Summary
Aquí, describimos la síntesis de liposomas cargados de drogas y su microinyección en peces cebra larvales con el propósito de dirigir la administración de fármacos a células de linaje de macrófagos.
Abstract
Las larvas de pez cebra (Danio rerio) se han convertido en un modelo popular para investigar las interacciones huésped-patógeno y la contribución de las células inmunitarias innatas a la enfermedad inflamatoria debido a su sistema inmunitario innato funcionalmente conservado. También se utilizan ampliamente para examinar cómo las células inmunitarias innatas ayudan a guiar los procesos de desarrollo. Al aprovechar la transparencia óptica y la tractabilidad genética del pez cebra larvaria, estos estudios a menudo se centran en enfoques de imágenes en vivo para caracterizar funcionalmente a los macrófagos y neutrófilos marcados fluorescentemente dentro de los animales intactos. Debido a su diversa heterogeneidad funcional y a su papel en constante expansión en la patogénesis de la enfermedad, los macrófagos han recibido una atención significativa. Además de las manipulaciones genéticas, las intervenciones químicas se utilizan ahora de forma rutinaria para manipular y examinar el comportamiento de los macrófagos en el pez cebra larvario. La administración de estos medicamentos se limita típicamente a la orientación pasiva de drogas libres a través de la inmersión directa o microinyección. Estos enfoques se basan en la suposición de que cualquier cambio en el comportamiento de los macrófagos es el resultado de un efecto directo de la droga en los propios macrófagos, y no una consecuencia posterior de un efecto directo sobre otro tipo de célula. Aquí, presentamos nuestros protocolos para apuntar a medicamentos específicamente a los macrófagos de peces cebra larvarios mediante liposomas fluorescentes cargados de drogas por microinyección. Revelamos que los liposomas fluorescentes azules cargados con drogas modificados por poloxámero s 188 son fácilmente tomados por los macrófagos, y no por los neutrófilos. También proporcionamos evidencia de que los medicamentos entregados de esta manera pueden afectar la actividad de los macrófagos de una manera consistente con el mecanismo de acción de la droga. Esta técnica será de valor para los investigadores que deseen garantizar la orientación de fármacos a los macrófagos y cuando los fármacos son demasiado tóxicos para ser suministrados por métodos tradicionales como la inmersión.
Introduction
El sistema de fagocitos mononucleares proporciona una primera línea de defensa contra los patógenos invasores. Este sistema consiste en monocitos, células dendríticas derivadas de monocitos y macrófagos, que profanan activamente patógenos extraños, limitando así la propagación de patógenos. Además de estas funciones de efector fagocítico y microbicida, las células dendríticas y los macrófagos también son capaces de producir citoquinas y antígeno-presentación para activar el sistema inmune adaptativo1. De estas células, los macrófagos han recibido especial atención debido a su diversa heterogeneidad funcional y su implicación en múltiples enfermedades inflamatorias, desde la autoinmunidad y las enfermedades infecciosas hasta el cáncer2,3,4,5,6,7. La plasticidad de los macrófagos y su capacidad para adaptarse funcionalmente a las necesidades de su entorno tisular requieren enfoques experimentales para observar e interrogar directamente estas células in vivo.
Los peces cebra larvaria son un organismo modelo ideal para estudiar la función y plasticidad de los macrófagos in vivo8. La transparencia óptica del pez cebra larval proporciona una ventana para observar directamente el comportamiento de los macrófagos, especialmente cuando se combina con líneas de reporterotransgénicos que marcan los macrófagos. La explotación del potencial de imagen en vivo y la tractabilidad experimental del pez cebra larval ha dado lugar a muchos conocimientos significativos sobre la función de los macrófagos que tienen relevancia directa para la enfermedad humana9,10,11,12,13,14,15. Muchos de estos estudios también han aprovechado la alta conservación de la actividad farmacológica en el pez cebra (un atributo que sustenta su uso como plataforma entera de descubrimiento de fármacos animales16,17,18), mediante la utilización de intervenciones químicas para manipular farmacológicamente la función de los macrófagos. Hasta la fecha, estos tratamientos farmacológicos se han suministrado en su mayoría ya sea a través de la inmersión, que requiere que el fármaco sea soluble en agua, o mediante la microinyección directa de fármaco libre(Figura 1A). Las limitaciones de estas estrategias de entrega pasiva incluyen efectos fuera del objetivo y toxicidad general que pueden impedir evaluar cualquier impacto en la función de los macrófagos. Además, al investigar los efectos farmacológicos en los macrófagos se desconoce si los fármacos están actuando sobre los propios macrófagos o a través de mecanismos más indirectos. Al realizar estudios de intervención química similares para investigar la función de los macrófagos, reconocimos que había una necesidad insatisfecha de desarrollar un método de administración económico y sencillo para dirigir fármacos específicamente a los macrófagos.
