Summary
Aqui, descrevemos a síntese de liposós carregados de drogas e sua microinjeção em zebrafish larval com o propósito de direcionar o fornecimento de drogas para células de linhagem de macrófagos.
Abstract
As larvas de zebrafish (Danio rerio) desenvolveram-se em um modelo popular para investigar interações hospedeiras-patógenas e a contribuição de células imunes inatas para doenças inflamatórias devido ao seu sistema imunológico inato funcionalmente conservado. Eles também são amplamente utilizados para examinar como as células imunes inatas ajudam a orientar os processos de desenvolvimento. Aproveitando a transparência óptica e a tratabilidade genética dos zebrafish larvais, esses estudos muitas vezes se concentram em abordagens de imagem ao vivo para caracterizar funcionalmente macrófagos e neutrófilos fluorescentes dentro de animais intactos. Devido à sua diversa heterogeneidade funcional e papéis em constante expansão na patogênese da doença, os macrófagos receberam atenção significativa. Além das manipulações genéticas, as intervenções químicas são usadas rotineiramente para manipular e examinar o comportamento do macrófago em zebrafish larval. A entrega dessas drogas é tipicamente limitada ao direcionamento passivo de drogas gratuitas através de imersão direta ou microinjeção. Essas abordagens dependem da suposição de que quaisquer alterações no comportamento do macrófago são resultado de um efeito direto da droga nos próprios macrófagos, e não uma consequência a jusante de um efeito direto em outro tipo de célula. Aqui, apresentamos nossos protocolos para direcionar drogas especificamente para macrófagos de zebrafish larval, microinjetando liposós fluorescentes carregados de drogas. Revelamos que liposomos fluorescentes azuis carregados de drogas modificadas por poloxamer 188 são prontamente tomados por macrófagos, e não por neutrófilos. Também fornecemos evidências de que drogas entregues dessa forma podem impactar a atividade do macrófago de forma consistente com o mecanismo de ação da droga. Essa técnica será de valor para os pesquisadores que desejam garantir o direcionamento de medicamentos aos macrófagos e quando as drogas são tóxicas demais para serem entregues por métodos tradicionais como a imersão.
Introduction
O sistema de phagócito mononuclear fornece uma primeira linha de defesa contra patógenos invasores. Este sistema consiste em monócitos, células e macrófagos derivados de monocitos, que ativamente fagocytoze patógenos estrangeiros, limitando assim a propagação de patógenos. Além dessas funções de efeito phagofítico e microbicida, células dendríticas e macrófagos também são capazes de produção de citocinas e apresentação de antígenos para ativar o sistema imunológico adaptativo1. Dessas células, os macrófagos têm recebido atenção especial devido à sua diversa heterogeneidade funcional e envolvimento em múltiplas doenças inflamatórias, desde autoimunidade e doenças infecciosas até câncer2,3,4,5,6,7. A plasticidade dos macrófagos e sua capacidade de se adaptar funcionalmente às necessidades de seu ambiente tecidual exigem abordagens experimentais para observar e interrogar diretamente essas células in vivo.
Zebrafish larval são um organismo modelo ideal pelo qual estudar a função e plasticidade dos macrófagos no vivo8. A transparência óptica do zebrafish larval fornece uma janela para observar diretamente o comportamento dos macrófagos, especialmente quando acoplado com linhas de repórtertransgênicas com marcação de macrófagos. Explorar o potencial de imagem ao vivo e a tratabilidade experimental de zebrafish larval levou a muitas percepções significativas sobre a função macrófaga que têm relevância direta para a doença humana9,10,11,12,13,14,15. Muitos desses estudos também se aproveitaram da alta conservação da atividade medicamentosa em zebrafish (atributo que sustenta seu uso como uma plataforma inteira de descoberta de drogas animais16,17,18), utilizando intervenções químicas para manipular farmacologicamente a função macrófago. Até o momento, esses tratamentos farmacológicos têm sido entregues principalmente através da imersão, o que exige que a droga seja solúvel em água, ou por microinjeção direta de droga gratuita(Figura 1A). Limitações dessas estratégias de entrega passiva incluem efeitos fora do alvo e toxicidade geral que podem impedir a avaliação de qualquer impacto na função do macrófago. Além disso, ao investigar efeitos medicamentosos em macrófagos não se sabe se as drogas estão agindo sobre os próprios macrófagos ou através de mecanismos mais indiretos. Ao realizar estudos semelhantes de intervenção química para investigar a função do macrófago, reconhecemos que havia uma necessidade não atendida de desenvolver um método de entrega barato e direto para direcionar medicamentos especificamente para macrófagos.
