Summary
هنا ، نصف تركيب الليبوزومات المحملة بالأدوية وحقنها المجهري في سمك حمار وحشي اليرقات لغرض استهداف إيصال الدواء إلى خلايا النسب الضامة.
Abstract
وقد تطورت اليرقات حمار وحشي(Danio rerio)إلى نموذج شعبي للتحقيق في تفاعلات الممرض المضيف ومساهمة الخلايا المناعية الفطرية في الأمراض الالتهابية بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظة وظيفيا. كما أنها تستخدم على نطاق واسع لدراسة كيفية تساعد الخلايا المناعية الفطرية في توجيه عمليات النمو. من خلال الاستفادة من الشفافية البصرية وقابلية الوراثة لسمك اليرقان، تركز هذه الدراسات في كثير من الأحيان على أساليب التصوير الحي لتوصيف الكلمة والالعدلات الموسومة بشكل وظيفي داخل الحيوانات السليمة. ونظراً لتغايريتها الوظيفية المتنوعة وأدوارها المتزايدة باستمرار في الإمراض المرضي، فقد حظيت الضامة باهتمام كبير. بالإضافة إلى التلاعب الجيني، تستخدم التدخلات الكيميائية الآن بشكل روتيني للتلاعب ودراسة سلوك الضامة في سمك الحمار الوحشي اليرقات. يقتصر تسليم هذه الأدوية عادة على الاستهداف السلبي للدواء المجاني من خلال الغمر المباشر أو الحقن المجهري. تعتمد هذه الأساليب على افتراض أن أي تغييرات في سلوك الضامة هي نتيجة لتأثير مباشر للدواء على الضامة نفسها ، وليس نتيجة المصب للتأثير المباشر على نوع خلية أخرى. هنا ، نقدم بروتوكولاتنا لاستهداف الأدوية على وجه التحديد لالضهاض حمار وحشي اليرقات عن طريق حقن المواد الفلورية المحملة بالأدوية. نكشف أن poloxamer 188 معدلة المخدرات محملة الدهون الزرقاء الفلورسنت يتم تناولها بسهولة من قبل الضامة، وليس من قبل العدلات. كما نقدم أدلة على أن الأدوية التي يتم تسليمها بهذه الطريقة يمكن أن تؤثر على نشاط الضامة بطريقة تتسق مع آلية عمل الدواء. وستكون هذه التقنية ذات قيمة للباحثين الراغبين في ضمان استهداف الأدوية للضامة وعندما تكون الأدوية سامة للغاية بحيث لا يمكن تسليمها بالطرق التقليدية مثل الغمر.
Introduction
يوفر نظام البلعوم أحادي النواة خط دفاع أول ضد مسببات الأمراض الغازية. يتكون هذا النظام من الخلايا الأحادية والخلايا التشجرات المشتقة من الأحادية والضامة ، والتي تقوم بنشاط ببلع مسببات الأمراض الأجنبية ، وبالتالي الحد من انتشار مسببات الأمراض. بالإضافة إلى هذه وظائف المنفطي ة وmicrobicidal effector ، والخلايا التشجرة والضامة هي أيضا قادرة على إنتاج السيتوكين ومستضد العرض لتنشيط نظام المناعة التكيفي1. من هذه الخلايا ، تلقت الضامة اهتمامًا خاصًا نظرًا لتغايريتها الوظيفية المتنوعة ومشاركتها في أمراض التهابية متعددة ، من المناعة الذاتية والأمراض المعدية إلى السرطان2،3،4،5،6. إن لدونة الضامة وقدرتها على التكيف وظيفياً مع الاحتياجات إلى بيئة الأنسجة الخاصة بها تتطلب اتباع نهج تجريبية لمراقبة هذه الخلايا واستجوابها مباشرة في الجسم الحي.
حمار وحشي اليرقات هي كائن مثالي نموذجي لدراسة وظيفة واللدونة من الضامة في الجسم الحي8. توفر الشفافية البصرية لسمك الحمار الوحشي اليرقاني نافذة لمراقبة سلوك الضامة مباشرة ، خاصة عندما تقترن بخطوط المراسل المعدلة وراثياً التي تميز الضامة. وقد أدى استغلال إمكانات التصوير الحي وtractability التجريبية من حمار وحشي اليرقات إلى العديد من الأفكار الهامة في وظيفة الضامة التي لها صلة مباشرة بمرض الإنسان9،10،11،12،13،14،15. وقد استفادت العديد من هذه الدراسات أيضا من الحفاظ على ارتفاع نشاط المخدرات في حمار وحشي (السمة التي تدعم استخدامها كمنصة اكتشاف المخدرات الحيوانية كله16،17،18)، من خلال استخدام التدخلات الكيميائية للتلاعب الدوائي وظيفة الضامة. حتى الآن ، تم تسليم هذه العلاجات الدوائية في الغالب إما عن طريق الغمر ، مما يتطلب أن يكون الدواء قابلًا للذوبان في الماء ، أو عن طريق الحقن المجهري المباشر للدواء المجاني(الشكل 1A). وتشمل القيود المفروضة على استراتيجيات التسليم السلبية هذه الآثار غير المستهدفة والسمية العامة التي قد تحول دون تقييم أي تأثير على وظيفة الضامة. بالإضافة إلى ذلك ، عند التحقيق في آثار المخدرات على الضامة ، من غير المعروف ما إذا كانت الأدوية تعمل على الضامة نفسها أو من خلال آليات غير مباشرة. عند إجراء دراسات تدخل كيميائي مماثلة للتحقيق في وظيفة الضامة، أدركنا أن هناك حاجة غير ملباة لتطوير طريقة إيصال غير مكلفة ومباشرة لاستهداف الأدوية على وجه التحديد إلى الضامة.