Los liposomas son vesículas bicapas microscópicas, biocompatibles y lipídicas que pueden encapsular proteínas, nucleótidos y carga de fármacos19. La estructura bicapa de lípidos unilamellar o multilamellar de liposomas forma un lumen interno acuoso donde se pueden incorporar fármacos solubles en agua, mientras que los fármacos hidrófobos se pueden integrar en las membranas lipídicas. Además, las propiedades fisicoquímicas de los liposomas, incluyendo el tamaño, la carga y las modificaciones de la superficie se pueden manipular para adaptar su orientación a células específicas20,21. Estas características de los liposomas los han convertido en un vehículo atractivo para suministrar drogas y mejorar la precisión de los regímenes de tratamiento actuales20. Como los liposomas son naturalmente fagocitos por macrófagos (una característica explotada por su uso rutinario en la entrega de clodronato específicamente a macrófagos para experimentos de ablación22), se presentan como una opción atractiva para la administración de fármacos específicos de macrófagos(Figura 1B).
Este protocolo describe la formulación de fármacos en liposomas fluorescentes azules recubiertos con el poloxámero de polímero hidrófilo 188, que forma una capa protectora en la superficie del liposomas y se ha demostrado que mejora la retención de fármacos y tiene una biocompatibilidad superior23. Poloxámero fue elegido para el recubrimiento superficial de liposomas como nuestra investigación anterior había demostrado que, en comparación con los liposomas modificados de polietilenglicol, liposomas modificados de poloxámero mostraron una mejor biocompatibilidad después de la inyección subcutánea de patas de rata y farmacocinética similar en conejos después de la perfusión intravenosa23. También se describen protocolos para su microinyección en peces cebra larvales e imágenes en vivo para evaluar su capacidad de selección de macrófagos y su localización en compartimentos intracelulares necesarios para la degradación de los liposomas y la administración de fármacos citoplasmáticos. Como prueba de concepto hemos utilizado previamente esta técnica para apuntar dos fármacos a los macrófagos para suprimir su activación en un modelo larvario de pez cebra de inflamación aguda de gota24. Esta técnica de administración de fármacos amplía el "kit de herramientas" químico disponible para los investigadores de peces cebra que desean garantizar la meta de los macrófagos de sus fármacos de interés.
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Protocol
1. Preparación de liposomas con etiqueta azul Marina con carga farmacológica
NOTA: Los liposomas que llevan el tinte fluorescente azul, Marina Blue y el medicamento se preparan utilizando un método de hidratación de película delgada con la inserción posterior del poloxámero 188. Todos los procedimientos se realizan a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario. Los liposomas de control solo llevan marina azul y PBS. El ejemplo aquí describe la carga de liposomas con un fármaco antioxidante dirigido a las mitocondrias25 que se utiliza en los resultados representativos como prueba de concepto.
- Para preparar liposomas, disolver 16,4 mg (22,2 émol) de los fosfolípidos 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (ver Tabla de Materiales),4.3 colesterol mg (11,1 émol) (ver Tabla de Materiales) y 2,8 mg (3,7 omol) 1,2-diseteroyl-sn-glicero-3-fosfocolina (ver Tabla de Materiales, en 3 ml de cloroformo:metanol (3:1 v/v) en un matraz de fondo redondo de 25 ml.
- A la mezcla anterior, añadir 31 nmol de Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosfoethanolamine (ver Tabla de Materiales)y 300 nmol de un fármaco inhibidor de mROS (ver Tabla de Materiales)y sonicar brevemente para disolver completamente. Para los liposomas de control, sólo añadir Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-fosfoetanolamina.
NOTA: Para evitar el fotoblanqueo del colorfluorescente sensible Marina Blue, proteja todos los procedimientos de la luz, siempre que sea posible. Esto también es importante si el medicamento a cargar es sensible a la luz. - Retire el disolvente lentamente sobre un evaporador rotatorio (ver Tabla de Materiales)sobre un baño de agua con temperatura controlada ajustado a 45 oC girando a 75 rpm bajo presión de vacío (200 mbar durante 15 min y luego 0 mbar durante 20 min). Esto forma una película lipídica delgada seca dentro de las paredes de vidrio del matraz que se seca aún más durante 45 minutos bajo N2 para facilitar la eliminación completa del disolvente orgánico.
- Después de la formación de la película delgada, ajuste la presión de vacío a 40 mbar durante 15 minutos, luego purgue con gas nitrógeno durante 30 minutos para asegurar la eliminación del disolvente residuo.