Liposomos são corículas microscópicas, biocompatíveis e lipídicas que podem encapsular proteínas, nucleotídeos e carga de drogas19. A estrutura de bicamadas lipídicas unilamelares ou multilémelares de liposomos forma um lúmen interno aquoso onde drogas solúveis em água podem ser incorporadas enquanto drogas hidrofóbicas podem ser integradas às membranas lipídicas. Além disso, as propriedades físicoquímicas dos liposomos, incluindo tamanho, carga e modificações de superfície podem ser manipuladas para adaptar seu direcionamento a células específicas20,21. Essas características dos liposomos tornaram-nos um veículo atraente para entregar medicamentos e melhorar a precisão dos regimes de tratamento atuais20. Como os liposós são naturalmente fagocytozed por macrófagos (um recurso explorado por seu uso rotineiro na entrega de clodronato especificamente para macrófagos para experimentos de ablação22), eles apresentam como uma opção atraente para a entrega de drogas específicas do macrófago(Figura 1B).
Este protocolo descreve a formulação de medicamentos em liposomos fluorescentes azuis revestidos com o poloxamer de polímero hidrofílico 188, que forma uma camada protetora na superfície liposome e tem sido mostrado para melhorar a retenção de drogas e ter biocompatibilidade superior23. Poloxamer foi escolhido para revestimento superficial de liposomos como nossa pesquisa anterior mostrou que, quando comparado com liposós modificados de polietileno glicol, liposomos modificados de poloxamer mostraram melhor biocompatibilidade após injeção subcutânea de patas de rato e farmacocinética semelhante em coelhos após infusão intravenosa23. Protocolos também são descritos para sua microinjeção em zebrafish larval e imagens vivas para avaliar sua capacidade de segmentação de macrófagos e localização para compartimentos intracelulares necessários para degradação liposome e entrega de drogas citoplasmáticas. Como prova de conceito, já usamos essa técnica para direcionar duas drogas aos macrófagos para suprimir sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação gouty aguda24. Esta técnica de entrega de drogas expande o "kit de ferramentas" químico disponível para pesquisadores de zebrafish que desejam garantir o direcionamento de macrófagos de suas drogas de interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de Liposomes marina azul carregado de drogas
NOTA: Liposomes carregando o corante fluorescente azul, Marina Blue e droga são preparados usando um método de hidratação de filme fino com pós-inserção de poloxamer 188. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, a menos que seja especificado de outra forma. Os liposós de controle só carregam Marina azul e PBS. O exemplo aqui descreve carregar liposomos com uma droga antioxidante25 que é usada nos resultados representativos como prova de conceito.
- Para preparar liposós, dissolva 16,4 mg (22,2 μmol) dos fosfolipidas 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosphocolina (ver Tabela de Materiais), 4.3 mg (11,1 μmol) colesterol (ver Tabela de Materiais) e 2,8 mg (3,7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glicero-3-fosfatcolina (ver Tabela de Materiais, em 3 mL de clorofórmio:metanol (3:1 v/v) em um frasco de fundo redondo de 25 mL.
- À mistura acima, adicione 31 nmol de Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-phosphoetanolamina (ver Tabela de Materiais) e 300 nmol de uma droga inibidora de mROS (ver Tabela de Materiais) e sônico brevemente para dissolver totalmente. Para liposós de controle, adicione apenas Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-phosphoetanolamina.
NOTA: Para evitar o fotobranqueamento do corante fluorescente Marina Blue sensível à luz, proteja todos os procedimentos da luz, sempre que possível. Isso também é importante se a droga a ser carregada for sensível à luz. - Remova o solvente lentamente em um evaporador rotativo (ver Tabela de Materiais) sobre um banho de água controlado pela temperatura definido para 45 °C girando a 75 rpm pressão de vácuo (200 mbar por 15 min e 0 mbar por 20 min). Isso forma uma película lipídica fina seca dentro das paredes de vidro do frasco que é ainda mais seca por 45 minutos abaixo de N2 para facilitar a remoção completa do solvente orgânico.
- Após a formação do filme fino, fixe a pressão do vácuo para 40 mbar por 15 min, depois expurgar com gás nitrogênio por 30 min para garantir a remoção do resíduo solvente.
- Hidrate a película fina usando 1 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS, pH 7.4) e vedacom o parafilme antes de agitar o frasco usando um evaporador rotativo sobre um banho de água de 60 °C por 20 min para formar vesículas.
- Submeter a suspensão hidratada a 7 ciclos de congelamento e degelo congelando em líquido N2 por 3 min seguido de imersão em um banho de água de 45 °C por 7 min.
- Extruda liposós através de uma membrana usando um mini-extrusor (ver Tabela de Materiais) e 1,0 μm de membranas policarbonatos gravados (ver Tabela de Materiais) para 2-6 ciclos, a fim de obter grandes vesículas unilamellar.