الليبوزومات هي مجهرية، متوافقة بيولوجيا، الحويصلات ثنائية الطبقات الدهون التي يمكن أن تغلف البروتينات والنيوكليوتيدات والبضائع المخدرات19. يشكل هيكل أحادي اللاميلار أو متعدد اللاميلار من الدهون ثنائية الطبقة من الليبوزومات تجويفًا داخليًا مائيًا حيث يمكن دمج الأدوية القابلة للذوبان في الماء بينما يمكن دمج الأدوية الكارهة للماء في أغشية الدهون. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب بالخصائص الفيزيائية الكيميائية للدهون ، بما في ذلك الحجم والشحن والتعديلات السطحية لتفصيل استهدافها لخلايا محددة20،21. وقد جعلت هذه الميزات من الليبوزومات لهم وسيلة جذابة لتقديم الأدوية وتعزيز دقة نظم العلاج الحالية20. كما هي phagocytozed الليبوزومات بطبيعة الحال من قبل الضامة (ميزة استغلالها من قبل استخدامها الروتيني في تقديم كلودروناتي خصيصا لmacrophages لتجارب الاستئصال22),أنها تقدم كخيار جذاب لتسليم المخدرات الضامة محددة(الشكل 1B).
يصف هذا البروتوكول صياغة الأدوية إلى الليبوزومات الفلورية الزرقاء المغلفة بالبوليمر المائي poloxamer 188 ، التي تشكل طبقة واقية على سطح liposome وقد ثبت أنها تعزز الاحتفاظ بالأدوية ولها توافق حيوي فائق23. تم اختيار Poloxamer لطلاء سطح الليبوزومات كما أظهرت أبحاثنا السابقة أنه ، بالمقارنة مع الليبوزومات المعدلة من البولي إيثيلين ، أظهرت الليبوزومات المعدلة بولوكعامين توافقًا حيويًا أفضل بعد حقن الكفوف تحت الجلد من الكفوف الفئران والعقاقير المماثلة في الأرانب بعد التسريب الوريدي23. كما يتم وصف البروتوكولات للحقن المجهري في حمار وحشي اليرقات والتصوير الحي لتقييم قدرتها على استهداف الضامة وتوطينها إلى المقصورات داخل الخلايا اللازمة لتدهور الدهون وإيصال الأدوية السيتوبلازمية. كدليل على مفهوم استخدمنا سابقا هذه التقنية لاستهداف اثنين من الأدوية إلى الضامة لقمع تفعيلها في نموذج حمار وحشي اليرقات من التهاب النقرس الحاد24. هذه التقنية تسليم المخدرات يوسع "مجموعة الأدوات" الكيميائية المتاحة للباحثين حمار وحشي الراغبين في ضمان الضامة المستهدفة من الأدوية ذات الأهمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المخدرات المحملة مارينا الأزرق المسمى Liposomes
ملاحظة: يتم إعداد الليبوزومات التي تحمل صبغة الفلورسنت الزرقاء، مارينا بلو والمخدرات باستخدام طريقة ترطيب فيلم رقيقة مع إدخال آخر من poloxamer 188. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. مراقبة الليبوزومات تحمل فقط مارينا الأزرق وبرنامج تلفزيوني. يصف المثال هنا تحميل الليبوزومات بدواء مضاد للأكسدة يستهدف الميتوكوندريا25 يستخدم في النتائج التمثيلية كدليل على المفهوم.
- لإعداد الليبوزومات، حل 16.4 ملغ (22.2 ميكرومول) من الفوسفوليبيدات 1،2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (انظر جدول المواد)،4.3 ملغ (11.1 ميكرومول) الكوليسترول (انظر جدول المواد)و 2.8 ملغ (3.7 ميكرومول) 1,2-ديسيتريول-sn-glycero-3-phosphocholine (انظر جدول المواد, في 3 مل من الكلوروفورم: الميثانول (3:1 v/v) في قارورة 25 مل في القاع.
- إلى الخليط أعلاه، إضافة 31 نانومول من مارينا الأزرق 1،2-dihexadecanoyl-sn-glycero-فوسفوإيثانولامين (انظر جدول المواد)و 300 nmol من المخدرات تثبيط mROS (انظر جدول المواد)وسونيكات لفترة وجيزة لتذوب تماما. للسيطرة على الدهون، فقط إضافة مارينا الأزرق 1،2-dihexadecanoyl-sn-غليسيرو-فوسفوإيثانولامين.
ملاحظة: لتجنب التبييض الضوئي لصبغة الفلورسنت مارينا بلو الحساسة للضوء، قم بحماية جميع الإجراءات من الضوء، حيثما أمكن. وهذا مهم أيضا إذا كان الدواء الذي سيتم تحميله حساسة للضوء. - إزالة المذيبات ببطء على المبخر الدوارة (انظر جدول المواد)على حمام الماء درجة الحرارة التي تسيطر عليها تعيين إلى 45 درجة مئوية عن طريق الدوران في 75 دورة في الدقيقة تحت ضغط فراغ (200 مبار لمدة 15 دقيقة ثم 0 مبار لمدة 20 دقيقة). هذا يشكل طبقة الدهون رقيقة جافة داخل الجدران الزجاجية للقارورة التي يتم تجفيفها لمدة 45 دقيقة تحت N2 لتسهيل الإزالة الكاملة للمذيبات العضوية.
- بعد تشكيل رقيقة، تعيين الضغط فراغ إلى 40 مبار لمدة 15 دقيقة، ثم تطهير مع غاز النيتروجين لمدة 30 دقيقة لضمان إزالة بقايا المذيبات.
- هيدرات رقيقة باستخدام 1 مل من الفوسفات العازلة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) وختم مع البارافيلم قبل تحريك قارورة باستخدام المبخر الدوارة على حمام الماء 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة من أجل تشكيل الحويصلات.
- تخضع تعليق رطب إلى 7 دورات من التجميد وذوبان عن طريق التجميد في السائل N2 لمدة 3 دقيقة تليها الغمر في حمام الماء 45 درجة مئوية لمدة 7 دقيقة.
