Summary
Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.
Abstract
Zebravissen (Danio rerio) larven hebben zich ontwikkeld tot een populair model om gastheer-pathogene interacties en de bijdrage van aangeboren immuuncellen aan ontstekingsziekten te wijten aan hun functioneel bewaard gebleven immuunsysteem te onderzoeken. Ze worden ook veel gebruikt om te onderzoeken hoe aangeboren immuuncellen helpen bij het begeleiden van ontwikkelingsprocessen. Door gebruik te maken van de optische transparantie en genetische aallaatbaarheid van larve zebravissen, richten deze studies zich vaak op live beeldvormingsbenaderingen om fluorescerend gemarkeerde macrofagen en neutrofielen binnen intacte dieren functioneel te karakteriseren. Door hun diverse functionele heterogeniteit en steeds groeiende rollen bij pathogenese van ziekten, hebben macrofagen veel aandacht gekregen. Naast genetische manipulaties worden chemische interventies nu routinematig gebruikt om macrofaaggedrag bij larve zebravissen te manipuleren en te onderzoeken. Levering van deze geneesmiddelen is meestal beperkt tot passieve targeting van gratis drug door middel van directe onderdompeling of micro-injectie. Deze benaderingen vertrouwen op de veronderstelling dat eventuele veranderingen in macrofaaggedrag het resultaat zijn van een direct effect van het medicijn op de macrofagen zelf, en niet een stroomafwaarts gevolg van een direct effect op een ander celtype. Hier presenteren we onze protocollen voor het specifiek richten van drugs op larve zebravissen macrofagen door microinjecterende door drugs geladen fluorescerende liposomen. We onthullen dat poloxamer 188-gemodificeerde drug-loaded blauwe fluorescerende liposomen gemakkelijk worden opgenomen door macrofagen, en niet door neutrofielen. We leveren ook bewijs dat drugs die op deze manier worden geleverd, macrofaagactiviteit kunnen beïnvloeden op een manier die in overeenstemming is met het werkingsmechanisme van het medicijn. Deze techniek zal van waarde zijn voor onderzoekers die ervoor willen zorgen dat geneesmiddelen worden gericht op macrofagen en wanneer geneesmiddelen te giftig zijn om te worden geleverd met traditionele methoden zoals onderdompeling.
Introduction
Het mononucleaire fagocytesysteem biedt een eerste verdedigingslinie tegen binnendringende ziekteverwekkers. Dit systeem bestaat uit monocyten, monocyten-afgeleide dendritische cellen en macrofagen, die actief fagocytoze vreemde ziekteverwekkers, waardoor de verspreiding van ziekteverwekkers wordt beperkt. Naast deze fagocytische en microbicidale effectorfuncties zijn dendritische cellen en macrofagen ook in staat cytokineproductie en antigeenpresentatie om het adaptieve immuunsysteem te activeren1. Van deze cellen hebben macrofagen bijzondere aandacht gekregen vanwege hun diverse functionele heterogeniteit en betrokkenheid bij meervoudige ontstekingsziekten, van auto-immuniteit en infectieziekten tot kanker2,3,4,5,6,7. De plasticiteit van macrofagen en hun vermogen om zich functioneel aan te passen aan de behoeften aan hun weefselomgeving vereisen experimentele benaderingen om deze cellen in vivo rechtstreeks te observeren en te ondervragen.
Larve zebravissen zijn een ideaal model organisme waarmee de functie en plasticiteit van macrofagen in vivo8te bestuderen. De optische transparantie van larve zebravissen biedt een venster om het gedrag van macrofagen direct te observeren, vooral in combinatie met macrofaagmarkeringtransgene reporterlijnen. Het benutten van het levende beeldvormingspotentieel en de experimentele traktaat van larvezebravissen heeft geleid tot veel significante inzichten in de macrofaagfunctie die direct relevant zijn voor de menselijke ziekte9,10,11,12,13,14,15. Veel van deze studies hebben ook gebruik gemaakt van de hoge instandhouding van de activiteit van drugs bij zebravissen (een attribuut dat hun gebruik als een hele dierlijke drug discovery platform16,17,18), door gebruik te maken van chemische interventies om farmacologisch te manipuleren macrofaag functie. Tot op heden zijn deze farmacologische behandelingen meestal geleverd door onderdompeling, waardoor het medicijn in water oplosbaar moet zijn, of door directe micro-injectie van vrij geneesmiddel(figuur 1A). Beperkingen van deze passieve leveringsstrategieën omvatten off-target effecten en algemene toxiciteit die de beoordeling van eventuele gevolgen voor de macrofaagfunctie kunnen uitsluiten. Bovendien, bij het onderzoeken van drugseffecten op macrofagen is het onbekend of de geneesmiddelen handelen op de macrofagen zelf of door meer indirecte mechanismen. Bij het uitvoeren van soortgelijke chemische interventie studies om macrofaag functie te onderzoeken, erkenden we dat er een onvervulde noodzaak om een goedkope en eenvoudige leveringsmethode te ontwikkelen om drugs specifiek richten op macrofagen.
Liposomen zijn microscopisch, biocompatibel, lipide tweelaagse blaasjes die eiwitten, nucleotiden en drugslading kunnen inkapselen19. De unilamellar of multilamellar lipide bilayer structuur van liposomen vormt een waterig binnenlumen waar in water oplosbare geneesmiddelen kunnen worden opgenomen, terwijl hydrofobe geneesmiddelen kunnen worden geïntegreerd in de lipide membranen. Bovendien kunnen de fysischchemische eigenschappen van liposomen, waaronder grootte, lading en oppervlaktemodificaties, worden gemanipuleerd om hun targeting af te stemmen op specifieke cellen20,21. Deze kenmerken van liposomen hebben ze een aantrekkelijk voertuig om drugs te leveren en de precisie van de huidige behandeling regimes20te verbeteren. Aangezien liposomen van nature worden gefagocytozed door macrofagen (een functie die wordt uitgebuit door hun routinematiggebruik bij het specifiek leveren van clodronaat aan macrofagen voor ablatieexperimenten22),presenteren zij zich als een aantrekkelijke optie voor macrofaagspecifieke geneesmiddelenlevering(figuur 1B).
Dit protocol beschrijft de formulering van geneesmiddelen in blauwe fluorescerende liposomen bekleed met de hydrofiele polymeer poloxamer 188, dat vormt een beschermende laag op het liposoom oppervlak en is aangetoond dat het behoud van geneesmiddelen te verbeteren en hebben superieure biocompatibiliteit23. Poloxamer werd gekozen voor oppervlaktecoating van liposomen, omdat ons vorige onderzoek had aangetoond dat, in vergelijking met polyethyleenglycol gemodificeerde liposomen, poloxamer gemodificeerde liposomen betere biocompatibiliteit vertoonden na onderhuidse injectie van rattenpoten en soortgelijke farmacokinetiek bij konijnen na intraveneuze infusie23. Protocollen worden ook beschreven voor hun micro-injectie in larve zebravissen en live beeldvorming om hun macrofaag-targeting vermogen en lokalisatie te beoordelen naar intracellulaire compartimenten die nodig zijn voor liposoomafbraak en cytoplasmatische drug levering. Als proof-of-concept hebben we deze techniek eerder gebruikt om twee geneesmiddelen op macrofagen te richten om hun activering te onderdrukken in een larve zebravismodel van acute jichtontsteking24. Deze drug levering techniek breidt de chemische "toolkit" beschikbaar voor zebravis onderzoekers willen macrofaag-targeting van hun drugs van belang te waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van drug-geladen Marina Blue-gelabeld Liposomen
OPMERKING: Liposomen die de blauwe fluorescerende kleurstof, Marina Blue en drug worden bereid met behulp van een dunne film hydratatie methode met post inbrengen van poloxamer 188. Alle procedures worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven. Controle liposomen dragen alleen Marina blauw en PBS. Het voorbeeld hier beschrijft het laden van liposomen met een mitochondria-targeting antioxidant drug25 die wordt gebruikt in de representatieve resultaten als een proof-of-concept.
- Los voor de bereiding van liposomen 16,4 mg (22,2 μmol) van de fosfolipiden 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine op (zie Materiaaltabel), 4,3 mg (11,1 μmol) cholesterol (zie Materiaaltabel) en 2,8 mg (3,7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-fosfocholine (zie Materiaaltabel, in 3 mL chloorvorm:methanol (3:1 v/v) in een kolf met een ronde bodem van 25 mL.
- Voeg aan het bovenstaande mengsel 31 nmol Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosphoethanolamine toe (zie Tabel met materialen) en 300 nmol van een mROS remmend medicijn (zie Tabel met materialen) en sasonicaat kort om volledig op te lossen. Voor controle liposomen, voeg alleen Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosfoethanolamine.
OPMERKING: Om te voorkomen dat fotobleaching van de lichtgevoelige Marina Blue tl-kleurstof, alle procedures te beschermen tegen licht, waar mogelijk. Dit is ook belangrijk als het te laden medicijn lichtgevoelig is. - Verwijder het oplosmiddel langzaam op een roterende verdamper (zie Materiaaltabel)over een temperatuurgestuurd waterbad dat is ingesteld op 45 °C door onder vacuümdruk bij 75 tpm te draaien (200 mbar voor 15 min dan 0 mbar gedurende 20 min). Dit vormt een droge dunne lipidefilm binnen de glazen wanden van de kolf die verder wordt gedroogd gedurende 45 minuten onder N2 om volledige verwijdering van het organische oplosmiddel te vergemakkelijken.
- Na de vorming van de dunne film, zet de vacuümdruk op 40 mbar voor 15 min, dan zuiveren met stikstofgas voor 30 min om te zorgen voor verwijdering van residu oplosmiddel.
- Hydrateer de dunne folie met 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.4) en sluit af met parafilm voordat u de kolf oproert met behulp van een roterende verdamper over een waterbad van 60 °C gedurende 20 minuten om blaasjes te vormen.
- Onderwerp de gehydrateerde suspensie aan 7 vries- en ontdooiingscycli door bevriezing in vloeibare N2 gedurende 3 min, gevolgd door onderdompeling in een waterbad van 45 °C gedurende 7 min.
- Extrudeer liposomen door een membraan met behulp van een mini-extruder (zie Tabel met materialen) en 1,0 μm track-geëtste polycarbonaat membranen (zie Tabel met materialen) gedurende 2-6 cycli om grote unilamellaire blaasjes te verkrijgen.
OPMERKING: Om een gunstigergerichte targeting op macrofagen te bereiken, manipuleert u extrusiecycli totdat de diameter van liposomen ongeveer 1 μm26,27,28is. - Condenseer de verse liposomen in een pellet door ultracentrifugation bij 186.000 x g en incubeer met 1 mL van 1% poloxamer 188 (zie Tabel met Materialen) oplossing (10 mg/mL in PBS) bij 45 °C en 750 tpm voor 30 min met behulp van een thermomixer met een 2 mL microcentrifuge buisbevestiging (zie Tabel met materialen).
- Ultracentrifugeer het mengsel bij 186.000 x g voor 1 h bij 4 °C en verwijder de supernatant om ongebonden polymeer of drug te verwijderen. Bewaar de liposomen pellets op 4 °C, beschermd tegen licht.
2. Karakterisering van Liposome Size en Zeta Potential
- Verdun liposoomformulering met ultrazuiver water (1:100) en meet de deeltjesgrootte, polydispersieindex (PDI) en zetapotentieel van de liposomen met behulp van een dynamische lichtverstrooiingsanalyzer (zie Tabel met materialen), in drievoud bij 25 °C.
OPMERKING: De PDI is een maat voor de grootteverdeling van de nanodeeltjespopulatie. PDI-waarden < 0,05 geeft een meer uniforme verdeling aan, terwijl waarden die dichter bij 1 liggen, wijzen op een grotere verdeling. Het zeta potentieel is de totale oppervlaktelading.
3. Berekening van entrapment Efficiency en Drug Loading in Liposomen
OPMERKING: Om de trapment efficiëntie van drugs in liposomen te bepalen, wordt het drugsgehalte in de supernatant en liposoompellet gemeten.
- Resuspend de liposoom pellet in 1 mL van PBS.
- Verwijder de supernatant, verdun 10 x met ultrazuiver water en analyseer door high-performance vloeibare chromatografie (HPLC).
- Om de concentratie van het geneesmiddel in de liposomen te bepalen, voegt u 100 μL liposoomse suspensie toe aan 900 μL van 10% triton-X100-oplossing (om het lipidemembraan te vernietigen, het gevangen medicijn vrij te geven en lipideopbouw in de HPLC-kolom te voorkomen) en vortex gedurende 3 min vóór de analyse.
- Injecteer 20 μL monster in een HPLC-systeem bestaande uit een quaternaire pomp, thermostaat autosampler en een kolom van 3 μm 250 x 4,6 mm. Stel de mobiele fase (10 mM PBS pH 2.5, acetonitril en methanol (30:40:30, v/v/v)) stroomsnelheid in op 0,9 mL/min en verkrijg spectrale profielen met behulp van een diode array detector set op 230 mM.
- Bereken de trapmentefficiency (EE) en het laden van geneesmiddelen (DL) met behulp van de volgende vergelijkingen:
EE (%) = [Me / Mt] x 100
DL (%) = [Me / Mlip] x 100
Waar ik is de massa van drug ingekapseld, Mt is de totale massa van de drug gebruikt tijdens de formulering en Mlip is de totale massa van de lipiden (inclusief cholesterol) en ingekapselde drug.
4. Voorbereiding en injectie van liposomen
- Bereid borosilicaat microinjectienaalden voor door een dunne wandborosilicaat glascapillaire (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm lengte) in een micropipette trekker apparaat (zie Tabel met materialen)met de volgende generieke trekker instellingen (warmte 680, trek 75, snelheid 40, tijd 55 en druk 530) om een taps toelopende microinjectie naald te produceren.
- Plaats de naalden in een petrischaaltje op de modelleringklei en schik op een manier dat het getrokken uiteinde de bodem van de schotel niet raakt. Houd het petrischaaldeksel gesloten om stofverontreiniging te voorkomen tot het klaar is voor gebruik.
- Verdun vers bereide liposoomformuleringen 1:1 in steriele PBS (pH 7.4) en kort vortex (2-3 s) om te mengen.
OPMERKING: Bescherm liposomen tegen licht totdat larven klaar zijn voor micro-injectie. - Het opzetten van volwassen zebravis broedparen de avond tevoren en het verzamelen van embryo's zoals eerder beschreven door Rosen et al.29.
- Breng de embryo's over in een petrischaaltje (100 mm x 20 mm stijl met ongeveer 60 embryo's per schotel) met E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4)aangevuld met 0,1% methyleenblauw om schimmelgroei te remmen. Verwijder alle dode of onbevruchte embryo's en broed 's nachts bij 28,5 °C.
- Voeg 0,003% N-Fenylthiourea (PTU) toe aan de E3-media wanneer de embryo's 24 uur van ontwikkeling bereiken om pigmentvorming (melanisatie) te voorkomen.
- Handmatig dechorionate de embryo's op ongeveer 30 uur post bevruchting (hpf) met behulp van fijne tip tangen.
OPMERKING: Gebruik geen enzymatische behandeling om embryo's te dechorionate, omdat dit epitheelschade en lokale ontsteking kan veroorzaken en daardoor immunologische studies beïnvloedt - Laat de embryo's zich ontwikkelen bij 28,5 °C tot 2 dagen na de bevruchting (dpf).
- Bereid een injectieplaat door het gieten van genoeg 3% methylcellulose (in E3 media) in het deksel van een kleine 35 mm kweekschaal om een dunne film die het hele oppervlak te vormen.
OPMERKING: Bij de bereiding van 3% methylcellulose in E3-media duurt het enkele dagen voordat de methylcellulose oplost met zachte agitatie op een orbitale shaker. - Verdoven de larven door te broeden in E3 media aangevuld met 200 μg/mL van Tricaine.
- Verzamel een poel van ongeveer 20-25 larven met behulp van een plastic overdracht pipet en laat de embryo's te concentreren op het puntje van de pipet door de zwaartekracht. Zorg ervoor dat de larven met minimale vloeistof worden overgebracht, plaats ze in het midden van het 35 mm kweekdeksel.
- Met behulp van een microcapillaire lader, schik de larven op de volgende manieren: voorste naar de bovenkant van de injectieplaat met het rugoppervlak naar de microinjectie naald, te injecteren in de achterste hersenventrikel(figuur 2A-D); of, voorste naar de linkerkant van de injectieplaat (bij het injecteren van rechts) met het ventrale oppervlak naar de micro-injectienaald om in het sinusvenosus te injecteren (figuur 2I).
OPMERKING: Wanneer deze op deze manier wordt geïnjecteerd, kunnen respectievelijk macrofagen(figuur 2J) en caudal hematopoietisch weefsel(CHT)-resident(figuur 2J)macrofagen worden gericht. De CHT regio van larve zebravissen is een hematopoietische site analoog aan de zoogdierfoetale lever. Besteed extra aandacht niet aan schade aan de embryo's tijdens het regelen, omdat dit lokale ontsteking en daardoor immunologische studies kan beïnvloeden. - Neem vers bereide liposomen (vanaf stap 4.3) en vul een injectienaald met ongeveer 5 μL van het liposoominjectiemengsel met behulp van een microcapillaire lader (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Bij de beoordeling van de lokalisatie van liposomen in de fagolysosomale compartimenten van macrofagen (figuur 2H), vult u deze injectiemix aan met 200 μg/mL van een rode fluorescerende marker van fagosomen (zie Materiaaltabel) en 100 nM van een veel rode fluorescerende marker van lysosomen (zie Materiaaltabel) om fagosomes30,31 en lysosomen32te markeren, respectievelijk. - Monteer de naald in een micromanipulator (zie Tabel met materialen)verbonden met een magnetische standaard en een drukinjector (zie Materiaaltabel). Plaats onder een stereomicroscoop en stel de injector op een pulsduur van ongeveer 50 ms en een injectiedruk van ongeveer 40 psi.
- Snijd de punt van de microinjectienaald met schone fijne punttangen om een opening van ongeveer 5 μm in diameter te genereren.
- Kalibreer het te injecteren volume door een bolus in een druppel minerale olie te injecteren die over de rasterlijnen van een hemocytometer wordt geplaatst. Pas de pulsduur en/of de injectiedruk aan totdat de diameter van de bolus 2,5 van de kleinste rasterlijnen bedekt (dit komt overeen met een volume van ongeveer 1 nL).
- Injecteer voorzichtig 1 nL van de liposoominjectiemix in de achterste hersenventrikel van elke larven.
OPMERKING: Bij het injecteren in de achterste hersenventrikel, zorg ervoor dat niet te ver ventrally (buiten de achterhersenen) doordringt, omdat dit de onderliggende vasculatuur kan verstoren die leidt tot bloedingen. Bij het injecteren in de sinus venosus, moet ervoor worden gezorgd dat de punt van de naald zich net binnen het hartzakje bevindt en de dooier niet penetreert. - Breng na injectie de geïnjecteerde larven onmiddellijk terug naar E3-media door E3-media toe te voegen aan de injectieplaat en de larven voorzichtig uit de methylcellulose te aaien met behulp van een plastic overdrachtspipet.
- Incubeer de larven bij 28,5 °C (beschermd tegen licht) tot analyse door live confocale beeldvorming.
5. Confocale beeldvorming en beeldanalyse om macrofaagtargeting van liposomen te bevestigen
- Verwarm een waterbad tot 50 °C.
- Verdoven liposoomgeïnjecteerde larven door over te zetten naar een nieuwe Perti-schotel met E3-media aangevuld met 0,003% PTU en 200 μg/mL Tricaine.
- Bereid live beeldvorming montage medium door het oplossen van 1% laag smeltpunt agarose in E3 media, aangevuld met 0,003% PTU, in een magnetron. Plaats in het waterbad en zodra de oplossing is afgekoeld tot 50 °C, voeg 200 μg/mL van Tricaine toe.