NOTA: Para atingir um direcionamento mais favorável para macrófagos, manipule ciclos de extrusão até que o diâmetro dos liposós seja de aproximadamente 1 μm26,27,28. - Condensar os liposós frescos em uma pelota por ultracentrifugação a 186.000 x g e incubar com 1 mL de 1% poloxamer 188 (ver Tabela de Materiais) solução (10 mg/mL em PBS) a 45 °C e 750 rpm por 30 min usando um termomixer com um acessório de tubo de microcentrífuga de 2 mL (ver Tabela de Materiais).
- Ultracentrífuga a mistura a 186.000 x g por 1 h a 4 °C e remova o supernatant a fim de remover qualquer polímero ou droga desvinculado. Guarde as pelotas liposós a 4 °C, protegidas da luz.
2. Caracterização do Tamanho Liposome e Potencial Zeta
- Diluir a formulação liposome com água ultrapura (1:100) e medir o tamanho da partícula, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial zeta dos liposomos usando um analisador dinâmico de dispersão de luz (ver Tabela de Materiais),triplicado a 25 °C.
NOTA: O PDI é uma medida da distribuição de tamanho da população de nanopartículas. Valores PDI < 0,05 indica uma distribuição mais uniforme, enquanto valores mais próximos de 1 indicam uma distribuição de tamanho maior. O potencial zeta é a carga geral da superfície.
3. Cálculo da Eficiência de Armadilha e Carregamento de Drogas em Liposós
NOTA: Para determinar a eficiência da aprisionamento da droga nos liposomos, o teor de drogas contido na supernatante e no liposome pellet são medidos.
- Resuspender a pelota liposome em 1 mL da PBS.
- Remova o supernatante, dilua 10 x com água ultrapura e analise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).
- Para determinar a concentração de medicamentos dentro dos liposomos, adicione 100 μL de suspensão liposome a 900 μL de 10% de solução triton-X100 (para destruir a membrana lipídica, liberando a droga enlada e prevenindo o acúmulo de lipídio sustruoso dentro da coluna HPLC) e vórtice por 3 min antes da análise.
- Injete 20 μL de amostra em um sistema HPLC composto por uma bomba quaternary, termostato de amostrador automático e uma coluna de 3 μm 250 x 4,6 mm. Defina a fase móvel (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrila e metanol (30:40:30, v/v/v)) taxa de fluxo para 0,9 mL/min e obtenha perfis espectrais usando um detector de matriz de diode fixado a 230 mM.
- Calcule a eficiência de armadilha (EE) e o carregamento de medicamentos (DL) usando as seguintes equações:
EE (%) = [Eu / Mt] x 100
DL (%) = [Eu / Mlip] x 100
Onde eu é a massa de droga encapsulada, Mt é a massa total de droga usada durante a formulação e Mlip é a massa total dos lipídios (incluindo colesterol) e droga encapsulada.
4. Preparação e Injeção de Liposós
- Prepare agulhas de microinjeção borosilica inserindo uma parede fina capilarde vidro borosilica (1 mm D.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm de comprimento) em um dispositivo puxador de micropipette (ver Tabela de Materiais) com as seguintes configurações genéricas do puller (calor 680, puxar 75, velocidade 40, tempo 55 e pressão 530) para produzir uma microinjeção de microagulha sacada.
- Coloque as agulhas em uma placa de Petri na argila de modelagem e organize de uma forma que a extremidade puxada não está tocando na parte inferior do prato. Mantenha a tampa da placa petri fechada para evitar contaminação da poeira até que esteja pronta para uso.
- Diluir formulações liposóis recém-preparadas 1:1 em PBS estéreis (pH 7.4) e brevemente vórtice (2-3 s) para misturar.
NOTA: Proteja os liposós da luz até que as larvas estejam prontas para microinjeção. - Configure pares adultos de criação de zebrafish na noite anterior e cole embriões como descrito anteriormente por Rosen et al.29.
- Transfira os embriões para uma placa de Petri (estilo 100 mm x 20 mm com aproximadamente 60 embriões por prato) contendo e3 médio (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) complementado com 0,1% azul metileno para inibir o crescimento fúngico. Remova todos os embriões mortos ou não fertilizados e incuba durante a noite a 28,5 °C.
- Para facilitar a imagem ao vivo, adicione 0,003% n-Phenylthiourea (PTU) à mídia E3 quando os embriões chegam a 24h de desenvolvimento para evitar a formação de pigmentos (melação).
- Dechoriona manualmente os embriões a aproximadamente 30h após a fertilização (hpf) usando fórceps de ponta fina.
NOTA: Não use tratamento enzimático para deterínia embriões, pois isso pode causar danos epiteliais e inflamação local, influenciando assim estudos imunológicos - Deixe os embriões se desenvolverem a 28,5 °C até 2 dias após a fertilização (DPF).