- Hidratar la película delgada usando 1 ml de solución salina con fosfato (PBS, pH 7.4) y sellar con parafilm antes de agitar el matraz usando un evaporador rotativo sobre un baño de agua de 60 oC durante 20 minutos para formar vesículas.
- Sujeto la suspensión hidratada a 7 ciclos de congelación y descongelación por congelación en líquido N2 durante 3 min seguido de inmersión en un baño de agua de 45oC durante 7 min.
- Extruir liposomas a través de una membrana utilizando un mini-extrusor (ver Tabla de Materiales)y membranas de policarbonato grabado en pista de 1,0 m (ver Tabla de Materiales)para 2-6 ciclos con el fin de obtener grandes vesículas unilamelares.
NOTA: Con el fin de lograr una orientación más favorable hacia los macrófagos, manipule los ciclos de extrusión hasta que el diámetro de los liposomas sea de aproximadamente 1 m26,27,28. - Condensar los liposomas frescos en un pellet por ultracentrifugación a 186.000 x g e incubar con 1 ml de 1% de poloxámero 188 (ver Tabla de Materiales) solución (10 mg/ml en PBS) a 45 oC y 750 rpm durante 30 min utilizando un termomezclador con un tubo de microcentrúgila de 2 ml (ver Tabla de Materiales).
- Ultracentrifur la mezcla a 186.000 x g durante 1 h a 4 oC y retirar el sobrenadante para eliminar cualquier polímero o medicamento no unido. Almacenar los gránulos liposomas a 4oC, protegidos de la luz.
2. Caracterización del tamaño del liposoma y el potencial Zeta
- Diluir la formulación de liposomas con agua ultrapura (1:100) y medir el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta de los liposomas utilizando un analizador dinámico de dispersión de luz (ver Tabla de Materiales),en triplicado a 25oC.
NOTA: El PDI es una medida de la distribución del tamaño de la población de nanopartículas. Los valores PDI < 0.05 indican una distribución más uniforme, mientras que los valores más cercanos a 1 indican una distribución de mayor tamaño. El potencial zeta es la carga general de la superficie.
3. Cálculo de la eficiencia del atrapamiento y la carga de fármacos en liposomas
NOTA: Para determinar la eficiencia de atrapamiento de fármacos en liposomas, se mide el contenido de fármacos contenidos en el pellet sobrenadante y liposoma.
- Resuspenda el pellet de liposomas en 1 ml de PBS.
- Retire el sobrenadante, diluya 10 x con agua ultrapura y analice mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
- Para determinar la concentración de fármacos dentro de los liposomas, añadir 100 l de suspensión de liposomas a 900 l de solución de 10% triton-X100 (para destruir la membrana lipídica, liberar el fármaco atrapado y prevenir la acumulación de lípidos dentro de la columna HPLC) y vórtice durante 3 minutos antes del análisis.
- Inyectar 20 ml de muestra en un sistema HPLC que consiste en una bomba cuaternaria, un termomuestreador automático de termostato y una columna de 3 mm de 250 x 4,6 mm. Ajuste la velocidad de flujo de fase móvil (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrilo y metanol (30:40:30, v/v/v)) a 0,9 ml/min y obtenga perfiles espectrales utilizando un detector de matriz de diodos de 230 mM.
- Calcule la eficiencia de atrapamiento (EE) y la carga de fármacos (DL) utilizando las siguientes ecuaciones:
EE (%) á [Yo / Mt] x 100
DL (%) á [Me / Mlip] x 100
Donde Me es la masa de fármaco encapsulado, Mt es la masa total de la droga utilizada durante la formulación y Mlip es la masa total de los lípidos (incluyendo el colesterol) y la droga encapsulada.
4. Preparación e inyección de liposomas
- Preparar agujas de microinyección de borosilicato insertando un capilar de vidrio de borosilicato de pared delgada (1 mm D.O. x 0,78 mm I.D. x 10 cm de longitud) en un dispositivo de extracción de micropipeta (ver Tabla de materiales)con los siguientes ajustes genéricos de extracción (calor 680, tire 75, velocidad 40, tiempo 55 y presión 530) para producir una aguja de microinyección cónica.
- Coloque las agujas en una placa Petri sobre la arcilla de modelado y coloque de una manera que el extremo tirado no toque la parte inferior del plato. Mantenga la tapa del plato Petri cerrada para evitar la contaminación por polvo hasta que esté lista para su uso.
- Diluir las formulaciones de liposomas recién preparados 1:1 en PBS estéril (pH 7.4) y brevemente vórtice (2-3 s) para mezclar.
NOTA: Proteja los liposomas de la luz hasta que las larvas estén listas para la microinyección. - Establecer parejas adultas de cría de peces cebra la noche anterior y recoger embriones como se describió anteriormente por Rosen et al.29.
