Summary
여기서, 우리는 대식세포 혈통 세포에 대한 약물 전달을 표적으로 하기 위한 목적으로 약물로드 리포좀과 그들의 미세 주입을 애벌레 얼룩말어로 합성하는 것을 기술한다.
Abstract
Zebrafish(Danio rerio)유충은 기능적으로 보존된 선천적 면역 계통으로 인해 염증성 질환에 대한 항성 병원체 상호 작용 및 선천성 면역 세포의 기여를 조사하는 인기있는 모델로 개발되었습니다. 그(것)들은 또한 선천적인 면역 세포가 발달 과정을 인도하는 것을 어떻게 돕기 위하여 검토하기 위하여 널리 이용됩니다. 애벌레 얼룩말피시의 광학 투명성 및 유전적 견인성을 활용함으로써, 이러한 연구는 종종 기능적으로 형광으로 표시된 대식세포와 호중구를 그대로 동물 내에서 특성화하는 라이브 이미징 접근법에 초점을 맞춥니다. 다양한 기능성 이질성과 질병 발병기전에서 끊임없이 확장되는 역할로 인해 대식세포는 상당한 주목을 받고 있습니다. 유전자 조작 이외에, 화학적 개입은 지금 애벌레 얼룩말물고기에 있는 대식세포 행동을 조작하고 검토하기 위하여 일상적으로 이용됩니다. 이들 약물의 전달은 전형적으로 직접 침지 또는 미세 주입을 통한 자유 약물의 수동 표적화로 제한된다. 이러한 접근법은 대식세포 거동에 대한 모든 변화가 대식세포 자체에 대한 약물의 직접적인 영향의 결과이며 다른 세포 유형에 직접적인 영향을 미치는 다운스트림 결과가 아니라는 가정에 의존합니다. 여기에서는 약물로드 형광 리포좀을 마이크로 주입하여 애벌레 제브라피시 대식세포에 대한 표적화 약물을 대상으로 하는 프로토콜을 제시합니다. 우리는 poloxamer 188 개량한 약 로드된 청색 형광 리포좀이 호중구가 아니라 대식세포에 의해 쉽게 채택된다는 것을 밝힙니다. 우리는 또한 이 방법으로 전달된 약이 약물의 작용 기계장치와 일치하는 방식으로 대식세포 활동에 영향을 미칠 수 있다는 증거를 제공합니다. 이 기술은 대식세포에 약물의 표적을 보장하고자하는 연구자와 약물이 침수와 같은 전통적인 방법에 의해 전달되기에 너무 독성이있을 때 가치가있을 것입니다.
Introduction
단핵 식세포 시스템은 침입 병원균에 대한 첫 번째 방어선을 제공합니다. 이 시스템은 단핵구, 단핵구 유래 수지상 세포 및 대식세포로 구성되어 있으며, 이는 적극적으로 외래 병원균을 식균화하여 병원균 확산을 제한합니다. 이러한 식균 및 미생물 이펙터 기능 이외에, 수지상 세포 및 대식세포는 또한 적응형 면역 계통을 활성화시키기 위해 사이토카인 생산 및 항원-프리젠테이션이 가능하다1. 이들 세포 중 대식세포는 자가면역 및 감염성 질환에서암2,3,4,5,6,7에이르는 다양한 기능적 이질성 및 다중 염증성 질환에 의한 참여로 인해 특별한 주목을 받고 있다. 대식세포의 가소성과 기능적으로 그들의 조직 환경에 대한 요구에 적응하는 능력은 생체 내에서 이 세포를 직접 관찰하고 심문하는 실험적인 접근법을 필요로 합니다.
애벌레 얼룩말은 생체 내 대식세포의 기능과 가소성을 연구하는 이상적인 모델 유기체이다8. 애벌레 제브라피시의 광학 투명성은 대식세포의 동작을 직접 관찰할 수 있는 창을 제공하며, 특히 대식세포 표시 형질전환 리포터 라인과 결합될 때 더욱 이같이 말합니다. 애벌레 제브라피시의 살아있는 이미징 전위 및 실험적 견인력을 이용하는것은 인간 질병9,10,11, 12,13,14,15와직접적인 관련이 있는 대식세포 기능에 대한 많은 중요한 통찰력을 이끌어 내고 있다. 이러한 연구의 대부분은 또한 제브라피시의 약물 활성의 높은 보존을 활용하고있다 (전체 동물 약물 발견 플랫폼으로 자신의 사용을 뒷받침하는 속성16,17,18),약리학적으로 대식세포 기능을 조작하는 화학 적 개입을 활용하여. 현재까지, 이러한 약리학적 치료는 대부분 침수를 통해 전달되어 왔으며, 이는 수용성 약물을 요구하거나, 또는 자유 약물의 직접 미세 주입에 의해(그림 1A). 이러한 수동 전달 전략의 한계는 대식 세포 기능에 미치는 영향을 평가 하는 것을 배제할 수 있는 오프 대상 효과 및 일반적인 독성을 포함 합니다. 또한, 대 식 세포에 약물 효과 조사 할 때 그것은 약물 이 대식 세포 자체에 행동 또는 더 간접 적인 메커니즘을 통해 알 수 없습니다. 대식세포 기능을 조사하기 위해 유사한 화학 적 개입 연구를 수행 할 때, 우리는 대식 세포에 특별히 약물을 대상으로 저렴하고 간단한 전달 방법을 개발하는 충족되지 않은 필요성이 있음을 인식했다.