- Prepare uma placa de injeção derramando 3% de celulose metila suficiente (na mídia E3) na tampa de um pequeno prato de cultura de 35 mm para formar uma película fina cobrindo toda a superfície.
NOTA: Ao preparar 3% de celulose metila na mídia E3, leva vários dias para a celulose de metila dissolver-se com agitação suave em um agitador orbital. - Anestesiar as larvas incubando na mídia E3 complementada com 200 μg/mL de Tricaine.
- Colete uma piscina de aproximadamente 20-25 larvas usando uma pipeta de transferência de plástico e permita que os embriões se concentrem na ponta da pipeta pela gravidade. Tomando cuidado para transferir as larvas com líquido mínimo, coloque-as no meio da tampa de prato cultural de 35 mm.
- Usando uma pá carregadeira microcapilar, organize as larvas das seguintes maneiras: anterior em direção ao topo da placa de injeção com a superfície dorsal voltada para a agulha de microinjeção, para injetar no ventrículo do cérebro traseiro (Figura 2A-D); ou, anterior em direção à esquerda da placa de injeção (ao injetar da direita) com a superfície ventral voltada para a agulha de microinjeção para injetar no venoso do seio(Figura 2I).
NOTA: Quando injetados desta forma, podem ser alvos os macrófagos de ventrículos de ventrículos do ventrículo retrocérebro(Figura 2E)e tecido hematopoieético caudal (CHT) residentes(Figura 2J), respectivamente. A região cht de zebrafish larval é um sítio hematopoieético análogo ao fígado fetal mamífero. Preste atenção extra para não danificar os embriões enquanto organiza, pois isso pode causar inflamação local, influenciando assim estudos imunológicos. - Tome liposós recém-preparados (a partir do passo 4.3) e encha uma agulha de injeção com aproximadamente 5 μL da mistura de injeção liposome usando um carregador microcapilar (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Ao avaliar a localização dos liposomos nos compartimentos fagolysosômicos dos macrófagos(Figura2H), complemente esta mistura de injeção com 200 μg/mL de um marcador fluorescente vermelho de phagosome s (ver Tabela de Materiais) e 100 nM de um marcador fluorescente muito vermelho de lisosomos (ver Tabela de Materiais) para marcar phagossomos30,31 e lisosomos32, respectivamente. - Monte a agulha em um micromanipulador (ver Tabela de Materiais) conectado a um suporte magnético e um injetor de pressão (ver Tabela de Materiais). Posicione um estereótipo e coloque o injetor em uma duração de pulso de aproximadamente 50 ms e uma pressão de injeção de aproximadamente 40 psi.
- Corte a ponta da agulha de microinjeção com fórceps de ponta fina limpa para gerar uma abertura de aproximadamente 5 μm de diâmetro.
- Calibrar o volume a ser injetado injetando um bolus em uma gota de óleo mineral posicionado sobre as linhas de grade de um hemocímetro. Ajuste a duração do pulso e/ou a pressão de injeção até que o diâmetro do bolus cubra 2,5 das menores linhas de grade (isso corresponde a um volume de aproximadamente 1 nL).
- Injete cuidadosamente 1 nL da mistura de injeção liposome na ventrícula do cérebro traseiro de cada larva.
NOTA: Ao injetar no ventrículo do cérebro traseiro, tome cuidado para não penetrar muito longe (além do cérebro traseiro) pois isso pode interromper a vasculatura subjacente que leva a hemorragias. Ao injetar no venoso do seio, deve-se tomar cuidado para garantir que a ponta da agulha esteja apenas dentro do pericárdio e não penetrando na gema. - Após a injeção, transfira imediatamente as larvas injetadas de volta para a mídia E3 adicionando mídia E3 à placa de injeção e agitando suavemente as larvas da celulose de metila usando uma pipeta de transferência de plástico.
- Incubar as larvas a 28,5 °C (protegidas da luz) até a análise por imagens confocais vivas.
5. Análise de imagem e imagem confocal para confirmar a segmentação de macrófagos de liposomos
- Aqueça um banho de água a 50 °C.
- Larvas anestesas injetadas por liposina transferindo para um novo prato Perti contendo mídia E3 complementada com 0,003% PTU e 200 μg/mL Tricaine.
- Prepare o meio de montagem de imagens ao vivo dissolvendo 1% de baixa agarose de ponto de fusão nos meios de comunicação E3, complementado com 0,003% ptu, em um micro-ondas. Coloque no banho de água e uma vez que a solução tenha esfriado para 50 °C, adicione 200 μg/mL de Tricaine.
- Mantenha o meio de montagem no banho de água de 50 °C para evitar a polimerização prematura da agarose.
- Para visualizar a superfície dorsal do cérebro traseiro em um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão de água(Figura 2E),incorpore as larvas da seguinte forma: Encha um prato de cultura de 35 mm com o meio de montagem (a uma profundidade de aproximadamente 5 mm) e deixe-o polimerizar. Escavar uma pequena trincheira na agarose que é de tamanho suficiente para acomodar o saco de gema.
- Encha uma pipeta de transferência plástica com meio de montagem derretida, expulse uma pequena quantidade e use-a para coletar as larvas anestesiadas. Transfira imediatamente as larvas para o prato de cultura e oriente os sacos de gema, lateral ventral para baixo, para os buracos escavados, usando uma pá carregadeira microcapilar. Mantendá-los periodicamente nesta posição até que a agarose polimeriza. Sobreposição com mídia E3 complementada com 200 μg/mL Tricaine.
NOTA: Ao transferir e posicionar larvas, tome cuidado para não causar danos epiteliais e inflamação local que podem influenciar estudos imunológicos. Para posicionamento das larvas para imagem ao vivo a região do CHT (Figura 2J), montar como descrito acima, mas posicione as larvas dentro do orifício escavado lateralmente. - Ao fotografar um microscópio confocal invertido, incorpore as larvas, sem a cama agarose, diretamente no fundo de um prato inferior de vidro. Organize-os com superfície dorsal para baixo (ou lateralmente) e após a polimerização, cubra toda a superfície do prato com uma camada uniforme de meio de montagem. Uma vez polimerizada, adicione uma fina camada de mídia E3 complementada com 200 μg/mL de Tricaine.
- Para visualizar ao vivo o ventrículo de cérebro traseiro em um microscópio confocal, use as seguintes configurações: 512 x 512 pixels; 40 x 3 μm Z-stacks (estendendo-se da superfície dorsal-mais do cérebro traseiro); Objetivo de 20x; Zoom de 2,5x.
NOTA: Ao comparar intensidades de sinal entre amostras (por exemplo, ao fotografar a captação de liposomos com rótulo azul marina injetados dentro de linhas de repórter marcando macrófagos [Tg (mpeg1:EGFP)33] ou nêutrons [Tg(lyz:EGFP)34]), é essencial que as configurações a laser sejam mantidas as mesmas (por exemplo, diâmetro pinhole, tensão laser, deslocamento e ganho) para ajudar a garantir que quaisquer diferenças não sejam um artefato de configurações alteradas de aquisição de imagens. - Use software de análise de imagem 3D para quantificar a captação de macrófago ou neutrófilo de liposós rotulados por Marina Blue. Para quantificar o número de células contendo liposomos(Figura 2F) dentro de uma pilha Z, role através das seções Z individuais e conte o número de células individuais contendo liposós com rótulo sique a Marina Blue. Para quantificar a intensidade de fluorescência dos liposomos dentro das células (Figura 2G), desenhe uma região de interesse em torno de cada célula (nas dimensões X, Y e Z) para quantificar a intensidade total ou média de fluorescência da Marina Azul intracelular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A abordagem de hidratação de filmes finos descrita aqui para a preparação de liposomos fluorescentes que abrigam medicamentos é um método simples e econômico. Com o protocolo utilizado neste estudo, espera-se que os liposósicos sejam unilamellar23,24. O tamanho, o potencial zeta, a eficiência de carga e armadilha dos liposomos produzidos são resumidos na Tabela 1. O tamanho da partícula dos liposomos (antes e depois do carregamento da droga) são semelhantes (Tabela 1). A carga de superfície (potencial zeta) dos liposomos carregados de drogas é um pouco mais neutra quando comparada com os liposomos de controle, no entanto, todos eles são carregados negativamente, o que significa que isso não mudará significativamente seu padrão de biodistribuição.
A microinjeção de liposomos marina blue-labeled no ventrículo de cérebro traseiro resulta em rápida captação por macrófagos residentes que podem ser facilmente observados por microscopia confocal por 3 h após a injeção, quando injetados na linha de repórter transgênica de marcação de linha de linha de linha de linha de linha de macrófago Tg (mpeg1:EGFP)33 (Figura 2C,E-G). Isso contrasta com os neutrófilos (como marcado dentro da linha de repórteres Tg(lyz:EGFP) específica de neutrófilos) que raramente são observados contendo liposósinos intracelulares(Figura 2E-G). Dentro de macrófagos carregados de lipomas individuais, os liposós se acumulam dentro de compartimentos fagolysosômicos (Figura2H), o que é necessário para a degradação liposome e a posterior liberação de seu conteúdo medicamentoso no citoplasma35. Selecionar diferentes locais de microinjeção para parto labial pode impactar quais macrófagos residentes em tecido são direcionados. Como exemplos, a entrega no ventrículo de cérebro traseiro tem como alvo eficientemente macrófagos residentes em cérebros traseiros(Figura 2D,E),enquanto a microinjeção no venoso do seio pode entregar os liposomos aos macrófagos residentes em CHT através da circulação(Figura 2I,J).
A consideração do local da microinjeção para o parto liposome é importante ao usar essa técnica para interrogar a resposta do macrófago a um desafio imunológico, pois ajuda a garantir que os macrófagos particulares investigação estejam recebendo a droga. Usamos rotineiramente este protocolo para a entrega de liposós carregados de drogas no ventrículo do cérebro traseiro para avaliar o impacto dessas drogas na resposta do macrófago aos cristais de urate monossódico (MSU), igualmente injetados no compartimento do cérebro traseiro(Figura 3A). Como agente causative da inflamação aguda gouty, os cristais de MSU ativam macrófagos residentes em tecido para produzir mediadores pró-inflamatórios, incluindo Interleucina-1β (IL-1β) através de um processo dependente de espécies de oxigênio reativo mitocondrial (mROS)10,36,37,38. Estes macrófagos ativados então dirigem infiltração de neutrófilo, uma marca de inflamação aguda. A microinjeção de liposomos carregados com uma droga inibidora de mROS no ventrículo do cérebro traseiro pode suprimir significativamente a produção de mROS orientado sude cristais dentro de macrófagos residentes em hindbrain carregados de liposós(Figura 3B-D). Utilizando o protocolo aqui descrito, alcançamos uma eficiência de aprisionamento de 49,12 ± 0,17 %, o que resultou em uma formulação com concentração de medicamentos de 103,05 ± 0,36 μM. Note-se, injetar um volume de 1 nL nesta concentração não resultou em nenhuma toxicidade observável durante nossos experimentos, como evidenciado por alterações morfológicas brutas ou parada cardíaca. Uma validação adicional dos efeitos supressivos desta droga no estado de ativação do macrófago pode ser realizada investigando a expressão il1b (o ortologde zebrafish de IL-1β) por toda a montagem na hibridização situ(Figura 4A,B) e o recrutamento temporal de neutrófilos (Figura 4C,D).
Figura 1: Esquema ilustrando o parto convencional de drogas gratuitas versus entrega de drogas mediadas por liposom a zebrafish larval. (A) Estratégias rotineiramente utilizadas para o parto de drogas para zebrafish larval são em grande parte limitadas à imersão ou microinjeção de drogas gratuitas. (B)A microinjeção de liposós carregados de drogas permite direcionar diretamente para macrófagos, onde a degradação liposomea dentro dos compartimentos fagolíssômicos resulta na entrega de medicamentos citoplasmáticos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Direcionar drogas para macrófagos usando liposós fluorescentes. (A)Configuração de microinjeção mostrando agulha de microinjeção (seta preta) e larvas dispostas em um prato de cultura de tecido de 35 mm dentro de 3% de metilcelulose. (B) Visão ampliada das larvas matrizadas como em A.(C) Imagem confocal ao vivo de larvas de 2 dpf Tg (mpeg1:EGFP), anterior à esquerda. (D) Visão ampliada das larvas matrizas, como em A, demonstrando microinjeção no ventrículo do cérebro traseiro (pontas de seta preta agulha de microinjeção). (E) Ilustração esquemática ilustrando alvo de macrófagos residentes em hindbrain e imagens confocais vivas (vistas dorsais, anteriores à esquerda) da região do cérebro traseiro de Tg (mpeg1:EGFP) e larvas Tg (lyz:EGFP), 3h após microinjeção de liposomos com rótulo símulo Marina Blue (flechas brancas marcam macrophage carregado de liposomônimo). (F e G) Quantificação da captação liposome por macrófagos e neutrófilos (conforme detectado em E), medida como o número de células contendo(F)e a intensidade/célula de fluorescência(G)de liposós rotulados por Marina Blue. (H) Imagem confocal ao vivo de macrófago carregado de liposós dentro do cérebro traseiro marcado com um marcador fluorescente vermelho de phagossomos e um marcador fluorescente vermelho de lisóis dentro das larvas Tg (mpeg1:EGFP), 3h após microinjeção de liposomos com rótulo sícronos marina blue. (I) Visão ampliada das larvas matrizas, como em A, demonstrando microinjeção no venoso do seio (pontas de seta preta agulha de microinjeção). (J) Ilustração esquemática ilustrando as larvas de macrófagos residentes em CHT e imagens confocais ao vivo (vistas laterais, anteriores à esquerda) da região cht de Tg(mpeg1:EGFP) e tg (lyz:EGFP) larvas, 3h após microinjeção de liposomos marina blue rotulados no sinus venoso (setas brancas marcam macrófagos carregados de liposomo). Exibição de barras de erro média ± SD. *p<0,05; p < 0,0001, teste tdo aluno. Barras de escala = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D e Eu), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J). Esse número foi modificado a partir da publicação anterior24. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Microinjeção de liposomos carregados com uma droga inibidora de mROS suprime a produção de mROS dentro de macrófagos ativados. (A)Esquemática ilustrando o direcionamento de uma droga inibidora de mROS para macrófagos e avaliando seu impacto na ativação do macrófago após estimulação de cristal mSU. (B e C) Imagens confocais ao vivo de macrófagos carregados de liposós (controle liposomes/L-C (B) ou liposomos inibidores do mROS/L-MI(C))dentro do cérebro traseiro da larva Tg (mpeg1:EGFP), também marcado com uma sonda fluorescente específica do mROS (ver Tabela de Materiais, onde o sinal fluorescente é exibido como um mapa de calor com cores quentes representando níveis mais altos de mROS), 3h após microinjeção de liposomos com rótulos de Marina Blue e cristais MSU. A fluorescência Marina Blue é pseudo-colorida em escala cinza. (D) Quantificação da intensidade de fluorescência da sonda específica do MROS dentro dos macrófagos, conforme detectado em barras de erro B e C. As barras de erro exibem média ± SD. ****p < 0,0001, teste tdo aluno. Barra de escala = 10 μm (B). Esse número foi modificado a partir da publicação anterior24. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Microinjeção de liposomos carregados com um inibidor mROS suprime a expressão il1b dentro de macrófagos ativados e recrutamento de neutrófilos orientados por macrófagos. (A) Expressão do il1b (marcada por flechas pretas), detectada por toda a montagem na hibridização situ, dentro da região do cérebro traseiro 3 h após microinjeção de controle do cérebro traseiro (L-C) ou liposomos inibidores de mROS (L-MI) e cristais MSU, anteriores à esquerda. Os números representam proporção de larvas com fenótipos exibidos. (B)Quantificação da expressão il1b, detectada em A, mostrada como por cento larvas demonstrando alta, baixa ou nenhuma expressão. (C) Imagens confocais de neutrófilos dentro da região do cérebro traseiro das larvas Tg (lyz:EGFP) (vistas dorsal, anteriores à esquerda), detectadas pela imunofluorescência 3 (3 cvi) e 6 (6 hpi) h após microinjeção de l-C ou L-MI e MSU. (D) Quantificação temporal de neutrófilos, conforme detectado em C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) e 9 (9 hpi) h após microinjeção traseira de cristais L-C ou L-MI e MSU. As barras de erro exibem média ± SD. ****p < 0,0001, n.s. não significativa, One-way ANOVA, teste pós-hoc da Dunnett. Barras de escala = 100 μm (A), 50 μm (C). Esse número foi modificado a partir da publicação anterior24. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
| Propriedade físicoquímica de liposomos (L) | Controle liposós | liposós inibidores de mROS |
| Tamanho (μm) | 1,2 ± 0,07 | 1,1 ± 0,04 |
| Potencial zeta (mV) | -25,9 ± 0,57 | -13,0 ± 0,11 |
| Eficiência de armadilha (EE, %) | N/A | 49,12 ± 0,17 |
| Carregamento de drogas (DL, %) | N/A | 0,37 ± <0,01 |
Tabela 1: Características físico-químicas de PBS (controle) ou liposomos inibidores de mROS (os dados são significa ± desvio padrão, n = 3). Todos os liposós foram rotulados com Marina Blue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para formular liposós carregados de drogas para atingir especificamente macrófagos em zebrafish larval. Este método pode ser usado para dissecar o papel dos macrófagos em certos modelos da doença, garantindo a entrega direta direcionada de medicamentos especificamente aos macrófagos. Além disso, pode ser usado quando a toxicidade geral das drogas limita seu uso quando entregue por rotas mais convencionais, como a imersão. O protocolo descrito aqui fornece uma alternativa a outros sistemas de nanopartículas que têm sido usados para atingir células imunes inatas em zebrafish larval. Estes incluem direcionar a rifampicina antimalárica para macrófagos infectados por Mycobacterium marinumpara promover a liberação bacteriana usando nanopartículas poliméricas de tamanho submicron39. Em outro exemplo, o encapsulamento de (R)-roscovitina, um indutor de apoptose de nêutrons, dentro de polímerossomos tem sido mostrado como alvo desta droga para neutrófilos, promovendo assim a resolução de inflamação40. Neste protocolo, usamos liposomos como veículo para entrega de drogas devido às suas propriedades não tóxicas, biocompatíveis e biodegradáveis. Além disso, são não imunogênicos, o que é de particular importância quando usados para investigar respostas imunológicas, como as descritas aqui. Uma gama de cargas também pode ser transportada, incluindo drogas hidrofoficas, hidrofóbicas, anfáticas e lipofônicas.
Ao realizar este protocolo, há uma série de passos críticos onde devem ser tomados cuidados especiais. Estes incluem etapas onde as larvas são manuseadas fisicamente e devem ser tomadas cuidados para minimizar qualquer dano não intencional às larvas. Isso inclui ao deter manualmente as larvas (especialmente evitando o contato com o delicado revestimento epitelial da gema), amatriz de larvas na placa de injeção, sua remoção da placa após injeções e sua montagem para imagens confocais ao vivo. Um componente inevitável deste protocolo é a necessidade de entregar os liposomos (e quaisquer desafios imunológicos) através da microinjeção que podem causar inflamação local e, portanto, podem influenciar o resultado experimental. A microinjeção em zebrafish larval requer um certo grau de treinamento para minimizar danos teciduais. Em nosso trabalho, gerar uma ponta de agulha de microinjeção de aproximadamente 5 μm gera danos epiteliais superficiais muito pequenos (como evidenciado pela expressão muito baixa da matriz de marcadores inflamatórios metallopeptidase 9 dentro de células epiteliais superficiais nas proximidades da ferida de microinjeção10) ao injetar no ventrículo retrocerebral de 2 larvas de dpf. Esta ponta de diâmetro também é pequena o suficiente para evitar vazamento de conteúdo injetado, fora do ventrículo do cérebro traseiro, quando a agulha de microinjeção é removida. É importante notar aqui que volumes de injeção superiores a 2 nL muitas vezes resultarão em alguns dos conteúdos injetados transbordando através do orifício de injeção como resultado de exceder o volume do ventrículo. Um diâmetro de ponta de 5 μm também é de tamanho suficiente para injetar desafios imunológicos subsequentes, como cristais MSU10. A repartindo a ponta da agulha de microinjeção para 45° com um micromodor de modo a gerar uma ponta afiada pode proporcionar uma melhor penetração do periderm exterior e camadas epiteliais basais internas cobrindo o ventrículo de cérebro traseiro41. É importante notar que injeções de controle como as usadas aqui (ou seja, controle liposós) são essenciais na avaliação dos efeitos dos liposomos carregados de drogas na função macrófago para controlar o próprio processo de injeção. Selecionar uma concentração para uma determinada droga ao formular liposomos também é um passo importante, pois concentrações de medicamentos eficazes estabelecidas, quando entregues por imersão, podem diferir das necessárias ao usar o parto de medicamentos mediados por liposós. Além disso, ao utilizar este protocolo, deve-se ter cuidado para não alterar as características físico-químicas dos liposomos pós modificação com poloxamer, pois isso pode afetar seu padrão de biodistribuição.
Uma área de modificação e desenvolvimento futuro deste protocolo será investigar a incorporação de diferentes características superficiais aos liposomos, como ligands ou receptores para melhorar ainda mais a segmentação e a captação de macrófagos, ou para atingir diferentes células imunes, como neutrófilos. Esta abordagem avançada exigirá mais estudos para descobrir características superficiais que são exclusivas dos diferentes compartimentos de células imunes zebrafish, que atualmente são mal compreendidos. Outras áreas para modificação deste protocolo incluem a incorporação de outras sondas fluorescentes nos liposomos para expandir sua versatilidade (por exemplo, quando injetado em outras linhas de repórter transgênicas) e alterar suas propriedades físicas desse tamanho e carga42,43. Também será importante examinar se diferentes rotas de administração liposome em diferentes estágios larvais podem expandir sua versatilidade para atingir populações adicionais de macrófagos, por exemplo, células epiteliais intestinais. No protocolo aqui detalhado, todas as injeções foram realizadas em 2 larvas dpf. Durante o terceiro dia de desenvolvimento de zebrafish um único lúmen contínuo da boca para as formas de ânus, após a abertura da boca44. No dia seguinte, o ânus abre resultando em um tubo completamente aberto forrado com um epitélio polarizado44. Será interessante ver se a imersão de larvas mais antigas em liposomos pode facilitar o direcionamento de drogas encapsuladas para células epiteliais intestinais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios concedidos à C.J.H. (Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia e Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) e Z.W. (Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa da Faculdade da Universidade de Auckland). Os autores agradecem a Alhad Mahagaonkar pela gestão especializada da instalação de zebrafish, a Unidade de Pesquisa em Imagens Biomédicas, a Escola de Ciências Médicas da Universidade de Auckland por assistência com imagens confocais e Graham Lieschke por presentear a linha de repórteres Tg(mpeg1:EGFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