- Bewaar het montagemedium in het waterbad van 50 °C om voortijdige polymerisatie van de agarose te voorkomen.
- Om het dorsale oppervlak van de achterhersenen te beeld geven op een confocale microscoop uitgerust met een wateronderdompelingslens(figuur 2E),sluit u de larven als volgt in: Vul een 35 mm kweekschaal met het montagemedium (tot een diepte van ongeveer 5 mm) en laat het polymeriseren. Graaf een kleine sleuf in de agarose die van voldoende grootte is om de dooierzak tegemoet te komen.
- Vul een plastic overdracht pipet met gesmolten montage medium, verdrijven een kleine hoeveelheid, en gebruik het om de verdoofde larven te verzamelen. Breng de larven onmiddellijk over in de kweekschaal en oriënteer de dooierzakjes, ventrale kant naar beneden, in de opgegraven gaten, met behulp van een microcapillaire lader. Houd ze periodiek in deze positie totdat de agarose polymeriseert. Overlay met E3 media aangevuld met 200 μg/mL Tricaine.
OPMERKING: Let er bij het overbrengen en positioneren van larven op dat u geen epitheelschade en lokale ontstekingen veroorzaakt die immunologische studies kunnen beïnvloeden. Voor het positioneren van larven om het CHT-gebied te leven (figuur 2J), zet je zoals hierboven beschreven op, maar plaats je de larven in het opgegraven gat lateraal. - Wanneer beeldvorming op een omgekeerde confocale microscoop, insluiten de larven, zonder de agarose bed, direct op de bodem van een glazen bodemschotel. Schik ze dorsale oppervlak naar beneden (of lateraal) en na polymerisatie, bedek de gehele schotel oppervlak met een gelijkmatige laag van montage medium. Voeg een dunne laag E3-media toe, aangevuld met 200 μg/mL Tricaine.
- Gebruik de volgende instellingen om de achterste hersenventrikel op een confocale microscoop te bekijken: 512 x 512 pixels; 40 x 3 μm Z-stacks (uit de rug-meest oppervlak van de achterhersenen); 20x doelstelling; 2,5x zoom.
OPMERKING: Bij het vergelijken van signaalintensiteiten tussen monsters (bijvoorbeeld bij het weergeven van de opname van marina blue-gelabelde liposomen die binnen de reporterlijnen worden geïnjecteerd en macrofagen markeren [Tg(mpeg1:EGFP)33] of neutrofielen [Tg(lyz:EGFP)34]), is het essentieel dat de laserinstellingen hetzelfde worden gehouden (bijv. pinhole diameter, laser spanning, offset en gain) om ervoor te zorgen eventuele verschillen zijn niet een artefact van gewijzigde beeld acquisitie instellingen. - Gebruik 3D-beeldanalysesoftware om macrofaag of neutrofiele opname van Marina Blue-gelabelde liposomen te kwantificeren. Als u het aantal cellen met liposomen(figuur 2F)in een Z-stack wilt kwantificeren, bladert u door de afzonderlijke Z-secties en telt u het aantal afzonderlijke cellen met Marina Blue-gelabelde liposomen. Om de fluorescentieintensiteit van liposomen in cellen(figuur 2G)te kwantificeren, trekt u een gebied van belang rond elke cel (in de Afmetingen X, Y en Z) om de totale of gemiddelde fluorescentieintensiteit van intracellulaire Marina Blue te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De dunne film hydratatie aanpak hier beschreven voor de voorbereiding van fluorescerende liposomen omsluiten van drugs is een eenvoudige en kosteneffectieve methode. Met het protocol dat in deze studie wordt gebruikt, zullen de liposomen naar verwachting unilamellar23,24zijn. De grootte, zeta potentieel, drug laden en beknelling efficiëntie van de geproduceerde liposomen zijn samengevat in tabel 1. De deeltjesgrootte van de liposomen (voor en na het laden van geneesmiddelen) is vergelijkbaar(tabel 1). De oppervlaktelading (zeta potentieel) van drug-geladen liposomen is lichtjes neutraler in vergelijking met controle liposomen, nochtans, zijn zij allen negatief geladen betekenend dit niet beduidend hun biodistributiepatroon zal veranderen.
Micro-injectie van Marina Blue-gelabelde liposomen in de achterste hersenventrikel resulteert in een snelle opname door ingezeten macrofagen die gemakkelijk kunnen worden waargenomen door confocale microscopie door 3 uur na injectie, wanneer geïnjecteerd in de macrofaaglijn-markering transgene reporter lijn Tg (mpeg1:EGFP)33 (Figuur 2C, E-G). Dit in tegenstelling tot neutrofielen (zoals aangegeven binnen de neutrofiel-specifieke Tg(lyz:EGFP)34 reporter lijn) die zelden worden waargenomen met intracellulaire liposomen(figuur 2E-G). Binnen individuele liposoom-beladen macrofagen, de liposomen accumuleren binnen fagolysososomale compartimenten (Figuur 2H), die nodig is voor liposoomafbraak en de daaropvolgende afgifte van hun drugsinhoud in het cytoplasma35. Het selecteren van verschillende micro-injectie plaatsen voor liposoom levering kan invloed hebben op welke weefsel-resident macrofagen zijn gericht. Als voorbeelden richt de levering in de achterste hersenventrikel efficiënt op hindbrain-resident macrofagen(figuur 2D,E),terwijl micro-injectie in het sinusvenosus de liposomen via de circulatie aan CHT-resident macrofagen kan leveren (figuur 2I,J).
Overweging van de micro-injectie site voor liposoom levering is belangrijk bij het gebruik van deze techniek om de macrofaag reactie op een immunologische uitdaging te ondervragen als het helpt ervoor te zorgen dat de bijzondere macrofagen in onderzoek ontvangen van het geneesmiddel. We hebben dit protocol routinematig gebruikt voor de levering van door drugs geladen liposomen in de rechter-middenkamer om de impact van deze geneesmiddelen op de macrofaagrespons op mononatriumutraat (MSU) kristallen te beoordelen, op dezelfde manier geïnjecteerd in het achterstehersencompartiment (figuur 3A). Als veroorzaker van acute jichtontsteking activeren MSU-kristallen weefsel-ingezeten macrofagen om ontstekingsremmende bemiddelaars te produceren, waaronder Interleukin-1β (IL-1β) door middel van een proces dat afhankelijk is van mitochondriale reactieve zuurstofsoorten (mROS)10,36,37,38. Deze geactiveerde macrofagen rijden dan neutrofiele infiltratie, een kenmerk van acute jichtontsteking. Micro-injectie van liposomen geladen met een mROS-remmende drug in de achterste hersenventrikel kan msu kristal-gedreven mROS productie binnen liposoom-beladen hindbrain-resident macrofagen(figuur 3B-D) aanzienlijk onderdrukken. Met behulp van het hier beschreven protocol bereikten we een trapefficiëntie van 49,12 ± 0,17 %, wat resulteerde in een formulering met een medicijnconcentratie van 103,05 ± 0,36 μM. Van nota, het injecteren van een 1 nL volume bij deze concentratie resulteerde in geen waarneembare toxiciteit tijdens onze experimenten, zoals blijkt uit grove morfologische veranderingen of hartstilstand. Verdere validatie van de onderdrukkende effecten van dit medicijn op de activeringstoestand van macrofaag kan worden uitgevoerd door il1b-expressie (de zebravisorenorde van IL-1β) te onderzoeken door hele mount in situ hybridisatie(figuur 4A,B) en de tijdelijke aanwerving van neutrofielen (figuur 4C,D).
Figuur 1: Schematisch illustreren conventionele gratis levering van geneesmiddelen versus liposoom-gemedieerde drug levering aan larve zebravissen. (A) Strategieën routinematig gebruikt voor de levering van geneesmiddelen aan larve zebravissen zijn grotendeels beperkt tot onderdompeling in, of micro-injectie van, gratis drug. (B) Micro-injectie van met drugs geladen liposomen zorgt voor directe targeting op macrofagen, waar liposoomafbraak binnen fagolysosomale compartimenten resulteert in cytoplasmatische drug levering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Drugs richten op macrofagen met behulp van fluorescerende liposomen. (A) Micro-injectie opstelling met micro-injectie naald (zwarte pijl) en larven arrayed in een 35 mm weefsel kweekschotel binnen 3% methylcellulose. (B) Vergrote weergave van larven die als in A. (C) Levend confocale beeld van 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP) larven, voorafgaand aan linkerzijde worden gearrayeerd. (D) Vergrote weergave van gearrayeerde larven, zoals in A, waaruit blijkt micro-injectie in de achterste hersenen ventrikel (zwarte pijl markeert micro-injectie naald). (E) Schematische illustratie van targeting van hindbrain-resident macrofagen en live confocale beelden (rugviews, voorste naar links) van het achterhersengebied tg(mpeg1:EGFP) en Tg(lyz:EGFP) larven, 3 uur na hindbrain micro-injectie van Marina Blue-gelabelde liposomen (witte pijlen markeren liposome beladen macrofagen). (F en G) Kwantificering van de liponische opname door macrofagen en neutrofielen (zoals gedetecteerd in E), gemeten als het aantal cellen met (F) en de fluorescentieintensiteit /cel (G) van Marina Blue-gelabelde liposomen. (H) Live confocale beeld van liposoom-beladen macrofaag in de achterhersenen gemarkeerd met een rode fluorescerende marker van fagosen en een veel rode fluorescerende marker van lysosomen binnen Tg (mpeg1:EGFP) larven, 3 uur na hindbrain micro-injectie van Marina Blue-gelabelde liposomen. (I) Vergrote weergave van gearrayeerde larven, zoals in A, het aantonen van micro-injectie in de sinus venosus (zwarte pijl markeert micro-injectie naald). (J) Schematische illustratie van de targeting van CHT-resident macrofagen en live confocale beelden (laterale weergaven, voorste naar links) van de CHT-regio van Tg(mpeg1:EGFP) en Tg(lyz:EGFP) larven, 3 uur na micro-injectie van Marina Blue-gelabelde liposomen in de sinusvenosus (witte pijlen markeren liposoom beladen macrofagen). Foutbalken worden weergegeven met ± SD. *p<0,05; p < 0,0001, Student's t-test. Schaalstaven = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D en I), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van eerdere publicatie24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Micro-injectie van liposomen geladen met een mROS-remmend medicijn onderdrukt mROS-productie binnen geactiveerde macrofagen. (A) Schematisch illustreren de targeting van een mROS-remmende drug op macrofagen en het beoordelen van de impact op macrofaag activering na MSU kristal stimulatie. (B en C) Live confocale beelden van liposoom-beladen macrofagen (controle liposomen/L-C(B) of mROS-remmende liposomen/L-MI(C))binnen het achterbrein van Tg(mpeg1:EGFP) larven; ook gemarkeerd met een fluorescerende mROS-specifieke sonde (zie Tabel met materialen, waar het fluorescerende signaal wordt weergegeven als een heatmap met warme kleuren die hogere niveaus van mROS), 3 uur na hindbrain micro-injectie van Marina Blue-gelabelde liposomen en MSU kristallen. Marina Blue fluorescentie is pseudo-gekleurd in grijswaarden. (D) Kwantificering van de fluorescentieintensiteit van mROS-specifieke sonde binnen macrofagen, zoals gedetecteerd in B en C. Foutbalken geven gemiddelde ± SD. ****p < 0,0001, Student's t-test. Schaalbalk = 10 μm (B). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van eerdere publicatie24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Micro-injectie van liposomen geladen met een mROS-remmer onderdrukt il1b-expressie binnen geactiveerde macrofagen en macrofaaggestuurde neutrofiele rekrutering. (A) Expressie van il1b (gemarkeerd door zwarte pijlen), zoals gedetecteerd door hele mount in situ hybridisatie, binnen het achterstehersengebied 3 h na hindbrain microinjection of control (L-C) of mROS-remmende liposomen (L-MI) en MSU kristallen, van vooraan naar links. Getallen vertegenwoordigen een deel van de larven met weergegeven fenotypes. (B) Kwantificering van il1b expressie, zoals gedetecteerd in A, weergegeven als procent larven die hoge, lage of geen expressie. (C) Confocale beelden van neutrofielen in het achterhersengebied van Tg(lyz:EGFP) larven (dorsale weergaven, van vooraan naar links), zoals gedetecteerd door immunofluorescentie 3 (3 hpi) en 6 (6 hpi) h na hindbrain micro-injectie van L-C of L-MI en MSU kristallen. (D) Temporele kwantificering van neutrofielen, zoals gedetecteerd in C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 pk) en 9 (9 pk) h na hindbrain micro-injectie van L-C of L-MI en MSU kristallen. Foutbalken display betekenen ± SD. ****p < 0,0001, n.s. niet significant, one-way ANOVA, Dunnett's post hoc test. Schaalstaven = 100 μm (A), 50 μm (C). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van eerdere publicatie24. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Fysischchemisch eigendom van liposomen (L) | Controle liposomen | mROS-remmende liposomen |
| Grootte (μm) | 1,2 ± 0,07 | 1,1 ± 0,04 |
| Zeta potentieel (mV) | -25,9 ± 0,57 | -13,0 ± 0,11 |
| Trapment efficiency (EE, %) | N/a | 49,12 ± 0,17 |
| Het laden van drugs (DL, %) | N/a | 0,37 ± <0,01 |
Tabel 1: Fysisch-chemische kenmerken van PBS (controle) of mROS-remmende liposomen (gegevens zijn middelen ± standaarddeviatie, n = 3). Alle liposomen waren gelabeld met Marina Blue.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een gedetailleerd protocol om met drugs geladen liposomen te formuleren om specifiek macrofagen bij larve zebravissen aan te pakken. Deze methode kan worden gebruikt om de rol van macrofagen in bepaalde ziektemodellen te ontleden door te zorgen voor directe gerichte levering van geneesmiddelen specifiek aan macrofagen. Bovendien kan het worden gebruikt wanneer de algemene toxiciteit van geneesmiddelen het gebruik ervan beperkt wanneer ze worden geleverd door meer conventionele routes, zoals onderdompeling. Het hier beschreven protocol biedt een alternatief voor andere nanodeeltjessystemen die zijn gebruikt om aangeboren immuuncellen bij larvenzebravissen aan te pakken. Deze omvatten gericht op de antimalariamiddel rifampicine aan Mycobacterium marinum-geïnfecteerdemacrofagen om bacteriële klaring te bevorderen met behulp van sub-micron grootte polymere nanodeeltjes39. In een ander voorbeeld is aangetoond dat inkapseling van (R)-roscovitine, een inklapmiddel van neutrofiele apoptose, binnen polymerosomen is aangetoond dat het zich richt op neutrofielen, waardoor ontstekingsresolutie40wordt bevorderd. In dit protocol hebben we liposomen gebruikt als een voertuig voor de levering van geneesmiddelen als gevolg van hun niet-toxische, biocompatibele en biologisch afbreekbare eigenschappen. Bovendien zijn ze niet-immunogeen, wat van bijzonder belang is wanneer ze worden gebruikt om immunologische reacties te onderzoeken, zoals hier beschreven. Een scala aan ladingen kan ook worden vervoerd, waaronder hydrofiele, hydrofobe, amtoofthische en lipofiele geneesmiddelen.
Bij het uitvoeren van dit protocol zijn er een aantal kritieke stappen waar speciale zorg moet worden genomen. Deze omvatten stappen waarbij larven fysiek worden behandeld en zorg moet worden genomen om onbedoelde schade aan de larven te minimaliseren. Dit omvat bij het handmatig dechorionating van de larven (vooral het vermijden van contact met de delicate epitheliale voering van de dooier), arraying larven op de injectieplaat, hun verwijdering van de plaat na injecties en hun montage voor live confocale beeldvorming. Een onvermijdelijk onderdeel van dit protocol is de noodzaak om de liposomen (en eventuele immuunuitdagingen) via micro-injectie te leveren die lokale ontstekingen kunnen veroorzaken en daarom de experimentele uitkomst kunnen beïnvloeden. Micro-injectie in larve zebravissen vereist een zekere mate van training om weefselschade te minimaliseren. In ons werk genereert het genereren van een naaldpuntdiameter van microinjectie van ongeveer 5 μm zeer kleine oppervlakteepitheelschade (zoals blijkt uit een zeer lage expressie van de ontstekingsmarkermatrix metallopeptidase 9 in oppervlakteepitheelcellen in de directe nabijheid van de micro-injectiewond10) bij het injecteren in de achterste hersenventricle van 2 dpf-larven. Deze diameter tip is ook klein genoeg om lekkage van geïnjecteerde inhoud te voorkomen, uit de achterste hersenventrikel, wanneer de micro-injectie naald wordt verwijderd. Het is belangrijk om hier op te merken dat injectievolumes groter dan 2 nL vaak zullen resulteren in een deel van de geïnjecteerde inhoud die door het injectiegat stroomt als gevolg van het overschrijden van het volume van de ventrikel. Een tipdiameter van 5 μm is ook van voldoende grootte om latere immuunuitdagingen te injecteren, zoals MSU-kristallen10. Het afschuinen van de microinjectienaaldpunt tot 45° met een microgrinder om een scherpe punt te genereren, kan zorgen voor een betere penetratie van de buitenste periderm en binnenste basale epitheellagen die de achterste hersenventrikel41bedekken. Het is belangrijk op te merken dat controle injecties zoals die hier gebruikt (dat wil zeggen, controle liposomen) zijn essentieel bij de beoordeling van de effecten van drug-loaded liposomen op macrofaag functie om controle voor het injectieproces zelf. Het selecteren van een concentratie voor een bepaald geneesmiddel bij het formuleren in liposomen is ook een belangrijke stap als gevestigde effectieve drugsconcentraties, wanneer geleverd door onderdompeling, kan verschillen van die nodig zijn bij het gebruik van liposoom-gemedieerde drug levering. Bovendien, bij het gebruik van dit protocol, moet men oppassen niet om de fysischchemische kenmerken van de liposomen post modificatie met poloxamer te veranderen, omdat dit hun biodistributiepatroon kan beïnvloeden.
Een gebied voor modificatie en toekomstige ontwikkeling van dit protocol zal zijn om te onderzoeken waarin verschillende oppervlaktekenmerken aan de liposomen zoals liganden of receptoren om macrofaag targeting en opname verder te verbeteren, of om verschillende immuuncellen, zoals neutrofielen richten. Deze geavanceerde aanpak vereist verdere studies om oppervlaktekenmerken te ontdekken die uniek zijn voor de verschillende zebravis immuuncelcompartimenten, die momenteel slecht worden begrepen. Andere gebieden voor wijziging van dit protocol omvatten de integratie van andere fluorescerende sondes in de liposomen om hun veelzijdigheid uit te breiden (bijvoorbeeld wanneer geïnjecteerd in andere transgene reporter lijnen) en het veranderen van hun fysieke eigenschappen dergelijke grootte en lading42,43. Het zal ook belangrijk zijn om te onderzoeken of verschillende routes van liposoom toediening in verschillende larve stadia hun veelzijdigheid kunnen uitbreiden om extra macrofaagpopulaties, bijvoorbeeld darmepitheelcellen, aan te pakken. In het hier beschreven protocol werden alle injecties uitgevoerd op 2 dpf larven. Tijdens de derde dag van de ontwikkeling van de zebravis een enkele continue lumen van de mond naar anus vormen, na het openen van de mond44. Tegen de vierde dag opent de anus wat resulteert in een volledig open buis bekleed met een gepolariseerd epitheel44. Het zal interessant zijn om te zien of onderdompeling van oudere larven in liposomen het richten van ingekapselde geneesmiddelen op darmepitheliale cellen kan vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen bestaan.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan C.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) en Z.W. (Faculty Research Development Fund van de Universiteit van Auckland). De auteurs bedanken Alhad Mahagaonkar voor deskundig beheer van de zebravis faciliteit, de Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, Universiteit van Auckland voor hulp bij confocale beeldvorming en Graham Lieschke voor gifting de Tg (mpeg1:EGFP) reporter lijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