리포솜은 단백질, 뉴클레오티드 및 약물화물(19)을캡슐화할 수 있는 현미경, 생체 적합성, 지질 이중층 소포이다. 리포좀의 단일 또는 다층 지질 이중층 구조는 수용성 약물이 통합될 수 있는 수성 내부 루멘을 형성하고 소수성 약물은 지질 막에 통합될 수 있습니다. 또한, 크기, 전하 및 표면 변형을 포함하는 리포좀의 물리화학적 특성은 특정세포(20,21)에그들의 표적화를 맞춤화하도록 조작될 수 있다. 리포솜의 이러한 특징은 그들에게 약물을 전달하고 현재 치료 요법20의정밀도를 향상시키는 매력적인 차량으로 만들었습니다. 리포솜은 대식세포에 의해 자연적으로 식세포화(절제 실험을 위한 대식세포에 특이적으로 클로드로네이트를 전달하는 데 일상적인 사용에 의해 악용되는 특징22),그들은 대식세포 특이적 약물 전달을 위한 매력적인 옵션으로 제시한다(그림1B).
이 프로토콜은 친수성 폴리머 폴록사머(188)로 코팅된 청색 형광 지질종으로 약물의 제형을 설명하고, 이는 리포솜 표면에 보호층을 형성하고 약물 보유를 향상시키고 우수한 생체적합성(23)을갖는다는 것을 나타내었다. 폴록사머는 우리의 이전 연구에서 리포솜의 표면 코팅을 위해 선택되었다, 폴리에틸렌 글리콜 수정 리포좀에 비해, 폴록사머 수정 리포좀은 정맥 주입 다음 토끼에 쥐 발 및 유사한 약동학의 피하 주입 다음 더 나은 생체 적합성을 보였다23. 프로토콜은 또한 유충 제브라피시및 살아있는 이미징으로 의학적 주사를 위해 설명되어 리포좀 분해 및 세포질 약물 전달에 필요한 세포내 구획에 대한 대식세포 표적화 능력 및 국소화를 평가합니다. 개념 증명으로 우리는 이전에 급성 gouty 염증(24)의애벌레 얼룩말 모델에서 자신의 활성화를 억제하기 위해 대식세포에 두 약물을 대상으로이 기술을 사용했다. 이 약물 전달 기술은 관심 있는 약물의 대식세포 타겟팅을 보장하고자 하는 제브라피시 연구원들이 사용할 수 있는 화학 "툴킷"을 확장합니다.
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Protocol
1. 마약이 적재된 마리나 블루 라벨 리포솜의 준비
참고: 청색 형광 염료, 마리나 블루 및 약물을 운반하는 리포좀은 폴록사머 188의 사후 삽입과 함께 박막 수화 방법을 사용하여 제조된다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다. 제어 리포솜은 마리나 블루와 PBS만 운반합니다. 여기서 본 예는 대표적인 개념 증명으로 사용되는 미토콘드리아 표적 항산화제25를 함유하는 리포좀을 로딩하는 것을 설명한다.
- 리포좀을 준비하려면 인지질 1,2-디팔미토일-스네글리세로-3-포스포콜린 16.4 mg(22.2 μmol)을 용해(재료 표참조), 4 .3 mg (11.1 μmol) 콜레스테롤 (재료 표참조) 및 2.8 mg (3.7 μmol) 1,2-디세테로일-스네시로-글리세로-3-포스포콜린(재료 표 참조, 클로로폼 3 mL: 메탄올(3:1 v/v)을 25mL 라운드 바닥 플라스크에 들어있습니다.
- 위의 혼합물에, 마리나 블루 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-인산화탄올아민 31 nmol을 추가하고 (재료 표참조) 및 mROS 억제 약물 300 nmol (재료 표참조) 및 소닉을 짧게 첨가하여 완전히 용해시다. 조절 리포좀의 경우 마리나 블루 1,2-디헥사데카노일-sn-글리세로-포스포에탄올라민만 첨가하십시오.
참고: 빛에 민감한 마리나 블루 형광 염료의 광표백을 피하려면 가능한 한 모든 절차를 빛으로부터 보호하십시오. 이것은 또한 중요 한 경우 로드 될 약물은 빛에 민감한. - 회전식 증발기에서 용매를 천천히 제거합니다(재료 표참조)를 진공 압력하에서 75 rpm으로 회전하여 45°C로 설정된 온도 제어 수조를 통해(20분 동안 200 mbar, 20분 동안 0 mbar). 이는 유기 용매의 완전한 제거를 용이하게 하기 위해N2 하에서 45분 동안 더 건조되는 플라스크의 유리 벽 내에 건조된 얇은 지질 막을 형성한다.
- 박막의 형성 후, 진공 압력을 15 분 동안 40 mbar로 설정한 다음 질소 가스로 30 분 동안 제거하여 잔류 용매를 제거하십시오.
- 1 mL의 인산완충식염수(PBS, pH 7.4)를 사용하여 박막을 수화하고 소포를 형성하기 위해 60°C 수조를 통해 회전 증발기를 사용하여 플라스크를 교반하기 전에 파라필름으로 밀봉합니다.
- 수화된 현탁액을 7사이클로 동결하고 액체N2에 3분간 동결시키고 45°C 수조에 7분간 침지하였다.
- 미니 압출기 (재료 표참조)와 1.0 μm 트랙 에칭 폴리 카보네이트 멤브레인을 사용하여 멤브레인을 통해 리포솜을 2-6 주기 동안 압출하여 큰 단일 소포를 얻습니다.
참고 : 대식세포에 대한 보다 유리한 표적화를 달성하기 위해 리포솜의 직경이 약 1 μm26,27,28이될 때까지 압출 주기를 조작하십시오. - 신선한 리포솜을 186,000 x g에서 초원각으로 펠릿으로 응축시키고 1 mL의 1 mL로 배양하고 1% 폴록사머 188 (재료표참조) 용액 (PBS에서 10 mg/mL) 용액 (PBS에서 10 mg/ mL) 용액 (PBS에서 10 mg/ mL) 용액 (10 mg/mL) 45 °C 및 750 rpm에 2 mL 의 열믹료를 사용하여 30 분 동안 2 mL 마이크로 센트리 퍼머 (tablecentfu) 부착물 (2mL 마이크로 센트리 튜브)를 사용하여.
- 186,000 x g에서 4°C에서 1시간 동안 혼합물을 초원심분리하고 임의의 언바운드 폴리머 또는 약물을 제거하기 위해 상급체를 제거한다. 리포좀 펠릿을 빛으로부터 보호하여 4°C에 보관하십시오.
2. 리포솜 크기와 제타 전위 특성
- 초순수(1:100)로 리포솜 제형을 희석하고 동적 광 산란 분석기(재료 표참조)를 사용하여 리포좀의 입자 크기, 다분산지수(PDI) 및 제타 전위를 25°C에서 3배로 측정합니다.
참고: PDI는 나노입자 집단의 크기 분포를 측정한 값입니다. PDI 값 < 0.05는 보다 균일한 분포를 나타내고 값이 1에 가까울수록 더 큰 크기 분포를 나타냅니다. 제타 전위는 전체 표면 전하입니다.
3. 리포솜의 함정 효율 및 약물 로딩 계산
참고 : 리포솜에서 약물의 함정 효율을 결정하기 위해 상온성 및 리포솜 펠릿에 함유 된 약물 함량을 측정합니다.
- PBS의 1 mL에 리포솜 펠릿을 다시 중단.
- 초순수로 10 x를 희석하고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)로 분석하십시오.
- 리포좀 내의 약물 농도를 결정하려면 100 μL의 리포솜 현탁액을 100 μL의 트리톤-X100 용액 (지질 막을 파괴하고, 포획된 약물을 방출하고 HPLC 컬럼 내에서 지질이 축적되는 것을 방지함)과 소용돌이를 3 분 동안 추가하십시오. 분석하기 전에
- 사분면 펌프, 온도 조절기 자동 샘플러 및 3 μm 250 x 4.6mm 컬럼으로 구성된 HPLC 시스템에 20 μL의 샘플을 주입합니다. 230mMM로 설정된 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 이동 단계(10mM PBS pH 2.5, 아세토니트릴 및 메탄올(30:40:30, v/v/v/v)))를 0.9 mL/min으로 설정하고 스펙트럼 프로파일을 얻습니다.
- 다음 방정식을 사용하여 래트랩 효율(EE) 및 약물 로딩(DL)을 계산합니다.
EE (%) = [나 / 산] x 100
DL (%) = [나/ Mlip] x 100
여기서 나는 캡슐화된 약물의 질량이고, 산은 제제 동안 사용되는 약물의 총 질량이고 Mlip은 지질(콜레스테롤 포함) 및 캡슐화된 약물의 총 질량이다.
4. 리포좀의 준비 및 주입
- micropipette 풀러 장치 (재료표참조)에 얇은 벽 borosilicate 유리 모세관 (1mm O.D. x 0.78 mm i.78 mm i.D. x 10 cm 길이)을 삽입하여 borosilicate 미세 주입 바늘을 준비하십시오 (열 680, 당김 75, 속도 40, 시간 55 및 압력 530).
- 바늘을 모델링 점토에 페트리 접시에 넣고 당겨진 끝이 접시의 바닥에 닿지 않는 방식으로 배열합니다. 사용할 준비가 될 때까지 먼지 오염을 방지하기 위해 페트리 접시 뚜껑을 닫아 두십시오.
- 신선하게 준비된 리포좀 제형을 멸균 PBS(pH 7.4)에서 1:1로 희석하고 잠시 소용돌이(2-3s)를 섞어 섞는다.
참고: 유충이 미세 주입준비가 될 때까지 빛으로부터 리포좀을 보호하십시오. - 전날 밤 성인 제브라피쉬 사육 쌍을 설정하고 로젠 외29에의해 설명된 바와 같이 배아를 수집한다.
- E3 배지(5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4)를함유한 페트리 접시(접시당 약 60개의 배아와 함께 100 mm x 20 mm 스타일)로 배아를 옮기고 0.1% 메틸렌 블루를 보충하여 진균성장을 억제한다. 죽은 배아 또는 비수정 배아를 모두 제거하고 28.5 °C에서 밤새 배양하십시오.
- 살아있는 화상 진찰을 촉진하기 위하여는, 배아가 안료 대형을 방지하기 위하여 발달의 24 시간 도달할 때 E3 매체에 0.003% N-Phenylthiourea (PTU)를 추가하십시오 (melanization).
- 미세 한 팁 집게를 사용 하 여 약 30 시간 후 수정 (hpf)에서 수동으로 배아를 dechorionate.
참고: 이 상피 손상 및 국소 염증을 일으킬 수 있으므로 배아를 초질화하기 위해 효소 치료를 사용하지 마십시오. - 배아를 28.5 °C에서 2일 후 수정 후(dpf)까지 개발하게 하십시오.
- 3% 메틸 셀룰로오스(E3 배지)를 작은 35mm 배양 접시의 뚜껑에 부어 전체 표면을 덮는 박막을 형성하여 사출 플레이트를 준비한다.
참고: E3 매체에 3% 메틸 셀룰로오스를 준비할 때, 메틸 셀룰로오스가 궤도 셰이커에 부드러운 교반으로 용해되는 데 며칠이 걸립니다. - 트리카인의 200 μg/mL로 보충된 E3 매체에서 배양하여 애벌레를 마취시켰다.
- 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 약 20-25 마리의 유충 풀을 수집하고 배아가 중력에 의해 파이펫의 끝에 집중되도록합니다. 최소한의 액체로 애벌레를 옮기도록 주의하면서 35mm 배양 접시 뚜껑 의 중간에 놓습니다.
- 미세 모세관 로더를 사용하여, 다음과 같은 방법으로 유충을 배열: 전방 미세 주입 바늘을 향해 등쪽 표면과 주사 판의 상단을 향해, 뒷뇌 심실로 주입(그림 2A-D); 또는, 주사판의 왼쪽을 향해 앞쪽(오른쪽에서 주입하는 경우)을 미세 주입 바늘을 향하여 부비동 내로 주입하는 복부표면(도 2I).
참고: 이러한 방식으로 주입하면, 뒷뇌 심실-상주(도2E)및 꼬리 조혈 조직(CHT)-상주(도2J)대식세포는 각각 표적화될 수 있다. 애벌레 얼룩말피시의 CHT 지역은 포유류 태아 간과 유사한 조혈 사이트입니다. 이 국소 염증을 일으킬 수 있으므로 준비하는 동안 배아를 손상시키지 않도록 주의하여 면역 학적 연구에 영향을 미칠 수 있습니다. - 신선하게 준비된 리포좀(4.3단계)을 가지고 다시 주사 바늘을 약 5 μL의 리포솜 주입 혼합물로 채우고 미세 모세관 로더를 사용하여 채취합니다(재료 표참조).
참고 : 치골의 식구 구획에 리포좀의 국소화를 평가 할 때(그림 2H),식중독의 붉은 형광 마커의 200 μg / mL이 주입 믹스를 보충 s(재료 표참조) 및 리소좀의 원거리 적색 형광 마커(재료 표 참조)의100 nM은 각각식기30,31 및 리소좀(32)을 표시한다. - 마그네틱 스탠드와 압력 인젝터에 연결된 마이크로 매니더(재료 표참조)에 바늘을 장착합니다(재료 표참조). 입체 현미경 아래에 위치하고 약 50 ms의 펄스 지속 시간과 약 40 psi의 주입 압력으로 인젝터를 설정합니다.
- 미세 한 팁 집게로 미세 주입 바늘의 끝을 잘라 직경 약 5 μm의 개구부를 생성합니다.
- 혈세포계의 격자선 위에 위치한 미네랄 오일 한 방울에 볼러스를 주입하여 주입할 부피를 보정합니다. 볼러스의 직경이 가장 작은 그리드 라인의 2.5를 커버할 때까지 펄스 지속 시간 및/또는 사출 압력을 조정합니다(이는 약 1nL의 부피에 해당).
- 조심스럽게 각 애벌레의 뒷뇌 심실로 리포솜 주입 믹스의 1 nL를 주입.
참고 : 뒷뇌 심실로 주입 할 때 출혈로 이어지는 근본적인 혈관을 방해 할 수 있기 때문에 너무 멀리 통풍관 (뒷뇌 너머)에 침투하지 않도록주의하십시오. 부비동 에 주입 할 때, 바늘의 끝이 심낭 내에 있고 노른자를 관통하지 않도록주의를 기울여야합니다. - 주입 후, 즉시 주입된 유충을 주입 플레이트에 E3 매를 첨가하고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 메틸 셀룰로오스에서 유충을 부드럽게 교반시킴으로써 E3 매체로 다시 이송한다.
- 살아있는 공초점 화상 진찰에 의하여 분석될 때까지 28.5 °C (빛으로부터 보호)에서 애벌레를 배양하십시오.
5. 리포좀의 대식세포 표적화를 확인하기 위한 공초점 이미징 및 이미지 분석
- 수조를 50°C로 가열합니다.
- 0.003% PTU 및 200 μg/mL 트리카인으로 보충된 E3 매체를 함유한 새로운 퍼티 접시로 옮겨 리포솜 주입 유충을 마취시켰다.
- 전자레인지에서 0.003% PTU로 보충된 E3 배지에 1% 낮은 융점 아가로즈를 용해시킴으로써 라이브 이미징 마운팅 매체를 준비합니다. 수조에 놓고 용액이 50 °C로 냉각되면 트리카인 200 μg / mL을 추가하십시오.
- 아가로즈의 조기 중합을 방지하기 위해 50°C 수조에 장착 매체를 유지한다.
- 수중 침지 렌즈를 장착한 공초점 현미경상상(도2E)을상근에 상구한 표면을 이미지화하기 위해, 유충을 다음과 같이 포함시켰다: 35 mm 배양 접시를 장착 매체(약 5 mm 깊이)로 채우고 중합시키게 한다. 노른자 낭을 수용하기에 충분한 크기의 아가로즈에 작은 참호를 발굴.
- 용융 장착 매체와 플라스틱 전송 파이펫을 채우고 소량을 추방하고 마취 된 유충을 수집하는 데 사용합니다. 즉시 배양 접시에 애벌레를 전송하고 노른자 낭, 복부 측면을 아래로, 미세 모세 혈관 로더를 사용하여 발굴 구멍으로 방향을 지정합니다. 아가로즈가 중합될 때까지 주기적으로 이 위치에서 유지합니다. 200 μg/mL 트리카인을 보충한 E3 용지오버레이.
참고: 유충을 옮기고 배치할 때 면역학 연구에 영향을 줄 수 있는 상피 손상 및 국소 염증을 일으키지 않도록 주의하십시오. 상술한 바와 같이 상생하는 충충의위치(도 2J)는유충을 굴착된 구멍 내에 측면으로 위치시켰다. - 거꾸로 된 공초점 현미경으로 이미징할 때, 아가로즈 침대없이 유리 바닥 접시의 바닥에 직접 애벌레를 포함시다. 등지 표면을 (또는 측면으로) 정렬하고 중합 을 한 다음 전체 접시 표면을 마운팅 매체의 균일 한 층으로 덮습니다. 일단 중합되면, 트리카인 200 μg/mL로 보충된 E3 매체의 얇은 층을 추가합니다.
- 공초점 현미경에 뒷뇌 심실을 라이브 이미지로 유지하려면 다음 설정을 사용합니다: 512 x 512 픽셀; 40 x 3 μm Z 스택 (뒷뇌의 등쪽 - 대부분의 표면에서 연장); 20배 목표; 2.5배 줌.
참고 : 샘플 사이의 신호 강도를 비교할 때 (예를 들어 대식세포 [Tg (mpeg1:EGFP)33]또는 호중구[Tg (lyz:EGFP)34]를표시하는 리포터 라인 내에 주입 된 마리나 블루 라벨 리포좀의 섭취를 이미징 할 때 레이저 설정이 동일하게 유지되는 것이 필수적입니다 (예를 들어, 핀홀 직경, 레이저 전압, 오프셋 및 게인)을 통해 변경된 이미지 수집 설정의 아티팩트가 아닌 차이를 보장합니다. - 3D 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 마리나 블루 라벨 리포좀의 대식세포 또는 호중구 섭취를 정량화합니다. Z 스택 내에서 리포솜(그림2F)을함유하는 세포의 수를 정량화하려면 개별 Z 섹션을 스크롤하고 마리나 블루 라벨리포솜을 함유하는 개별 세포의 수를 계산합니다. 세포 내 리포솜의 형광 강도를 정량화하기위해(그림 2G),각 세포 주위의 관심 영역을 그립니다(X, Y 및 Z 치수에서) 세포 내 마리나 블루의 총 형광 강도를 정량화한다.
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Representative Results
약물을 둘러싸는 형광 리포좀의 제조를 위해 여기에 기술된 박막 수화 접근법은 간단하고 비용 효율적인 방법이다. 본 연구에 사용된 프로토콜로, 리포솜은23,24. 생산된 리포좀의 크기, 제타 전위, 약물 로딩 및 포획 효율은 표 1에요약되어 있다. 리포좀의 입자 크기(약물 로딩 전후)는유사하다(표 1). 약물로 충전된 리포좀의 표면 전하(zeta potential)는 대조군 리포좀과 비교할 때 약간 더 중립적이지만, 모두 음전하가 음전하되어 생체 분포 패턴을 크게 변화시키지 않는다는 것을 의미합니다.
마리나 블루 라벨리포솜을 뒷뇌심실로 미세주입하면 3시간 후 주사에 의해 공초점 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있는 상주 대식세포에 의한 신속한 섭취를 초래하며, 대식세포 계보-마킹 형질전환 리포터 라인 Tg(mpeg1:EGFP)33 (그림 2C,E-G)에주입된다. 이는 세포내 리포좀을 함유하는 거의 관찰되지 않는 호중구(lyz:EGFP) 34 리포터 라인 내에 표시되는 호중구와는 대조적이다(도2E-G). 개별 리포솜-라덴 대식세포 내에서, 리포솜은 식염수 구획(그림 2 H) 내에 축적되며, 이는 리포좀 분해 및 세포질 내의 약물 내용물의 후속 방출에필요하다(그림2H). 리포솜 납품을 위한 다른 미세 주입 사이트를 선택하는 것은 어떤 조직 상주 대식세포가 표적으로 하는 영향을 미칠 수 있습니다. 일례로, 뒷뇌 심실로의 전달은 뒷뇌-상주 대식세포(도2D,E)를효율적으로 표적화하면서 부비동 내로 미세주사가 순환을 통해 CHT 상주 대식세포로 리포좀을 전달할 수 있다(도2I,J).
리포솜 전달을 위한 미세 주사 부위의 고려는 조사 중인 특정 대식세포가 약물을 수신하는 것을 보장하는 데 도움이 되기 때문에 면역학적 과제에 대한 대식세포 반응을 심문하기 위해 이 기술을 사용할 때 중요하다. 우리는 정기적으로 뒷뇌 실로 약물로드 리포솜의 전달을 위해이 프로토콜을 사용하여 모노 나트륨 urate (MSU) 결정에 대한 대식세포 반응에 대한 이들 약물의 영향을 평가하기 위해, 유사하게 뒷뇌 구획에 주입(그림 3A). 급성 통풍 염증의 원인인 MSU 결정은 조직 상주 대식세포를 활성화하여 미토콘드리아 반응성 산소 종(mROS)10,36,37,38에의존하는 과정을 통해 인터류핀-1β(IL-1β)를 포함하는 염증성 매개체를 생성한다. 이 활성화된 대식세포는 호중구 침투를 유도합니다, 급성 gouty 염증의 특징. 뒷뇌 심실로 mROS 억제 약물을 적재한 리포좀의 미세 주사는 리포솜-라덴 뒷뇌-상주 대식세포 내에서 MSU 결정 구동 mROS 생산을 현저하게 억제할 수있다(그림 3B-D). 여기에 기재된 프로토콜을 사용하여, 우리는 49.12±0.17%의 포트랩 효율을 달성하였으며, 그 결과 103.05±0.36 μM의 약물 농도를 가진 제형을 초래하였다. 참고, 주입 1 이 농도에서 nL 볼륨 우리의 실험 하는 동안 관찰 독성 결과, 총 형태 변화 또는 심장 마비에 의해 입증. 대식세포 활성화 상태에 대한 이 약물의 억제 효과의 추가 검증은 내부 혼성화(도4A, B)와호중구의 시간적 모집에 의한 il1b 발현(IL-1β의 제브라피시 직교)을 조사함으로써 수행될 수 있다(도4C,D).
그림 1: 애벌레 제브라피시에 대한 리포솜 매개 약물 전달대 기존의 무료 약물 전달을 보여주는 회로도. (a)애벌레 제브라피시에 약물 전달을 위해 일상적으로 사용되는 전략은 주로 무료 약물의 침수 또는 미세 주입에 국한된다. (B)약물로드 리포좀의 미세 주사는 대식세포에 직접 표적화 할 수 있습니다, 여기서 식어 소소말 구획 내에서 리포좀 저하세포약물 전달의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형광 지방체를 사용하여 대식세포에 약물을 표적화. (a)미세주사 바늘(흑색 화살표) 및 유충을 35 mm 조직 배양 접시에 배열하여 3% 메틸셀룰로오스 내에 배열한 미세주입 셋업. (B)A.(C)에서와 같이 배열된 애벌레의 확대된 보기는 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP) 애벌레의 생생한 공초점 이미지, 앞쪽을 왼쪽으로. (D)배열된 애벌레의 확대된 보기, A에서와 같이, 뒷뇌실로 미세 주사를 시연(검은 화살표는 미세 주사 바늘을 표시함). (e) Tg(mpeg1:EGFP) 및 Tg(lyz:EGFP) 애벌레의 뒷뇌 영역의 뒷뇌-상주 대식세포 및 라이브 공초점 이미지(등쪽 보기, 앞쪽 왼쪽)의 표적화, 마리나 블루 라벨리포솜(흰색 화살표)의 3h 후뇌 미세 주사를 따른다. (F 및 G)대식세포 및 호중구에 의한 리포좀 섭취량의 정량화(E에서 검출됨)및 마리나 블루 라벨리포좀의 형광 강도/세포(G)를 포함하는 세포의 수로 측정하였다. (H)Phagosomes의 적색 형광 마커및 Tg (mpeg1:EGFP) 유충 내리리소좀의 원거리 적색 형광 마커로 표시된 뒷뇌 내 리포솜-라덴 대식세포의 살아있는 공초점 이미지, 마리나 블루 라벨리포좀의 3시간 후 뇌 미세주입. (I)배열 된 애벌레의 확대 보기, A에서와 같이, 부비동 venosus에 미세 주입을 보여주는 (검은 화살표 표시 미세 주입 바늘). (J)ChT 상주 대식세포 및 Tg(mpeg1:EGFP) 및 Tg(lyz:EGFP) 유충의 CHT 영역의 CHT 영역의 라이브 공초점 이미지(측면 보기, 왼쪽 앞쪽)의 표적화, 마리나 블루 라벨리포솜의 미세 주사 후 3시간 후 부비동 정맥(흰색 화살표)에 대한 미세 주사를 예시하는 시술적. 오류 막대 는 ± SD. *p<0.05; p < 0.0001, 학생의 t-test. 스케일 바 = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D, I), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J). 이 그림은 이전발행물 24에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: mROS 억제 약물로 로드된 리포좀의 미세 주입은 활성화된 대식세포 내에서 mROS 생산을 억제한다. (A)대식세포에 대한 mROS 억제 약물의 표적화를 예시하고 MSU 결정 자극 에 따른 대식세포 활성화에 미치는 영향을 평가하는 회로도. (B 및 C) Tg(mpeg1:EGFP) 애벌레의 뒷뇌 내 리포좀 함유 대식세포(제어 리포좀/L-C(B) 또는 mROS 억제 리포좀/L-MI(C)의 생생한 공초점 이미지, 또한 형광 mROS 전용 프로브 (형광 신호가 mROS의 높은 수준을 나타내는 따뜻한 색상의 히트 맵으로 표시되는 재료의 표참조), 마리나 블루 라벨 리포솜 및 MSU 결정의 뒷뇌 미세 주입 에 이어 3 시간. 마리나 블루 형광은 회색 조광으로 의사 색입니다. (D)대식세포 내에서 mROS 특이적 프로브의 형광 강도를 정량화하고, B 및 C. 에러 바 디스플레이에서 검출된 바와 같이 ±SD. ****p < 0.0001, 학생의 t-test. 축척 막대 = 10 μm (B). 이 그림은 이전발행물 24에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: mROS 억제제와 함께 로드된 리포좀의 미세 주사는 활성화된 대식세포 및 대식세포 구동 호중구 모집 내에서 il1b 발현을 억제한다. (A) il1b의 발현(검은 색 화살표로 표시됨) 내부 혼성화에서 전체 마운트에 의해 검출된 바와 같이, 뒤뇌 영역 내 3시간 내 의 뒤뇌 미세 주입 제어(L-C) 또는 mROS 억제 리포좀(L-MI) 및 MSU 결정, 전방 좌측. 숫자는 표시된 표현형을 가진 애벌레의 비율을 나타냅니다. (b)a에서 검출된 바와 같이 il1b 발현의 정량화는, 높은, 낮거나 또는 전혀 발현되지 않는 유충으로 나타났다. (C) Tg (lyz:EGFP) 유충의 뒷뇌 영역 내의 호중구의 공초점 이미지 (등쪽 보기, 앞쪽 왼쪽), 면역 형광에 의해 검출 된 바와 같이 3 (3 hpi) 및 6 (6 hpi) h 다음 뒤뇌 미세 주입 L-C 또는 L-MI 및 MSU 결정. (D)C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) 및 9 (9 hpi) h에서 검출 된 바와 같이 호중구의 시간 정량화는 L-C 또는 L-MI 및 MSU 결정의 뒷뇌 미세 주입에 따른다. 오류 막대는 ±SD. ****p < 0.0001, n.s. 유의하지 않음, 단방향 ANOVA, Dunnett의 포스트 혹 검을 표시합니다. 배율 막대 = 100 μm (A), 50 μm (C). 이 그림은 이전발행물 24에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 리포솜의 물리화학적 성질 (L) | 리포좀 제어 | mROS 억제 리포솜 |
| 크기 (μm) | 1.2 ± 0.07 | 1.1 ± 0.04 |
| 제타 전위 (mV) | -25.9 ± 0.57 | -13.0 ± 0.11 |
| 함정 효율(EE, %) | 해당/A | 49.12 ± 0.17 |
| 약물 로딩(DL, %) | 해당/A | 0.37 ± lt;0.01 |
표 1: PBS(대조군) 또는 mROS 억제 리포좀의 물리화학적 특성(데이터는 ±표준 편차, n=3을 의미한다). 모든 리포솜은 마리나 블루로 표시되었습니다.
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Discussion
여기에서, 우리는 애벌레 얼룩말물고기에 있는 대식세포를 구체적으로 표적으로 하기 위하여 약 로드한 리포좀을 공식화하는 상세한 프로토콜을 제공했습니다. 이 방법은 특정 질병 모델에서 대식세포의 역할을 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 약물의 일반적인 독성이 침수와 같은 보다 전통적인 경로에 의해 전달될 때 그들의 사용을 제한할 때 사용될 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 애벌레 제브라피시에서 선천적인 면역 세포를 표적으로 하는 데 사용된 다른 나노미립상산 시스템에 대한 대안을 제공한다. 이들은 항말라리아제 리팜피신을 마이코박테리움 마리눔-감염된대식세포에 표적화하여 서브미크론 크기의 중합체나노입자(39)를사용하여 세균 통관을 촉진한다. 또 다른 예에서, (R)-로스코비틴의 캡슐화, 호중구 아자멸의 유도제, 중합체 내 중합체 내, 호중구에 이 약을 표적으로 하는 것으로 나타났으며, 이에 의해 염증 분해능 을 증진시키는40. 이 프로토콜에서는 비독성, 생체 적합성 및 생분해성 특성으로 인해 리포솜을 약물 전달 수단으로 사용했습니다. 또한, 이들은 비면역원성이며, 이는 여기에 기재된 것과 같은 면역학적 반응을 조사하는데 사용될 때 특히 중요하다. 다양한 화물은 친수성, 소수성, 양과병 및 친유성 약물을 포함하여 운반될 수 있습니다.
이 프로토콜을 수행할 때는 특별한 주의를 기울여야 하는 여러 가지 중요한 단계가 있습니다. 여기에는 유충을 물리적으로 다루고 유충에 의도하지 않은 손상을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 하는 단계가 포함됩니다. 이것은 유충을 수동으로 데코리오네이팅 (특히 노른자의 섬세한 상피 안대기와의 접촉을 피하고), 주사 판에 애벌레를 배열하고, 주사 다음 판에서 제거하고 살아있는 공초점 이미징을 위한 장착을 포함합니다. 이 프로토콜의 피할 수 없는 구성 요소는 liposomes전달 하는 필요 (그리고 어떤 면역 문제) 국소 염증을 일으킬 수 있는 미세 주입을 통해 따라서 실험 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 애벌레 얼룩말물고기로 미세 주입조직 손상을 최소화하기 위해 어느 정도의 훈련이 필요합니다. 우리의 작업에서, 약 5 μm의 미세 주사 바늘 팁 직경을 생성하는 것은 매우 사소한 표면 상피 손상을 생성한다 (미세 주입 상처10의바로 근처에 표면 상피 세포 내에서 염증 마커 매트릭스 metallopeptidase 9의 매우 낮은 발현에 의해 입증된 바와 같이 2 dpf 애벌레의 뒷뇌 심실로 주입할 때. 이 직경 끝은 또한 미세 주입 바늘이 제거될 때, 뒤뇌 심실에서 주입된 내용물의 누설을 피하기 위하여 충분히 작습니다. 여기서 2 nL보다 큰 주사 량은 종종 심실의 부피를 초과한 결과로 주입 구멍을 통해 주입 된 내용물의 일부를 초래할 것이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 팁 직경 5 μm는 또한 MSU 결정10과같은 후속 면역 문제를 주입하기에 충분한 크기이다. 미세사출바늘 팁을 마이크로그라인더로 45°로 베블링하여 날카로운 팁을 생성하도록 하여뒷뇌실(41)을덮는 외부 페라이더럼 및 내부 기저 상피층의 더 나은 침투를 제공할 수 있다. 여기에 사용되는 것과 같은 제어 주사 (즉, 제어 리포솜)는 주사 과정 자체를 제어하는 대식 세포 기능에 약물로드 리포좀의 효과를 평가 할 때 필수적이다. 리포솜으로 공식화 할 때 주어진 약물에 대한 농도를 선택하는 것은 또한 확립 된 효과적인 약물 농도로 중요한 단계이며, 침수에 의해 전달될 때 리포솜 매개 약물 전달을 사용할 때 필요한 것과 다를 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜을 사용할 때, 이것은 그들의 생체 분포 패턴에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 리포솜의 물리 화학적 특성을 폴록사머로 수정후 변경하지 않도록 주의해야 한다.
이 프로토콜의 수정 및 향후 개발을 위한 영역은 대식세포 표적화 및 섭취량을 더욱 향상시키기 위해 리간드 또는 수용체와 같은 리포좀에 상이한 표면 특징을 통합하는 것을 조사하거나 호중구와 같은 상이한 면역 세포를 표적으로 하는 것입니다. 이 진보된 접근은 현재 제대로 이해되지 않는 다른 zebrafish 면역 세포 구획에 유일한 표면 특징을 밝히기 위하여 추가 연구 결과를 요구할 것입니다. 이 프로토콜의 수정을 위한 추가 영역은 그들의 다기능성을 확장하기 위해 리포솜에 다른 형광 프로브의 혼입(예를 들어, 다른 형질전환 리포터 라인에 주입될 때)을 포함하고 그들의 물리적 특성을 변경하는 것을 포함한다42,43. 또한 상이한 애벌레 단계에서 리포솜 투여의 상이한 경로가 장 상피 세포와 같은 추가 대식세포 집단을 표적으로 하는 그들의 다기능성을 확장할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 중요할 것이다. 여기에 상세히 설명된 프로토콜에서, 모든 주사는 2 dpf 애벌레에서 수행되었다. 제브라피쉬 발달의 셋째 날 동안 입에서 항문 형태로 단일 연속 루멘, 입44의개통 에 따른다. 앞으로 항문이 열리면 편광 상피44가늘어선 완전히 개방형 튜브가 생어집니다. 리포솜에 오래된 애벌레의 침지가 장 상피 세포에 캡슐화된 약의 표적화를 촉진할 수 있는지 보는 것은 흥미로울 것입니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 존재하지 않는다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 C.J.H. (뉴질랜드와 마스덴 기금의 건강 연구 위원회, 뉴질랜드 왕립 학회) 및 Z.W. (오클랜드 대학에서 교수 연구 개발 기금)에 수여 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 제브라피시 시설의 전문가 관리를 위한 Alhad Mahagaonkar, 생물 의학 화상 진찰 연구 단위, 의학 과학의 학교, 공초점 화상 진찰을 가진 원조를 위한 오클랜드 대학 및 Tg (mpeg1:EGFP) 기자 라인을 선물을 위한 그레이엄 리슈케에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
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