorisk sjukdom på grund av deras funktionellt bevarade medfödda immunsystemet. De används också i stor utsträckning för att undersöka hur medfödda immunceller hjälper till att vägleda utvecklingsprocesser. Genom att dra nytta av den optiska transparensen och genetiska tarmkraften hos larv zebrafisk, fokuserar dessa studier ofta på levande bildmetoder för att funktionellt karakterisera fluorescerande märkta makrofager och neutrofiler inom intakta djur. På grund av deras olika funktionella heterogenitet och ständigt växande roller i sjukdomspatogenes, makrofager har fått stor uppmärksamhet. Förutom genetiska manipulationer används nu kemiska ingrepp rutinmässigt för att manipulera och undersöka makrofagbeteende i larvzebrafish. Leverans av dessa läkemedel är vanligtvis begränsad till passiv inriktning på fri drog genom direkt nedsänkning eller mikroinjektion. Dessa tillvägagångssätt bygger på antagandet att alla ändringar av makrofagbeteende är resultatet av en direkt effekt av läkemedlet på makrofager själva, och inte en nedströms konsekvens av en direkt effekt på en annan celltyp. Här presenterar vi våra protokoll för inriktning droger specifikt till larv zebrafisk makrofager genom microinjecting drog-loaded fluorescerande liposomer. Vi avslöjar att poloxamer 188-modifierade droglastade blå fluorescerande liposomer lätt tas upp av makrofager, och inte av neutrofiler. Vi ger också bevis för att läkemedel som levereras på detta sätt kan påverka makrofagaktivitet på ett sätt som är förenligt med mekanismen för läkemedlets verkan. Denna teknik kommer att vara av värde för forskare som vill säkerställa inriktning av läkemedel till makrofager och när läkemedel är för giftiga för att levereras med traditionella metoder som nedsänkning.
Det mononukleära fagocytsystemet ger en första försvarslinje mot invaderande patogener. Detta system består av monocyter, monocyt-härledda dendritiska celler och makrofager, som aktivt fagocytoze utländska patogener, vilket begränsar patogen spridning. Förutom dessa fagocytiska och mikrobiska effektorfunktioner kan dedritiska celler och makrofager också cytokinproduktion och antigenpresentation aktivera det adaptiva immunsystemet1. Av dessa celler har makrofager fått särskild uppmärksamhet på grund av deras olika funktionella heterogenitet och engagemang i flera inflammatoriska sjukdomar, från autoimmunitet och infektionssjukdomar till cancer2,3,4,5,6,7. Makrofagers plasticitet och deras förmåga att funktionellt anpassa sig till behoven till sin vävnadsmiljö kräver experimentella metoder för att direkt observera och förhöra dessa celler in vivo.
Larval zebrafisk är en idealisk modell organism för att studera funktion och plasticitet makrofager in vivo8. Den optiska genomskinligheten hos larv zebrafisk ger ett fönster för att direkt observera makrofagers beteende, särskilt i kombination med makrofagmärkning transgena reporterlinjer. Utnyttja levande bildbehandling potential och experimentell auttlighet larv zebrafisk har lett till många betydande insikter i makrofag funktion som har direkt relevans för människors sjukdom9,10,11,12,13, 14,15. Många av dessa studier har också dragit nytta av den höga bevarandet av läkemedelsaktivitet i zebrafisk (ett attribut som ligger till grund för deras användning som en hel djurläkemedelsupptäcktplattform16,17,18), genom att använda kemiska interventioner för att farmakologiskt manipulera makrofagfunktion. Hittills har dessa farmakologiska behandlingar mestadels levererats antingen genom nedsänkning, vilket kräver att läkemedlet är vattenlösligt, eller genom direkt mikroinjektion av fritt läkemedel(figur 1A). Begränsningar av dessa passiva leveransstrategier omfattar effekter utanför målet och allmän toxicitet som kan förhindra att man bedömer eventuella effekter på makrofagfunktionen. Dessutom, när man undersöker läkemedelseffekter på makrofager är det okänt om drogerna agerar på makrofager själva eller genom mer indirekta mekanismer. När du utför liknande kemiska interventionsstudier för att undersöka makrofagfunktion, insåg vi att det fanns ett otillfredsställt behov av att utveckla en billig och enkel leveransmetod för att rikta läkemedel specifikt till makrofager.
Liposomer är mikroskopiska, biokompatibla, lipid bilayered blåsor som kan kapsla proteiner, nukleotider och narkotika last19. Unilamellar eller multilamellar lipid bilayer struktur liposomer bildar en vattenlösliga läkemedel kan införlivas medan hydrofoba läkemedel kan integreras i lipidmembranen. Dessutom kan de fysicokemiska egenskaperna hos liposomer, inklusive storlek, laddning och ytmodifieringar manipuleras för att skräddarsy sin inriktning till specifika celler20,21. Dessa funktioner i liposomer har gjort dem till ett attraktivt fordon för att leverera droger och förbättra precisionen i nuvarande behandlingsregimer20. Som liposomer är naturligt fagocytozed av makrofager (en funktion som utnyttjas av deras rutinmässiga användning för att leverera clodronate specifikt till makrofager för ablation experiment22),de presenterar som ett attraktivt alternativ för makrofag-specifika läkemedelsleverans(figur 1B).
Detta protokoll beskriver formuleringen av läkemedel till blå fluorescerande liposomer belagda med hydrofilpolymer poloxamer 188, som bildar ett skyddande lager på liposome ytan och har visat sig förbättra läkemedelsretention och har överlägsen biokompatibilitet23. Poloxamer valdes för ytbeläggning av liposomer som vår tidigare forskning hade visat att, jämfört med polyetenglykol modifierade liposomer, poloxamer modifierade liposomer visade bättre biokompatibilitet efter subkutan injektion av råtttassar och liknande farmakokinetik hos kaniner efter intravenös infusion23. Protokoll beskrivs också för deras mikroinjektion i larv zebrafisk och levande bildbehandling för att bedöma deras makrofag-inriktning förmåga och lokalisering till intracellulära fack som krävs för liposome nedbrytning och cytoplasmatisk läkemedelsleverans. Som ett proof-of-concept har vi tidigare använt denna teknik för att rikta två läkemedel till makrofager för att undertrycka deras aktivering i en larv zebrafisk modell av akut gouty inflammation24. Denna drogleveransteknik utökar den kemiska “verktygslåda” som finns tillgänglig för zebrafiskar forskare som vill säkerställa makrofag-inriktning av sina läkemedel av intresse.
Här har vi lämnat ett detaljerat protokoll för att formulera droglastade liposomer för att specifikt rikta makrofager i larv zebrafisk. Denna metod kan användas för att dissekera makrofagers roll i vissa sjukdomsmodeller genom att säkerställa direkt riktad leverans av läkemedel specifikt till makrofager. Dessutom kan det användas när den allmänna toxiciteten av läkemedel begränsar deras användning när de levereras av mer konventionella rutter, som nedsänkning. Protokollet som beskrivs här ger ett altern…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av bidrag som beviljats C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) och Z.W. (Faculty Research Development Fund från University of Auckland). Författarna tackar Alhad Mahagaonkar för experthantering av zebrafish anläggningen, Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland för hjälp med confocal imaging och Graham Lieschke för gifting Tg (mpeg1: EGFP) reporter linje.
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
micromanipulator | Narishige | M-152 | |
mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
water bath | |||
Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |