Summary
ここでは、マクロファージ系細胞への薬物送達を標的とする目的で、薬物を含むリポソームの合成と幼虫ゼブラフィッシュへのマイクロ注入について説明する。
Abstract
ゼブラフィッシュ(Danio rerio)幼虫は、宿主と病原体の相互作用と、機能的に保存された自然免疫系による炎症性疾患への自然免疫細胞の寄与を調べる一般的なモデルに発展した。彼らはまた、自然免疫細胞が発達プロセスを導くのにどのように役立つかを調べるために広く使用されています。幼虫ゼブラフィッシュの光学的透明性と遺伝的なトラクタビリティを利用して、これらの研究は、多くの場合、無傷の動物内の蛍光マークマクロファージおよび好中球を機能的に特徴付けるためのライブイメージングアプローチに焦点を当てています。その多様な機能の異質性と病気の病因の役割が拡大し続けているため、マクロファージは大きな注目を集めています。遺伝子操作に加えて、化学介入は現在、幼虫ゼブラフィッシュのマクロファージ挙動を操作し、調べるために日常的に使用されています。これらの薬物の送達は、典型的には、直接浸漬またはマイクロインジェクションを介して遊離薬物の受動的標的に限定される。これらのアプローチは、マクロファージ行動の変化は、マクロファージ自体に対する薬物の直接的な影響の結果であり、別の細胞タイプに対する直接的な影響の下流の結果ではないという仮定に依存する。ここでは、薬物を含む蛍光リポソームをマイクロ注入することにより、特に幼虫ゼブラフィッシュマクロファージを標的とする薬剤を標的とするプロトコルを紹介します。ポロクサマー188変性薬物搭載青色蛍光リポソームは、好中球ではなくマクロファージによって容易に取り込まれる。我々はまた、このように送達された薬物が薬物の作用機序と一致する方法でマクロファージ活性に影響を与える可能性があるという証拠を提供する。この技術は、マクロファージへの薬物の標的化を確実にしたい研究者や、薬物が毒性が高すぎて浸漬のような伝統的な方法で提供できない場合に価値があります。
Introduction
単核食細胞システムは、侵入病原体に対する防御の第一線を提供する。このシステムは、単球由来の樹状細胞とマクロファージから構成され、外来病原体を積極的に貪食し、病原体の広がりを制限します。これらの貪食作用および微小網エフェクター機能に加えて、樹状細胞およびマクロファージは、サイトカイン産生および抗原提示が適応免疫系を活性化することも可能である1。これらの細胞のうち、マクロファージは、自己免疫や感染症から癌にまで、多くの炎症性疾患に関与する多様な機能の不均一性および関与のために特に注目されている2、3、4、5、6、7。マクロファージの可塑性と組織環境に対するニーズに機能的に適応する能力は、これらの細胞を生体内で直接観察し、尋問するための実験的アプローチを必要とする。
ラーバルゼブラフィッシュは、インビボ8でマクロファージの機能と可塑性を研究するための理想的なモデル生物である。幼虫ゼブラフィッシュの光学的透明性は、特にマクロファージマーキングトランスジェニックレポーターラインと組み合わせた場合に、マクロファージの挙動を直接観察するウィンドウを提供します。生画像化の可能性と幼虫ゼブラフィッシュの実験のトラクチャビリティを利用することは、ヒト疾患9、10、11、12、13、14、15に直接関連するマクロファージ機能に関する多くの重要な洞察を導いた。これらの研究の多くは、ゼブラフィッシュにおける薬物活性の高い保全(動物創薬プラットフォーム16、17、18)としての使用を支える属性)を利用して、薬理学的にマクロファージ機能を操作するための化学的介入を利用している。現在までに、これらの薬理学的治療は、主に水溶性である薬剤を必要とする浸漬、または遊離薬物の直接マイクロ注射によって提供されてきた(図1A)。これらの受動デリバリー戦略の限界には、マクロファージ機能への影響を評価することを妨げる可能性のあるオフターゲット効果および一般的な毒性が含まれる。さらに、 マクロファージに対する薬物の影響を調べる場合、薬物がマクロファージ自体に作用しているのか、それともより間接的なメカニズムを通じて作用しているのかは不明である。マクロファージ機能を調べるのに同様の化学的介入研究を行う際に、マクロファージに特異的に薬物を標的とする安価で簡単な送達方法を開発する必要はないと認識した。
リポソームは、顕微鏡、生体適合性、脂質二重層小胞であり、タンパク質、ヌクレオチドおよび薬物貨物19をカプセル化することができる。リポソームのユニラメラまたはマルチラメラ脂質二重層構造は水溶性薬物を組み込むことができる水性内腔を形成し、一方で疎水性薬物を脂質膜に組み込むことができる。さらに、サイズ、電荷および表面修飾を含むリポソームの物理化学的特性は、それらの標的を特定の細胞20、21に合わせて調整するように操作することができる。リポソームのこれらの特徴は、彼らに薬剤を提供し、現在の治療レジメン20の精度を高めるための魅力的な車両を作りました。リポソームはマクロファージによって自然に貪食される(アブレーション実験22のためにマクロファージにクロドロナートを送達する際の日常的な使用によって利用される特徴)、マクロファージ特異的薬物送達のための魅力的な選択肢として提示される(図1B)。
このプロトコルは、親水性ポリマーポロクサマー188でコーティングされた青色蛍光リポソームへの薬物の製剤を記述し、リポソーム表面に保護層を形成し、薬物保持性を高め、優れた生体適合性23を有することが示されている。ポロクサマーは、我々の以前の研究としてリポソームの表面コーティングのために選ばれた、ポリエチレングリコール修飾リポソームと比較すると、ポロクサマー修飾リポソームは、点滴注入後のウサギの注射におけるラット足および類似の薬物動態の皮下に続くより良い生体適合性を示した23。また、プロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクションとライブイメージングについても説明され、リポソームの分解や細胞質学的薬物送達に必要な細胞内コンパートメントへのマクロファージターゲターゲの能力と局在性を評価します。概念実証として、我々は以前に急性痛風炎症の幼虫ゼブラフィッシュモデルで彼らの活性化を抑制するためにマクロファージに2つの薬物を標的にこの技術を使用しました24.この薬物送達技術は、関心のある薬物のマクロファージターゲを確実にしたいゼブラフィッシュの研究者が利用できる化学的「ツールキット」を拡大する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 薬物を含むマリーナブルーラベルのリポソームの調製
注:青色蛍光色素を担うリポソーム、マリーナブルーおよび薬物はポロクサマー188のポスト挿入を伴う薄膜水和法を用いて調製される。特に指定がない限り、すべての手順は室温で行われます。コントロールリポソームは、マリーナブルーとPBSのみを運びます。ここでの実施例では、概念実証として代表的な結果に使用されるミトコンドリア標的抗酸化薬25を用いたリポソームのロードについて説明する。
- リポソームを調製するには、リン脂質1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(材料表参照)の16.4mg(22.2 μmol)を溶解します。 3 mg (11.1 μmol) コレステロール (材料の表を参照) と 2.8 mg (3.7 μmol) 1,2-ジセテロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (材料の表を参照してください。 クロロホルムの3 mLで:メタノール(3:1 v/v)で25 mLの丸底フラスコで。
- 上記の混合物に、31 nmolのマリーナブルー1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-ホスホエタノールアミン(材料表を参照)および300 nmolのmROS阻害薬(材料表を参照)を加え、短時間超音波処理して完全に溶解させる。コントロールリポソームの場合は、マリーナブルー1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-ホスホエタノールアミンを追加するだけです。
注:光に敏感なマリーナブルー蛍光色素の光を避けるために、可能な限り、光からすべての手順を保護します。これは、ロードされる薬剤が光感受性である場合にも重要です。 - ロータリーエバポレーターで溶媒をゆっくりと取り除き(材料表を参照)、真空圧下で75rpm(15 mbarで20mbar、20分間0 mbar)で回転させて温度管理された水浴を45°Cに設定します。これは、有機溶媒の完全な除去を容易にするために、N2の下で45分間さらに乾燥されるフラスコのガラス壁の中で乾燥薄い脂質膜を形成する。
- 薄膜の形成に続いて、真空圧を15分間40mbarに設定し、窒素ガスで30分間パージして残留溶媒を確実に除去します。
- 1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)を用いて薄膜を水和し、小胞を形成するために60°Cの水浴でフラスコを攪拌する前にパラフィルムで密閉します。
- 水和懸濁液を、液体N2で3分間凍結し、続いて45°Cの水浴に7分間浸漬して凍結し、解凍する7サイクルに対象する。
- ミニ押出機(材料表を参照)と1.0 μmのトラックエッチングポリカーボネート膜(材料表を参照)を使用して膜を通してリポソームを2~6サイクル押し出し、大きな単層小胞を得る。
注:マクロファージに対してより有利なターゲティングを達成するために、リポソームの直径が約1μm26、27、28になるまで押出サイクルを操作します。 - 新鮮なリポソームを186,000 x gの超遠心分離によってペレットに凝縮し、1mLのポロキサマー188(PBSの表を参照)溶液(PBSで10mg/mL)溶液(PBSで10mg/mL)を2mLの微小量体を備えたサーモミキサーを使用して30分間の750rpmでインキュベートします。
- 4 °Cで1時間186,000 x gで混合物を超遠心分離し、非結合ポリマーまたは薬物を除去するために上清を除去する。リポソームペレットを4°Cに保存し、光から保護します。
2. リポソームサイズとゼータポテンシャルの特性
- 超純水(1:100)で薄化リポソーム製剤を用い、動的光散乱分析装置(材料表参照)を用いてリポソームの粒子径、多分散度指数(PDI)およびゼータ電位を測定し、25°Cで三重にします。
注: PDI は、ナノ粒子母集団のサイズ分布の尺度です。PDI 値 < 0.05 は、より均等な分布を示し、1 に近い値は大きなサイズ分布を示します。ゼータ電位は、全体的な表面電荷です。
3. リポソームにおける封じ込め効率と薬物の負荷の計算
注:リポソームにおける薬物の封じ込め効率を決定するために、上清およびリポソームペレットに含まれる薬物含有量を測定する。
- リポソームペレットをPBSの1mLに再懸濁する。
- 上清を取り除き、超純水で10x希釈し、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析します。
- リポソーム内の薬物濃度を決定するには、100 μLのリポソーム懸濁液を10%トリトン-X100溶液の900μLに加え(脂質膜を破壊し、膜を閉じ込め、HPLCカラム内に脂質が蓄積するのを防ぐ)と渦を3分間分析前に。
- 4級ポンプ、サーモスタットオートサンプラー、3 μm 250 x 4.6 mmカラムからなるHPLCシステムに20μLのサンプルを注入します。移動相(10 mM PBS pH 2.5、アセトニトリルおよびメタノール(30:40:30、v/v)))の流量を0.9 mL/v/v)に設定し、230 mMに設定されたダイオードアレイ検出器を使用してスペクトルプロファイルを取得します。
- 次の式を使用して、封じ込め効率 (EE) と薬剤の負荷 (DL) を計算します。
EE (%) = [私/山] x 100
DL(%) = [私/ムリップ] x 100
私がカプセル化された薬物の質量であるところ、Mtは製剤中に使用される薬物の総質量であり、Mlipは脂質(コレステロールを含む)およびカプセル化された薬物の総質量である。
4. リポソームの調製と注入
- 薄い壁のホウケイ酸ガラス毛細管(1mm O.D.x 0.78mm I.D.x 10 cm長さ)をマイクロピペットプーラー装置(材料表を参照)にマイクロピペットプーラー装置(材料表を参照)に挿入してホウケイ酸マイクロインジェクション針を調製し、次の一般的な引き出し器の設定(ヒート680、プル75、速度40、時間55および圧力530)。
- モデリング粘土の上にペトリ皿に針を置き、引っ張られた端が皿の底に触れていないように配置します。使用の準備ができるまで、埃の汚れが出ないようにペトリ皿のふたを閉めておきます。
- 滅菌PBS(pH 7.4)で作製したてのリポソーム製剤1:1を希釈し、短時間ボルテックス(2〜3s)を混合する。
注:幼虫がマイクロインジェクションの準備ができるまで、光からリポソームを保護します。 - 前の晩に成虫ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、以前にローゼンら29で説明したように胚を収集する。
- E3培地(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM KCl、0.33 mM MgSO4)を含むペトリ皿(1皿あたり約60個の胚を持つ100mm x 20mmスタイル)に胚を移し、0.1%メチレンブルーを補充して真菌の成長を阻害する。死んだ胚または未受精の胚をすべて取り除き、28.5 °Cで一晩インキュベートします。
- ライブイメージングを容易にするために、胚が24時間の発生(メラナイゼーション)を防ぐために、胚が発達の24時間に達したときに、E3培地に0.003%N-フェニルチオ尿素(PTU)を加えます。
- 微細な先端鉗子を用いて、受精後約30時間(hpf)で手動で胚を脱エコーする。
注:上皮損傷や局所炎症を引き起こし、免疫学的研究に影響を与える可能性があるので、胚をデコリオネートするために酵素的治療を使用しないでください - 胚を28.5°Cで2日後の受精(dpf)まで発達させる。
- 小さな35mm培養皿の蓋に3%のメチルセルロース(E3培地)を注ぎ、表面全体を覆う薄膜を形成して、注入板を調製する。
注:E3培地で3%メチルセルロースを調製する場合、メチルセルロースが軌道シェーカー上で穏やかに撹拌して溶解するまでに数日かかります。 - トリカインの200 μg/mLを補充したE3培地でインキュベートすることにより幼虫を麻酔する。
- プラスチック移送ピペットを使用して約20〜25幼虫のプールを収集し、胚が重力によってピペットの先端に集中できるようにします。最小限の液体で幼虫を移すのに注意して、35mm培養皿蓋の真ん中に置きます。
- マイクロキャピラリーローダーを使用して、幼虫を次の方法で配置します:後部表面がマイクロ注射針に向かって向いている注射板の上に向かって前に、後脳室に注入する(図2A-D)。または、注射板の左側に向かって(右から注入する場合)、静脈内に注入する微小注射針に向かって腹側表面を向ける(図2I)。
注:このように注射すると、後脳室に居住する(図2E)と尾口造血組織(CHT)-レジデント(図2J)マクロファージをそれぞれ標的とすることができる。幼虫ゼブラフィッシュのCHT領域は、哺乳類の胎児肝臓に類似した造血部位である。これは、それによって免疫学的研究に影響を与える局所炎症を引き起こす可能性があるため、配置中に胚に損傷を与えないように特別な注意を払ってください。 - 作製したリポソーム(ステップ4.3から)を取り、マイクロキャピラリーローダーを使用して約5 μLのリポソーム注入ミックスで注入針をバックフィルします(材料表を参照)。
注:マクロファージの咽頭食分にリポソームの局在性を評価する場合(図2H)、この注射ミックスをファゴソームの赤色蛍光マーカーの200μg/mL(材料表を参照)、およびリソソームの遠い赤色蛍光マーカーの100nM(材料表参照)と100nMで補い、ファゴソーム30、31、およびライソにそれぞれ31を示す。 - 磁気スタンドと圧力インジェクタに接続されたマイクロマニピュレータ(材料表を参照)に針を取り付けます(材料の表を参照)。立体顕微鏡下で位置し、インジェクタを約50msのパルス持続時間と約40psiの射出圧力に設定します。
- 微細な先端の先端を微細な先端鉗子で切り、直径約5μmの開口部を生成します。
- 注入する体積を、ヘモサイトメーターのグリッド線の上に配置された鉱物油の滴にボーラスを注入することによって較正する。パルス持続時間および/または噴射圧力を、ボーラスの直径が最小のグリッド線の2.5をカバーするまで調整します(これは約1nLの体積に相当します)。
- リポソーム注射ミックスの1 nLを各幼虫の後脳室に慎重に注入する。
注:後脳室に注入する場合は、下層血管系が出血につながる可能性がありますので、気通しが遠すぎる(後脳を越えて)浸透しないように注意してください。静脈内に注入する場合は、針の先端が心膜内だけであり、黄身を貫通しないように注意する必要があります。 - 注射後、注射した幼虫を注射プレートにE3培地を加え、プラスチックトランスファーピペットを用いてメチルセルロースから幼虫を静かに攪拌することによって、注射した幼虫をE3培地に戻す。
- 生きた共焦点画像法による分析まで、幼虫を28.5°C(光から保護)でインキュベートします。
リポソームのマクロファージターゲを確認するための共焦点イメージングと画像解析
- 水浴を50°Cに加熱します。
- 0.003%PTUと200 μg/mLトリカインを補充したE3培地を含む新しいペルチ皿に移すことによってリポソーム注入幼虫を麻酔する。
- E3培地に1%の低融点アガロースを溶解して、マイクロ波で0.003%PTUを補ってライブイメージング取り付け媒体を準備する。水浴に入れ、溶液を50°Cに冷却したら、トリカインの200 μg/mLを加えます。
- アガロースの早期重合を防ぐために、50°Cの水浴中に取り付け培地を保管してください。
- 水浸漬レンズを搭載した共焦点顕微鏡で後頭脳の背部表面を画像化するには、幼虫を次のように埋め込みます: 35mm培養皿に取り付け培地を充填し(深さ約5mm程度)、重合させます。卵黄嚢を収容するのに十分な大きさのアガロースの小さなトレンチを掘削します。
- プラスチックトランスファーピペットに溶融取付け媒体を充填し、少量を排出し、麻酔した幼虫を採取するために使用します。すぐに幼虫を培養皿に移し、マイクロキャピラリーローダーを使用して、黄身嚢、腹側を下にして掘削された穴に向けます。アガロースが重合するまで、定期的にこの位置に維持します。200 μg/mL トリカインを補ったE3培地でオーバーレイ。
注:幼虫を転移して位置決めする場合は、免疫学的研究に影響を与える可能性のある上皮損傷および局所的な炎症を引き起こさないことに注意してください。CHT領域を生きた画像に生像する幼虫の位置決め(図2J)については、上述のようにマウントしたが、幼虫を掘削された穴内に横に配置する。 - 逆の共焦点顕微鏡でイメージングする場合は、アガロースベッドなしで幼虫をガラス底皿の底に直接埋め込みます。それらを後面を下に(または横向き)重合に並べ、皿表面全体を取り付け培地の均一な層で覆う。重合したら、200μg/mLのトリカインを添加したE3培地の薄層を加えます。
- 共焦点顕微鏡で後脳室を生画像化するには、以下の設定を使用します: 512 x 512 ピクセル;40 x 3 μm Z スタック (後頭脳の最も後ろの表面から伸びる);20xの目的;2.5倍ズーム。
注:サンプル間の信号強度を比較する場合(例えば、マクロファージをマーキングするレポーターライン内に注入されたマリーナブルーラベルリポソームの取り込み画像を撮るとき [Tg(mpeg1:EGFP)33] または好中球 [Tg(lyz:EGFP)34))は、レーザー設定を同じに保つ (例: ピンホール直径、レーザー電圧、オフセット、ゲイン)を使用して、差異が変更された画像取得設定のアーティファクトではないことを保証します。 - 3D画像解析ソフトウェアを使用して、マリーナブルーラベルリポソームのマクロファージまたは好中球の取り込み量を定量化します。Zスタック内のリポソームを含む細胞数(図2F)を定量化するには、個々のZセクションをスクロールし、マリーナブルー標識リポソームを含む個々の細胞の数をカウントします。細胞内のリポソームの蛍光強度を定量化するために(図2G)、各細胞の周囲の関心領域(X、YおよびZ次元)を描き、細胞内マリーナブルーの蛍光強度の合計または平均を定量する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ここで述べる蛍光リポソーム内包薬の調製に関する薄膜水和法は、簡便で費用効果の高い方法である。本研究で使用されるプロトコルにより、リポソームはユニラメラ23、24であることが期待される。大きさ、ゼータ電位、薬物の装填および封じ込め効率を表1にまとめる。リポソームの粒径(薬物装填前後)は類似している(表1)。薬物を装填したリポソームの表面電荷(ゼータ電位)は、対照リポソームと比較するとわずかに中性であるが、それらはすべて負電荷であり、これは彼らの生体分布パターンを大きく変えないことを意味する。
後脳心室へのマリーナブルー標識リポソームのマイクロ注入により、マクロファージ系マーキングトランスジェニックレポーターラインTg(mpeg1:EGFP)に注入すると、共焦点顕微鏡で観察できる常駐マクロファージによる迅速な取り込みが得られます。これは、細胞内リポソームを含む稀に観察される好中球(好中球特異的Tg(lyz:EGFP)34レポーターライン内でマークされる)とは対照的である(図2E-G)。個々のリポソームを含んだマクロファージ内では、リポソームは、リポソームの分解および後の薬物内容物の細胞質35への放出に必要である咽ソソーム区画(図2H)内に蓄積する。リポソーム送達のための異なる微小注入部位を選択すると、どの組織常駐マクロファージが標的とされているかに影響を与える可能性があります。例として、後脳室への送達は、効率的に後脳内に存在するマクロファージ(図2D,E)を標的とし、一方で、静脈内静脈内への微小注入は循環を介してCHT常駐マクロファージにリポソームを送達することができる(図2I、J)。
リポソーム送達のためのマイクロ注射部位の検討は、調査中の特定のマクロファージが薬物を受けていることを保証するのに役立つため、免疫学的課題に対するマクロファージ応答を問い合わせてこの技術を使用する場合に重要である。我々は、これらの薬物が単一ナトリウム(MSU)結晶に対するマクロファージ応答に及ぼす影響を評価するために、薬物を装填したリポソームを後脳室に送達するためにこのプロトコルを日常的に使用してきた(図3A)。急性痛痛の炎症の原因物質として、MSU結晶は、ミトコンドリア活性酸素種(mROS)10、36、37、38に依存するプロセスを介してインターロイキン-1β(IL-1β)を含む炎症促進メディエーターを産生する組織常駐マクロファージを活性化する。これらの活性化マクロファージは、急性痛痛性炎症の特徴である好中球浸潤を促進する。mROS阻害薬を伴うリポソームを後脳心室に注入すると、リポソームを含んだ後頭脳内マクロファージ内のMSU結晶駆動mROS産生を有意に抑制できる(図3B-D)。ここで説明したプロトコルを使用して、49.12 ± 0.17 %の封じ込め効率を達成し、その結果、薬物濃度が103.05±0.36μMの製剤が得られました。注意すべきは、この濃度で1nL量を注入すると、総形態変化または心停止によって証明されるように、我々の実験中に観察可能な毒性をもたらさなかった。マクロファージ活性化状態に対するこの薬剤の抑制効果のさらなる検証は、il1b発現(IL-1βのゼブラフィッシュオルソログ)を全体の実装でのハイブリダイゼーション(図4A,B)および好中球の経時的な動員によって調べることによって行うことができる(図4C、D)。
図1:従来の遊離薬物送達対リポソーム媒介薬物送達を幼虫ゼブラフィッシュに対して示す模式図。(A)幼虫ゼブラフィッシュへの薬物送達に日常的に使用される戦略は、遊離薬物への浸漬または微小注射に大きく制限される。(B) 薬物を装填したリポソームのマイクロインジェクションはマクロファージに直接標的化することを可能にし、そこで、咽頭分解性のコンパートメント内でリポソームの分解が細胞質の薬物送達をもたらす。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光リポソームを用いたマクロファージへの標的化薬(A) マイクロインジェクションのセットアップは、3%メチルセルロース内の35mm組織培養皿に配列されたマイクロインジェクション針(黒矢印)および幼虫を示す。(B) A. のように配列された幼虫の拡大図 (C) 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP)幼虫の生きた共焦点画像, 左に前.(D)配列された幼虫の拡大図は、Aのように、後脳室への微小注入を示す(黒い矢印はマイクロ注射針を示す)。(E) Tg(mpeg1:EGFP)およびTg(lyz:EGFP)幼虫の後脳領域の生きた共焦点画像(背部図、左から左へ)を標的とする概略図、3hはマリーナブルーラベルのリポソーム(白い矢は脂肪腫を含む)のインドブレインマイクロインジェクション(白い矢は脂肪腫マクロファージを示す)。(FおよびG) マクロファージおよび好中球によるリポソーム取り込みの定量(Eで検出されたように)は、マリーナブルー標識リポソームの(F)および蛍光強度/細胞(G)を含む細胞の数として測定する。(H) 後頭脳内のリポソームを含んだマクロファージの生きた共焦点像は、ファゴソームの赤い蛍光マーカーと、Tg(mpeg1:EGFP)幼虫内のリソソームの遠赤色蛍光マーカー、3時間はマリーナブルー標識リポソームの後頭脳マイクロインジェクションに続く。(I)配列された幼虫の拡大図は、Aのように、静脈内への微小注入を示す(黒い矢印は微小注射針を示す)。(J) ChT常駐マクロファージおよび生きた共焦点画像(横図、左前)のCht領域の標的化を示す模式図(mpeg1:EGFP)およびTg(lyz:EGFP)幼虫、3時間マリーナブルー標識リポソームを鼻静脈内にマイクロインジェクションした後の誤差範囲は平均値を表示します ± SD. *p<0.05;p < 0.0001, スチューデントのt-テスト。スケールバー = 100 mm (A), 100 μm (B), 250 μm (C, D, および I), 10 μm (E), 5 μm (H), 50 μm (J).この図は、前の文書24から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: mROS阻害薬を搭載したリポソームのマイクロインジェクションは、活性化マクロファージ内でのmROS産生を抑制する。(A)マクロファージに対するmROS阻害薬の標的化を示す模式図及びMSU結晶刺激後のマクロファージ活性化への影響を評価する。(BおよびC)リポソームを含んだマクロファージ(コントロールリポソーム/L-C(B)またはmROS阻害リポソーム/L-MI(C))の生きた共焦点画像は、Tg(mpeg1:EGFP)幼虫の後頭脳内に、 また、蛍光mROS特異的プローブ(蛍光シグナルがより高いレベルのmROSを表す暖かい色を持つヒートマップとして表示される材料表を参照)、マリーナブルー標識リポソームおよびMSU結晶の後脳マイクロインジェクションに続く3時間。マリーナブルー蛍光はグレースケールで擬似色で着色されています。(D) マクロファージ内で検出されたmROS特異的プローブの蛍光強度の定量化は、エラーバーの平均±SDを表示します。 スケールバー = 10 μm (B)。この図は、前の文書24から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:mROS阻害剤を搭載したリポソームのマイクロインジェクションは、活性化マクロファージおよびマクロファージ駆動好中球導入におけるil1b発現を抑制する。(A)il1bの発現(黒い矢印)は、その位置ハイブリダイゼーションにおける全台のマウントによって検出されるように、コントロール(L-C)またはmROS阻害リポソーム(L-MI)およびMSU結晶の後頭脳マイクロ注入後の3時間の後脳領域内で、左に前に、数字は、表現型が表示された幼虫の割合を表します。(B) il1b発現の定量は、Aで検出されるように、高い、低い、または無発現を示すパーセントの幼虫として示される。(C) 免疫蛍光3(3hpi)および6(6 hpi)hの後に、L-CまたはL-MIおよびMSU結晶の後方脳マイクロインジェクションに続いて、Tg(lyz:EGFP)幼虫の後脳領域内の好中球の共焦点画像(背部図、左から前へ)h。(D)好中球の時間的定量は、C、1(1 hpi)、3(3 hpi)、6(6 hpi)および9(9 hpi)hの後に続いてL-CまたはL-MIおよびMSU結晶の後頭脳マイクロインジェクションである。誤差範囲は、平均値±SDを表示します±SD; ****p < 0.0001,n.s. 重要ではない、一方向の分散分析、ダネットのポストホックテスト。スケールバー = 100 μm (A), 50 μm (C)。この図は、前の文書24から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| リポソームの物理化学的性質(L) | コントロールリポソーム | mROS阻害リポソーム |
| サイズ(μm) | 1.2 ± 0.07 | 1.1 ± 0.04 |
| ゼータポテンシャル(mV) | -25.9 ± 0.57 | -13.0 ± 0.11 |
| 封じ込め効率 (EE, %) | N/a | 49.12 ± 0.17 |
| 薬物の負荷(DL、%) | N/a | 0.37 ± <0.01 |
表1:PBS(コントロール)またはmROS阻害リポソームの物理化学的特性(データは±標準偏差、n=3)を意味する。すべてのリポソームはマリーナブルーでラベル付けされました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、幼虫ゼブラフィッシュのマクロファージを特異的に標的とする薬物搭載リポソームを処方する詳細なプロトコルを提供しました。この方法は、特定の疾患モデルにおけるマクロファージの役割を解剖するために、特にマクロファージに対する薬物の直接的な標的送達を保証することによって使用することができる。さらに、薬物の一般的な毒性が浸漬のようなより従来の経路によって送達されたときにその使用を制限する場合に使用することができる。ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュの自然免疫細胞を標的にするために使用されている他のナノ粒子系に代わるものを提供する。これらには、抗マラリア薬リファンピシンをマイコバクテリウム・マリナム−感染マクロファージに標的化し、サブミクロンサイズのポリマーナノ粒子39を用いて細菌クリアランスを促進することが含まれる。別の例では、(R)-ロスコビチンのカプセル化は、好中球アポトーシスの誘導物質であり、ポリオソーム内では、この薬剤を好中球に標的とすることが示されており、それによって炎症分解能40を促進する。このプロトコルでは、リポソームを薬物送達の手段として使用しました。さらに、それらは非免疫原性であり、ここで説明するような免疫学的応答を調査するために使用する場合に特に重要である。貨物の範囲はまた、親水性、疎水性、両親媒性および親油性薬物を含んで運ぶことができます。
このプロトコルを実行する場合、いくつかの重要な手順を考慮する必要があります。これには、幼虫が物理的に処理され、幼虫への意図しない損傷を最小限に抑えるために注意を払う必要があるステップが含まれます。これには、幼虫を手動で減エコーする(特に黄身の繊細な上皮の裏地との接触を避ける)、注射板に幼虫を配列する、注射後のプレートからの除去、および生きた共焦点イメージングのための取り付けが含まれる。このプロトコルの避けられない成分は、局所的な炎症を引き起こし、したがって実験結果に影響を与える可能性があるマイクロ注射を通してリポソーム(および任意の免疫課題)を送達する必要性である。幼虫ゼブラフィッシュへのマイクロ注射は、組織の損傷を最小限に抑えるために一定の訓練を必要とします。我々の研究では、約5μmの微小注射針先端の直径を生成すると、2dpf幼虫の後脳室に注入する際に、非常に軽微な表面上皮損傷(表面上皮細胞内の表面上皮細胞内の非常に低い発現によって証明されるように)を生成する2dpf幼虫の後脳室に注入する。この直径の先端はまた、マイクロ注射針が取り外されたときに、後脳室から注入された内容物の漏れを避けるのに十分小さい。ここで重要なのは、2 nLを超える注入量は、多くの場合、心室の体積を超えた結果として注入された内容物の一部が注入孔を通ってあふれることになることに注意することが重要である。5 μmの先端径も、MSU結晶10のようなその後の免疫課題を注入するのに十分な大きさである。鋭利な先端を発生するようにマイクログラインダーでマイクロインジェクション針先端を45°にベベルすると、後脳室41を覆う外側のペライダームおよび内基底上皮層のより良い浸透を提供し得る。ここで使用されるようなコントロール注射(すなわち、コントロールリポソーム)は、注射プロセス自体を制御するマクロファージ機能に対する薬物負荷リポソームの効果を評価する際に不可欠であることに注意することが重要です。リポソームに製剤する際に所定の薬物の濃度を選択することも、確立された有効な薬物濃度として重要なステップであり、浸漬によって送達される場合、リポソーム媒介薬物送達を使用する場合に必要なものとは異なる場合がある。さらに、このプロトコルを使用する場合、これは彼らの生体分布パターンに影響を与える可能性があるため、ポロキサマーによるリポソームの後修飾の物理化学的特性を変更しないように注意する必要があります。
このプロトコルの改変および将来の開発のための領域は、リガンドまたは受容体などのリポソームに異なる表面特徴を組み込んでマクロファージの標的化および取り込みをさらに強化すること、または好中球のような異なる免疫細胞を標的にすることを調査することである。この高度なアプローチは、現在十分に理解されていない異なるゼブラフィッシュ免疫細胞コンパートメントに固有の表面特徴を明らかにするためにさらなる研究を必要とする。このプロトコルの改変のためのさらなる領域は、それらの汎用性を拡大するためにリポソームへの他の蛍光プローブの組み込み(例えば、他のトランスジェニックレポーターラインに注入した場合)およびサイズおよび電荷42、43などの物理的特性を変化させることが含まれる。また、幼虫期の異なるリポソーム投与の異なる経路が、その汎用性を拡大して、例えば腸内上皮細胞などのさらなるマクロファージ集団を標的にできるかどうかを調べることも重要である。ここで詳述するプロトコルでは、全ての注射を2dpf幼虫に対して行った。ゼブラフィッシュ開発の3日目に、口から開口44の後に、口から開いた単一の連続的な内腔を、口から開く。日目までに、開口した開口は、偏光上皮44が並ぶ完全に開いた管をもたらす。リポソームにおける古い幼虫の浸漬が腸上皮細胞へのカプセル化された薬物の標的化を促進できるかどうかを見るのは興味深いだろう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益は存在しないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、C.J.H.(ニュージーランド健康研究評議会、ニュージーランド王立協会マースデン基金)とZ.W.(オークランド大学の教員研究開発基金)に授与された助成金によって支えられました。著者らは、ザルハド・マハガオンカールに対し、ゼブラフィッシュ施設の専門家管理、オークランド大学医学部生物医学イメージング研究ユニットに対し、共焦点イメージングの支援を行い、グラハム・リーシュケがTg(mpeg1:EGFP)記者ラインを贈呈してくれたことに感謝している。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