- تقذف الدهون من خلال غشاء باستخدام الطارد مصغرة (انظر جدول المواد)و 1.0 ميكرومتر المسار المحفور ة أغشية البولي كربونات (انظر جدول المواد)لدورات 2-6 من أجل الحصول على الحويصلات unilamellar كبيرة.
ملاحظة: من أجل تحقيق استهداف أكثر ملاءمة نحو الضامة ، تلاعب بدورات البثق حتى يبلغ قطر الليبوزومات حوالي 1 ميكرومتر26،27،28. - تكثيف الليبوزومات الطازجة في بيليه عن طريق التضاريس في 186،000 ز واحتضان مع 1 مل من 1٪ poloxamer 188 (انظر جدول المواد)حل (10 ملغ / مل في PBS) في 45 درجة مئوية و 750 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة باستخدام thermomixer مع 2 مل مرفق أنبوب الطرد المركزي الدقيقة (انظر جدول المواد).
- Ultracentrifuge الخليط في 186،000 ز لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant من أجل إزالة أي بوليمر غير منضم أو المخدرات. تخزين الكريات الليبوزوبة في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.
2. توصيف حجم Liposome وZeta المحتملة
- تمييع تركيبة الدهون مع الماء فائق النقاء (1:100) وقياس حجم الجسيمات ومؤشر تعدد التشتت (PDI) وإمكانات زيتا للدهون باستخدام محلل تشتت الضوء الديناميكي (انظر جدول المواد)، في ثلاثية عند 25 درجة مئوية.
ملاحظة: PDI هو مقياس لتوزيع حجم مجموعة الجسيمات النانوية. تشير قيم PDI < 0.05 إلى توزيع أكثر توحيدًا بينما تشير القيم الأقرب إلى 1 إلى توزيع حجم أكبر. زيتا المحتملة هو الشحنة السطحية الشاملة.
3. حساب كفاءة الفخ وتحميل المخدرات في الليبوزومات
ملاحظة: لتحديد كفاءة الفخ للدواء في الليبوزومات ، يتم قياس محتوى الدواء الموجود في الكريات الخارقة والدهنية.
- إعادة تعليق بيليه الدهنية في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- قم بإزالة الـ supernatant، وتمييع 10 x بالماء فائق النقاء وتحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC).
- لتحديد تركيز الدواء داخل الليبوزومات، أضف 100 ميكرولتر من التعليق الدهني إلى 900 ميكرولتر من محلول 10٪ تريتون-X100 (لتدمير غشاء الدهون، وإطلاق الدواء المحاصر ومنع تراكم الدهون داخل عمود HPLC) والدوامة لمدة 3 دقيقة قبل التحليل.
- حقن 20 ميكرولتر من العينة في نظام HPLC يتكون من مضخة رباعية، وتقويم للنتائج التلقائية وعمود 3 ميكرومتر 250 × 4.6 ملم. تعيين المرحلة المتنقلة (10 mM PBS pH 2.5، الأسيتونتريل والميثانول (30:40:30، v/v/v)) معدل التدفق إلى 0.9 مل/دقيقة والحصول على التشكيلات الطيفية باستخدام كاشف صفيف ثنائي تعيين في 230 mM.
- حساب كفاءة الفخ (EE) وتحميل الدواء (DL) باستخدام المعادلات التالية:
EE (٪ = [لي / جبل] × 100
DL (٪ = [لي / مليب] × 100
حيث لي هو كتلة من المخدرات مغلفة، جبل هو الكتلة الإجمالية للدواء المستخدمة أثناء صياغة ومليب هو الكتلة الإجمالية للدهون (بما في ذلك الكوليسترول) والدواء مغلفة.
4. إعداد وحقن الليبوزومات
- إعداد إبر الحقن المجهري borosilicate عن طريق إدراج جدار رقيقة borosilicate الزجاج الشعري (1 ملم O.D. × 0.78 ملم هوي ّة × 10 سم طول) في جهاز السُلّح المجهري (انظر جدول المواد)مع إعدادات السُلّب العام التالي (حرارة 680، سحب 75، سرعة 40، وقت 55 وضغط 530) لإنتاج إبرة حقن مجهرية مدببة.
- وضع الإبر في طبق بيتري على الطين النمذجة وترتيب بطريقة أن نهاية سحبت لا تلمس الجزء السفلي من الطبق. حافظ على غطاء طبق بيتري مغلقًا لتجنب تلوث الغبار حتى يصبح جاهزًا للاستخدام.
- تمييع تركيبات الدهون الطازجة 1:1 في PBS المعقم (درجة الحموضة 7.4) والدوامة لفترة وجيزة (2-3 s) لخلط.
ملاحظة: حماية الليبوزومات من الضوء حتى تصبح اليرقات جاهزة للحقن المجهري. - إعداد أزواج تربية حمار وحشي الكبار في الليلة السابقة وجمع الأجنة كما وصفها سابقا روزين وآخرون29.
- نقل الأجنة إلى طبق بيتري (100 مم × 20 ملم نمط مع ما يقرب من 60 أجنة لكل طبق) تحتوي على E3 المتوسطة (5 MM NaCl، 0.17 mM KCl، 0.33 mM CaCl2،0.33 mM MgSO4)تستكمل مع 0.1٪ الميثيلين الأزرق لمنع النمو الفطري. إزالة جميع الأجنة الميتة أو غير المخصبة واحتضان بين عشية وضحاها في 28.5 درجة مئوية.
- لتسهيل التصوير الحي، أضف 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) إلى وسائط E3 عندما تصل الأجنة إلى 24 ساعة من التطور لمنع تكوين الصباغ (الميلانات).
- dechorionate يدويا الأجنة في ما يقرب من 30 ساعة بعد الإخصاب (hpf) باستخدام ملقط تلميح غرامة.
ملاحظة: لا تستخدم العلاج الأنزيمي للأجنة dechorionate لأن هذا يمكن أن يسبب الضرر الظهارية والالتهاب المحلي وبالتالي التأثير على الدراسات المناعية - دع الأجنة تتطور عند 28.5 درجة مئوية حتى يومين بعد الإخصاب (dpf).
- إعداد لوحة حقن عن طريق صب ما يكفي 3٪ السليلوز الميثيل (في وسائل الإعلام E3) في غطاء طبق ثقافة صغيرة 35 ملم لتشكيل فيلم رقيقة تغطي السطح بأكمله.
ملاحظة: عند إعداد 3٪ من السليلوز الميثيل في وسائل الإعلام E3، فإنه يأخذ عدة أيام لالسليلوز الميثيل لتذوب مع الانفعالات لطيف على شاكر المداري. - تهوّن اليرقات عن طريق احتضانها في وسائط E3 المكملة بـ 200 ميكروغرام/مل من التريكين.
- جمع مجموعة من ما يقرب من 20-25 يرقة باستخدام ماصة نقل البلاستيك والسماح للأجنة للتركيز في غيض من ماصة عن طريق الجاذبية. مع الحرص على نقل اليرقات مع الحد الأدنى من السائل ، ووضعها في منتصف غطاء طبق الثقافة 35 ملم.
- باستخدام محمل microcapillary ، ترتيب اليرقات بالطرق التالية: الأمامي نحو الجزء العلوي من لوحة الحقن مع السطح الظهري التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري ، لحقن في البطين الخلفي(الشكل 2A -D)؛ أو، الأمامي نحو يسار لوحة الحقن (عند الحقن من اليمين) مع السطح البطني التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري لحقن في الوريد الجيوب الأنفية(الشكل 2I).
ملاحظة: عند حقن هاتريك بوبهذه الطريقة، يمكن استهداف الضامة في الدماغ الخلفي المقيم(الشكل 2E)والأنسجة الهيماتوبوية (CHT) المقيمة(الشكل 2J)الضامة، على التوالي. منطقة CHT من حمار وحشي اليرقات هي موقع الهيماتوبوية مماثلة للكبد الجنينالثدييات. إيلاء اهتمام إضافي لعدم إتلاف الأجنة أثناء الترتيب لأن هذا قد يسبب التهابموضعي وبالتالي التأثير على الدراسات المناعية. - تناول الليبوزومات الطازجة (من الخطوة 4.3) وإعادة ملء إبرة حقن بحوالي 5 ميكرولتر من مزيج الحقن الدهني باستخدام محمل ميكروالخمسيني (انظر جدول المواد).
ملاحظة: عند تقييم توطين الليبوزومات إلى مقصورات phagolysosomal من الضامة(الشكل 2H)،وتكملة هذا المزيج حقن مع 200 ميكروغرام/ مل من علامة الفلورسنت الحمراء من phagosomes (انظر جدول المواد)و 100 نانومتر من علامة الفلورسنت الحمراء البعيدة من الليسوسوسوم (انظر جدول المواد)لوضع علامة phagosomes30،31 وlysosomes32على التوالي. - قم بتركيب الإبرة في متلاعبين (انظر جدول المواد)متصلة بحامل مغناطيسي ومحاقن ضغط (انظر جدول المواد). وضع تحت المجهر الستيريوسكوب وتعيين حاقن إلى مدة نبض ما يقرب من 50 مللي ثانية وضغط حقن من حوالي 40 psi.
- قطع غيض من إبرة الحقن المجهري مع ملقط تلميح غرامة نظيفة لتوليد فتحة من حوالي 5 ميكرومتر في القطر.
- معايرة حجم ليتم حقنها عن طريق حقن بولس في قطرة من النفط المعدني المتمركزة على خطوط الشبكة من مقياس الهيوكتومتر. ضبط مدة النبض و / أو ضغط الحقن حتى قطر البولس يغطي 2.5 من أصغر خطوط الشبكة (وهذا يتوافق مع حجم ما يقرب من 1 nL).
- حقن بعناية 1 nL من مزيج حقن الليبوسوم في البطين الخلفي لكل اليرقات.
ملاحظة: عند الحقن في البطين الخلفي، والحرص على عدم اختراق البطين بعيدا جدا (وراء الدماغ الخلفي) لأن هذا يمكن أن تعطل الأوعية الدموية الكامنة مما يؤدي إلى نزيف. عند الحقن في الوريد الجيوب الأنفية ، يجب توخي الحذر لضمان أن يكون طرف الإبرة داخل التامور فقط وليس اختراق الصفار. - بعد الحقن ، قم على الفور بنقل اليرقات المحقونة مرة أخرى إلى وسائط E3 عن طريق إضافة وسائط E3 إلى لوحة الحقن وتحريك اليرقات بلطف من السليلوز الميثيل باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
- احتضان اليرقات عند 28.5 درجة مئوية (محمية من الضوء) حتى التحليل عن طريق التصوير الملتحم ة الحي.
5. التصوير التكوّر وتحليل الصور لتأكيد استهداف الضامة من الليبوزومات
- سخني حمامًا مائيًا إلى 50 درجة مئوية.
- تحقن اليرقات المحقونة بالشحم عن طريق نقلها إلى طبق Perti جديد يحتوي على وسائط E3 مكمّلة بنسبة 0.003% PTU و200 ميكروغرام/مل Tricaine.
- إعداد التصوير الحي تصاعد المتوسطة عن طريق إذابة 1٪ أغروس نقطة انصهار منخفضة في وسائل الإعلام E3، تستكمل مع PTU 0.003٪، في الميكروويف. ضع في حمام الماء وبمجرد أن يبرد المحلول إلى 50 درجة مئوية ، أضف 200 ميكروغرام / مل من Tricaine.
- الحفاظ على الوسط المتصاعد في حمام الماء 50 درجة مئوية لمنع البلمرة المبكرة من أغاروز.
- لتصوير السطح الظهري للدماغ الخلفي على مجهر بؤري مجهز بعدسة غمر مائية(الشكل 2E)، قم بتضمين اليرقات على النحو التالي: ملء طبق ثقافة 35 مم مع الوسط المتصاعد (إلى عمق 5 مم تقريبًا) والسماح له بالبلمرة. حفر خندق صغير في أغاروز التي هي من حجم كاف لاستيعاب كيس صفار.
- ملء ماصة نقل البلاستيك مع وسط تصاعد المنصهر ، وطرد كمية صغيرة ، واستخدامها لجمع اليرقات المنهوبة. نقل اليرقات على الفور إلى طبق الثقافة وتوجيه الكيس اتصفار، الجانب البطني إلى أسفل، في الثقوب المحفورة، وذلك باستخدام محمل microcapillary. الحفاظ عليها دوريا في هذا الموقف حتى يبلمر agarose. تراكب مع وسائل الإعلام E3 تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل Tricaine.
ملاحظة: عند نقل اليرقات وتحديد موضعها ، يجب الحرص على عدم التسبب في تلف ظهاري والتهاب موضعي يمكن أن يؤثر على الدراسات المناعية. لتحديد المواقع من اليرقات ليعيش صورة منطقة CHT(الشكل 2J)،جبل كما هو موضح أعلاه، ولكن وضع اليرقات داخل حفرة محفورة بشكل لاحق. - عند التصوير على مجهر مقلوب ، قم بتضمين اليرقات ، دون سرير agarose ، مباشرة على الجزء السفلي من طبق قاع زجاجي. ترتيبها سطح الظهرية إلى أسفل (أو بشكل طولي) وبعد البلمرة، وتغطية سطح الطبق بأكمله مع طبقة متساوية من وسط تصاعد. مرة واحدة ببلمرة، إضافة طبقة رقيقة من وسائل الإعلام E3 تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل من Tricaine.
- ليعيش صورة البطين الخلفي على المجهر البؤري، استخدم الإعدادات التالية: 512 × 512 بكسل؛ 40 × 3 ميكرومتر ز مداخن (تمتد من الجزء الخلفي من الظهر من الدماغ الخلفي)؛ هدف 20x؛ 2.5x التكبير.
ملاحظة: عند مقارنة كثافة الإشارة بين العينات (على سبيل المثال عند تصوير تناول الليبوزومات المسماة بالأزرق مارينا حقنها داخل خطوط المراسل ة التي تشير إما إلى الضامة[Tg1:EGFP)33]أو العدلات [Tg (lyz:EGFP)34])،من الضروري أن يتم الاحتفاظ بإعدادات الليزر كما هي (على سبيل المثال، قطر الثقب، والجهد الليزر، والإزاحة وكسب) للمساعدة في ضمان أي اختلافات ليست قطعة أثرية من إعدادات اقتناء الصورة المتغيرة. - استخدم برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد لقياس الكلمة أو تناول العدلات للدهون المسماة بـ Marina Blue. لتحديد عدد الخلايا التي تحتوي على الليبوزومات(الشكل 2F)داخل كومة Z، قم بالتمرير عبر الأقسام Z الفردية وعد عدد الخلايا الفردية التي تحتوي على الليبوزومات المسماة بـ Marina Blue. لتحديد كثافة الفلورسس من الليبوزومات داخل الخلايا(الشكل 2G)،رسم منطقة اهتمام حول كل خلية (في الأبعاد X و Y و Z) لتحديد إجمالي أو متوسط كثافة الفلورية من داخل الخلايا مارينا الأزرق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نهج الترطيب رقيقة فيلم وصفها هنا لإعداد الليبوزومات الفلورية التي أرفقت المخدرات هو وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. مع البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة، ومن المتوقع أن تكون الليبوزومات unilamellar23،24. ويلخص الجدول 1حجم وإمكانية زيتا وتحميل المخدرات وكفاءة الفخ للدهون المنتجة . حجم الجسيمات من الليبوزومات (قبل وبعد تحميل المخدرات) متشابهة(الجدول 1). تهمة السطح (زيتا المحتملة) من الليبوزومات المحملة بالمخدرات هو أكثر قليلا محايدة بالمقارنة مع الليبوزومات السيطرة، ومع ذلك، فهي كلها مشحونة سلبا وهذا لن يغير بشكل كبير نمط التوزيع الحيوي.
الحقن المجهري من الليا الأزرق المسمى الليبوزومات في البطين الخلفي النتائج في التعاطي السريع من قبل الضامة المقيمين التي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق المجهر confocal عن طريق حقن آخر 3 ح, عند حقنها في النسب الضامة وسم خط المراسل المعدلة وراثيا Tg (mpeg1:EGFP)33 (الشكل 2C, E-G). هذا هو على النقيض من العدلات (كما هو ملحوظ داخل العدلات محددة Tg (lyz:EGFP)34 مراسل الخط) التي نادرا ما لوحظ تحتوى على الليبوزومات داخل الخلايا(الشكل 2E-G). داخل الضامة المحملة بالدهون الفردية ، تتراكم الليبوزومات داخل مقصورات phagolysosomal(الشكل 2H)، وهو أمر ضروري لتدهور الدهون والإفراج اللاحق عن محتويات المخدرات الخاصة بهم في السيتوبلازم35. يمكن أن يؤثر اختيار مواقع الحقن المجهري المختلفة للتسليم الدهني على الكلمة المقيمة في الأنسجة المستهدفة. وكمثال على ذلك، فإن التسليم إلى البطين الخلفي يستهدف بكفاءة الضامة ذات الدماغ الخلفي(الشكل 2D,E)في حين أن الحقن المجهري في وينوس الجيوب الأنفية يمكن أن يسلم الليبوزومات إلى الضامة المقيمة في CHT عبر الدورة الدموية(الشكل 2I,J).
النظر في موقع الحقن المجهري للتسليم الدهني مهم عند استخدام هذه التقنية لاستجواب استجابة الضامة لتحدي مناعي لأنه يساعد على ضمان الضامة الخاصة تحت التحقيق يتلقون الدواء. لقد استخدمنا بشكل روتيني هذا البروتوكول لتسليم الليبوزومات المحملة بالأدوية في البطين الخلفي لتقييم تأثير هذه الأدوية على استجابة الضامة لبلورات يورات أحادية الصوديوم (MSU) ، تم حقنها بالمثل في مقصورة الدماغ الخلفي(الشكل 3A). كعامل مسبب لالتهاب النقرس الحاد ، تقوم بلورات MSU بتنشيط الضامة المقيمة للأنسجة لإنتاج وسطاء محترفين للالتهابات بما في ذلك Interleukin-1α (IL-1α) من خلال عملية تعتمد على أنواع الأكسجين التفاعلية الميتوكوندريا (mROS)10،36،37،38. هذه الضامة المنشطة ثم دفع تسلل العدلات، سمة مميزة لالتهاب النقرس الحاد. يمكن للحقن المجهري من الليبوزومات المحملة بدواء مثبط لـ mROS في البطين الخلفي كبح إنتاج MROS MSU البلوري ة بشكل كبير داخل الضامة المقيمة في الدماغ الخلفي المحملة بالدهون(الشكل 3B-D). باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، حققنا كفاءة في الفخ تبلغ 49.12 ± 0.17 ٪ ، مما أدى إلى تركيبة بتركيز دواء يبلغ 103.05 ± 0.36 ميكرومتر. وتجدر الإشارة إلى أن حقن حجم 1 nL في هذا التركيز أدى إلى عدم وجود سمية يمكن ملاحظتها خلال تجاربنا، كما يتضح من التغيرات المورفولوجية الجسيمة أو السكتة القلبية. ويمكن إجراء مزيد من التحقق من صحة الآثار القمعية لهذا الدواء على حالة تنشيط الضامة عن طريق التحقيق في التعبير il1b (تقويم العظام حمار وحشي من IL-1α) من قبل جبل كامل في التهجين الموقعي(الشكل 4A, B)والتوظيف الزمني للالعدلات(الشكل 4C, D).
الشكل 1: التخطيطي يوضح التسليم التقليدي المجاني للأدوية مقابل تسليم الأدوية بوساطة ليبوسوم إلى سمك اليرقات. (أ)تقتصر الاستراتيجيات المستخدمة بشكل روتيني لتوصيل المخدرات إلى سمك اليرقات إلى حد كبير على الانغماس في المخدرات المجانية أو الحقن المجهري لها. (ب)الحقن المجهري للدهون المحملة بالمخدرات يسمح بالاستهداف المباشر للضامة، حيث يؤدي تدهور الدهون داخل مقصورات الفياليسيوم في تسليم المخدرات السيتوبلازمية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استهداف الأدوية إلى الضامة باستخدام الليبوزومات الفلورية. (أ)إعداد الحقن المجهري تظهر إبرة الحقن المجهري (السهم الأسود) واليرقات المصفوفة في طبق زراعة الأنسجة 35 ملم داخل 3٪ ميثيلسيلولوسي. (B)عرض مكبر لليرقات المصفوفة كما هو الحال في A.(C)صورة بؤرية حية ليرقات 2 dpf Tg (mpeg1:EGFP) ، الأمامي إلى اليسار. (د)عرض مكبر لليرقات المصفوفة ، كما هو الحال في A ، مما يدل على الحقن المجهري في البطين الخلفي (السهم الأسود علامات إبرة الحقن المجهري). (E)التخطيطي توضيح استهداف الضامة المقيم ة في الدماغ الخلفي والصور المركّبة الحية (وجهات النظر الظهرية ، الأمامي إلى اليسار) من منطقة الدماغ الخلفي من Tg (mpeg1: EGFP) ويرقات Tg (lyz:EGFP) ، 3 h بعد الحقن المجهري لدماغ الخلفية من الليبوزومات المسماة بمارينا الأزرق (السهام البيضاء علامة الضفة المحملة بالدهون). (F و G)القياس الكمي للكمية الدهنية من قبل الضامة والالعدلات (كما تم اكتشافها في E) ، مقاسة على عدد الخلايا التي تحتوي على(F)وشدة الفلورية / الخلية(G)من الليبوزومات المسماة باللون الأزرق مارينا. (H)صورة حية من الكلفة المحملة بالدهون داخل الدماغ الخلفي ملحوظ مع علامة الفلورسنت الحمراء من phagosomes وعلامة الفلورسنت الحمراء البعيدة من الليسوسوماس داخل اليرقات Tg (mpeg1:EGFP) ، 3 ح بعد حقن الدماغ الخلفي المجهري من الليبوزومات المسماة بالأزرق مارينا. (I)عرض مكبر لليرقات المصفوفة ، كما هو الحال في A ، مما يدل على الحقن المجهري في الوريد الالجيوب الأنفي (السهم الأسود علامات إبرة الحقن المجهري). (J)التخطيطي توضيح استهداف الضامة CHT المقيم والصور الساكنة حية (وجهات النظر الجانبية، الأمامي إلى اليسار) من منطقة CHT من Tg (mpeg1:EGFP) وTg (lyz:EGFP) اليرقات، 3 ح بعد الحقن المجهري من الدهون التسمية الأزرق مارينا في الجيوب الأنفية (السهام البيضاء علامة الضفة الدهنية المحملة). عرض أشرطة الخطأ يعني ± SD. *ف< 0.05; ف < 0.0001، الطالبتي-اختبار. قضبان المقياس = 100 مم (A)، 100 ميكرومتر (B)، 250 ميكرومتر (C، D، و I)، 10 ميكرومتر (E)، 5 ميكرومتر (H)، 50 ميكرومتر (J). وقد تم تعديل هذا الرقم من المنشور السابق24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الحقن المجهري من الليبوزومات المحملة بدواء مثبط للmROS يقمع إنتاج mROS داخل الضامة المنشط. (أ)التخطيطي توضيح استهداف المخدرات مثبطة mROS إلى الضامة وتقييم تأثيرها على تنشيط الضامة بعد التحفيز الكريستال MSU. (B و C)صور حية من الضامة المحملة بالدهون (مراقبة الليبوزومات / L-C(B)أو الليبوزومات المثبطة mROS / L-MI(C))داخل الدماغ الخلفي ليرقات Tg (mpeg1:EGFP) ، ملحوظ أيضا مع مسبار mROS الفلورسنت محددة (انظر جدول المواد, حيث يتم عرض إشارة الفلورسنت كخريطة حرارية مع الألوان الدافئة التي تمثل مستويات أعلى من mROS), 3 ح بعد حقن الدماغ الخلفي المجهري من الليبوزومات مارينا الأزرق المسمى وبلورات MSU. مارينا الأزرق الفلورية هو شبه اللون في الرمادي. (D)القياس الكمي لكثافة الفلورسينس من التحقيق mROS محددة داخل الضامة، كما تم الكشف عنها في B و C. عرض أشرطة الخطأ يعني ± SD. ****ف < 0.0001، الطالب ر-اختبار. مقياس شريط = 10 ميكرون (B). وقد تم تعديل هذا الرقم من المنشور السابق24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الحقن المجهري للدهون المحملة بمثبط mROS يقمع التعبير il1b داخل الضامة المنشطة وتجنيد العدلات التي تحركها الضامة. (أ)التعبير عن il1b (تميزت السهام السوداء), كما تم الكشف عن طريق جبل كامل في التهجين الموقعي, داخل منطقة الدماغ الخلفي 3 ح بعد حقن الدماغ الخلفي المجهري للسيطرة (L-C) أو الليبوزومات المثبطة mROS (L-MI) وبلورات MSU, الأمامي إلى اليسار. تمثل الأرقام نسبة اليرقات ذات الأنماط الظاهرية المعروضة. (ب)القياس الكمي للتعبير il1b، كما تم اكتشافه في A، كما هو موضح في نسبة اليرقات التي تظهر تعبيرًا مرتفعًا أو منخفضًا أو معدومًا. (C)صور Confocal من العدلات داخل منطقة الدماغ الخلفي من Tg (lyz:EGFP) يرقات (وجهات النظر الظهرية، الأمامي إلى اليسار)، كما تم الكشف عنها من قبل الفلوروريس المناعي 3 (3 حصان) و 6 (6 حصان) ح بعد الحقن المجهري في الدماغ الخلفي من بلورات L-C أو L-MI و MSU. (D)القياس الكمي الزمني للالعدلات، كما تم اكتشافه في C و 1 (1 hpi) و 3 (3 حصان) و 6 (6 حصان) و 9 (9 حصان) ح بعد الحقن المجهري بالدماغ الخلفي من بلورات L-C أو L-MI و MSU. عرض أشرطة الخطأ يعني ± SD. ****ف < 0.0001، n.s. ليست كبيرة، في اتجاه واحد ANOVA، اختبار دونيت بعد مخصص. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (A)، 50 ميكرومتر (C). وقد تم تعديل هذا الرقم من المنشور السابق24. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الممتلكات الفيزيائية الكيميائية من الليبوزومات (L) | مراقبة الليبوزومات | الليبوزومات المثبطة لـ mROS |
| الحجم (ميكرومتر) | 1.2 ± 0.07 | 1.1 ± 0.04 |
| زيتا المحتملة (mV) | -25.9 ± 0.57 | -13.0 ± 0.11 |
| كفاءة الفخ (EE، %) | N/A | 49.12 ± 0.17 |
| تحميل المخدرات (DL، %) | N/A | 0.37 ± < 0.01 |
الجدول 1: الخصائص الفيزيائية الكيميائية لبرنامج تلفزيوني (التحكم) أو الليبوزومات المثبطة للفيروس المتعدد البروم (البيانات هي وسائل ± الانحراف المعياري، ن = 3). كل الليبوزومات كانت تحمل علامة مارينا بلو
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، قدمنا بروتوكول مفصل لصياغة الليبوزومات المحملة بالمخدرات لاستهداف الضامة على وجه التحديد في سمك اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتشريح دور الضامة في نماذج معينة من الأمراض عن طريق ضمان التسليم المباشر المستهدف للأدوية على وجه التحديد إلى الضامة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه عندما السمية العامة للعقاقير يحد من استخدامها عند تسليمها من قبل طرق أكثر تقليدية، مثل الغمر. يوفر البروتوكول الموصوف هنا بديلاً لأنظمة الجسيمات النانوية الأخرى التي تم استخدامها لاستهداف الخلايا المناعية الفطرية في سمك الحمار الوحشي اليرقات. وتشمل هذه استهداف دواء ريفامبيسين الدواء المضاد للملاريا إلى الماسيكوترية مارينومالمصابة بالكلماة لتعزيز إزالة البكتيريا باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية دون ميكرون39. في مثال آخر ، تم تغليف (R) - roscovitine ، وهو محفز لأبوالة العدلات ، داخل البوليمرات قد ثبت أنها تستهدف هذا الدواء إلى العدلات ، وبالتالي تعزيز قرار الالتهاب40. في هذا البروتوكول، استخدمنا الليبوزومات كوسيلة لتوصيل الأدوية بسبب خصائصها غير السامة والمتوافقة بيولوجياً والقابلة للتحلل الحيوي. بالإضافة إلى ذلك ، فهي غير مناعية ، وهو أمر له أهمية خاصة عند استخدامه للتحقيق في الاستجابات المناعية ، مثل تلك الموصوفة هنا. ويمكن أيضا أن يتم مجموعة من البضائع بما في ذلك الأدوية المائية، الكارهة للماء، الأمفيباثيك وlipophilic.
عند تنفيذ هذا البروتوكول، هناك عدد من الخطوات الهامة حيث يجب توخي الحذر بشكل خاص. وتشمل هذه الخطوات حيث يتم التعامل مع اليرقات جسديا ويجب توخي الحذر لتقليل أي ضرر غير مقصود لليرقات. وهذا يشمل عندما dechorionating يدويا اليرقات (وخاصة تجنب الاتصال مع بطانة الظهارية الحساسة من صفار), مجموعة اليرقات على لوحة الحقن, إزالتها من لوحة بعد الحقن وتركيبها للتصوير الملتحمة الحية. عنصر لا مفر منه من هذا البروتوكول هو الحاجة إلى تسليم الليبوزومات (وأي تحديات المناعة) من خلال الحقن المجهري الذي يمكن أن يسبب التهاب موضعي وبالتالي قد يؤثر على النتيجة التجريبية. يتطلب الحقن المجهري في سمك اليرقات درجة معينة من التدريب لتقليل تلف الأنسجة. في عملنا ، وتوليد إبرة حقن دقيق قطرها من حوالي 5 ميكرومتر يولد طفيفة جدا الضرر الظهاري السطحي (كما يتضح من انخفاض شديد في التعبير عن مصفوفة metallopeptidase 9 في داخل الخلايا الظهارية السطحية في المنطقة المجاورة مباشرة للجرح microinjection10)عند حقن في البطين الخلفي من 2 dpf اليرقات. هذا الطرف القطر هو أيضا صغيرة بما يكفي لتجنب تسرب محتويات حقن, من البطين الخلفي, عندما تتم إزالة إبرة الحقن المجهري. من المهم أن نلاحظ هنا أن أحجام الحقن أكبر من 2 nL غالبا ما يؤدي إلى بعض المحتويات المحقونة تفيض من خلال ثقب الحقن نتيجة لتجاوز حجم البطين. قطر طرف 5 ميكرومتر هو أيضا من حجم كاف لحقن التحديات المناعية اللاحقة، مثل بلورات MSU10. شطب إبرة microinjection تلميح إلى 45 درجة مع microgrinder وذلك لتوليد طرف حاد قد توفر اختراق أفضل من periderm الخارجي والطبقات الظهارية القاعدية الداخلية التي تغطي البطين الخلفي41. من المهم ملاحظة أن حقن التحكم مثل تلك المستخدمة هنا (أي الليبوزومات السيطرة) ضرورية عند تقييم آثار الليبوزومات المحملة بالعقاقير على وظيفة الضامة للسيطرة على عملية الحقن نفسها. اختيار تركيز لدواء معين عند صياغة في الليبوزومات هو أيضا خطوة هامة كما أنشئت تركيزات المخدرات فعالة, عندما يتم تسليمها عن طريق الغمر, قد تختلف عن تلك الضرورية عند استخدام تسليم المخدرات بوساطة الليبوزول. وبالإضافة إلى ذلك، عند استخدام هذا البروتوكول، ينبغي للمرء أن يكون حريصا على عدم تغيير الخصائص الفيزيائية الكيميائية للدهون بعد التعديل مع poloxamer لأن هذا قد يؤثر على نمط التوزيع الحيوي.
ومن المجالات التي سيتم تعديلها وتطويرها في المستقبل هذا البروتوكول هو التحقيق في دمج ميزات سطحية مختلفة للدهون مثل ليغاند أو مستقبلات لزيادة تعزيز استهداف الضامة والمشاركة، أو لاستهداف الخلايا المناعية المختلفة، مثل العدلات. وسيتطلب هذا النهج المتقدم إجراء مزيد من الدراسات للكشف عن السمات السطحية الفريدة لمقصورات الخلايا المناعية المختلفة لسمك الحمار الوحشي، والتي لا تُفهم حالياً فهماً جيداً. وتشمل المجالات الأخرى لتعديل هذا البروتوكول إدراج تحقيقات فلورية أخرى في الليبوزومات لتوسيع براعة (على سبيل المثال، عندما يتم حقنها في خطوط المراسلة المعدلة وراثيا أخرى) وتغيير خصائصها الفيزيائية مثل هذا الحجم وتهمة42،43. سيكون من المهم أيضًا دراسة ما إذا كانت الطرق المختلفة لإدارة الدهون في مراحل اليرقات المختلفة يمكن أن توسع براعة استخداماتها لاستهداف مجموعات الضامة الإضافية ، على سبيل المثال الخلايا الظهارية المعوية. في البروتوكول المفصل هنا ، تم إجراء جميع الحقن على يرقات dpf 2. خلال اليوم الثالث من تطور سمك الحمار الوحشي واحد التجويف المستمر من الفم إلى أشكال فتحة، بعد فتح الفم44. بحلول يوم الرابع فتحة فتحة يفتح مما أدى إلى أنبوب مفتوح تماما اصطف مع ظهارة الاستقطاب44. سيكون من المثير للاهتمام معرفة ما إذا كان غمر اليرقات القديمة في الليبوزومات يمكن أن يسهل استهداف الأدوية المغلفة للخلايا الظهارية المعوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل بمنح قُدّمإليها إلى مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا وصندوق مارسدن، والجمعية الملكية لنيوزيلندا) ومؤسسة Z.W. (صندوق تطوير بحوث أعضاء هيئة التدريس من جامعة أوكلاند). يشكر المؤلفون الهاد ماهاغونكار على إدارة الخبراء لمرفق الحمار الوحشي ، ووحدة أبحاث التصوير الطبي الحيوي ، وكلية العلوم الطبية ، وجامعة أوكلاند للمساعدة في التصوير البؤري وغراهام Lieschke لإهداء Tg (mpeg1:EGFP) خط المراسل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