- Transfiera los embriones a una placa Petri (estilo 100 mm x 20 mm con aproximadamente 60 embriones por plato) que contenga un medio E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2,0,33 mM MgSO4)complementado con 0,1% de azul de metileno para inhibir el crecimiento de hongos. Retirar todos los embriones muertos o no fecundados e incubar durante la noche a 28,5 oC.
- Para facilitar la toma de imágenes en vivo, añada 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) al medio E3 cuando los embriones alcancen las 24 horas de desarrollo para prevenir la formación de pigmentos (melanización).
- Decorionar manualmente los embriones a aproximadamente 30 h después de la fertilización (hpf) utilizando fórceps de punta fina.
NOTA: No utilice tratamiento enzimático para desicoquinizar embriones, ya que esto puede causar daño epitelial e inflamación local, lo que influye en los estudios inmunológicos - Dejar que los embriones se desarrollen a 28,5 oC hasta los 2 días posteriores a la fertilización (dpf).
- Preparar una placa de inyección vertiendo suficiente 3% de celulosa metil (en soporte E3) en la tapa de un pequeño plato de cultivo de 35 mm para formar una película delgada que cubra toda la superficie.
NOTA: Al preparar 3% de celulosa metilenente en medios E3, la celulosa metilo tarda varios días en disolverse con agitación suave en un agitador orbital. - Anestetiza las larvas incubando en medios E3 complementado con 200 g/ml de Tricaína.
- Recoger un grupo de aproximadamente 20-25 larvas utilizando una pipeta de transferencia de plástico y permitir que los embriones se concentren en la punta de la pipeta por gravedad. Teniendo cuidado de transferir las larvas con un líquido mínimo, colóquelas en el medio de la tapa del plato de cultivo de 35 mm.
- Usando un cargador microcapilar, organizar las larvas de las siguientes maneras: anterior hacia la parte superior de la placa de inyección con la superficie dorsal mirando hacia la aguja de microinyección, para inyectar en el ventrículo del cerebro trasero(Figura 2A-D); o, anterior a la izquierda de la placa de inyección (cuando se inyecta desde la derecha) con la superficie ventral mirando hacia la aguja de microinyección para inyectar en el venoso sinusal(Figura 2I).
NOTA: Cuando se inyecta de esta manera, se pueden apuntar a los macrófagos residentes en ventrículos hindbrain(Figura 2E)y tejido hematopoyético caudal (CHT)(Figura 2J),respectivamente. La región CHT de pez cebra larvario es un sitio hematopoyético análogo al hígado fetal de los mamíferos. Preste especial atención a no dañar los embriones durante la organización, ya que esto puede causar inflamación local que influye así en los estudios inmunológicos. - Tomar liposomas recién preparados (del paso 4.3) y llenar una aguja de inyección con aproximadamente 5 ol de la mezcla de inyección de liposomas utilizando un cargador microcapilar (ver Tabla de Materiales).
NOTA: Al evaluar la localización de liposomas en los compartimentos fagolysososomal de los macrófagos(Figura 2H),complementar esta mezcla de inyección con 200 g/ml de un marcador fluorescente rojo de fagosomas (ver Tabla de Materiales)y 100 nM de un marcador fluorescente de color rojo lejano de los lisosomas (ver Tabla de Materiales)para marcar los fagosomas30,31 y los sisomas32,respectivamente. - Monte la aguja en un micromanipulador (ver Tabla de Materiales)conectado a un soporte magnético y a un inyector de presión (ver Tabla de Materiales). Coloque bajo un estereomicroscopio y ajuste el inyector a una duración de pulso de aproximadamente 50 ms y una presión de inyección de aproximadamente 40 psi.
- Corte la punta de la aguja de microinyección con fórceps limpios de punta fina para generar una abertura de aproximadamente 5 m de diámetro.
- Calibre el volumen a inyectar inyectando un bolo en una gota de aceite mineral colocada sobre las líneas de la rejilla de un hemocitómetro. Ajuste la duración del pulso y/o la presión de inyección hasta que el diámetro del bolo cubra 2,5 de las líneas de rejilla más pequeñas (esto corresponde a un volumen de aproximadamente 1 nL).
- Inyectar cuidadosamente 1 nL de la mezcla de inyección de liposoma en el ventrículo trasero de cada larva.
NOTA: Al inyectar en el ventrículo del cerebro trasero, tenga cuidado de no penetrar demasiado ventralmente (más allá del cerebro trasero) ya que esto puede interrumpir la vasculatura subyacente que conduce a hemorragias. Al inyectar en el venoso sinusal, se debe tener cuidado para asegurarse de que la punta de la aguja está justo dentro del pericardio y no penetrar la yema. - Después de la inyección, transfiera inmediatamente las larvas inyectadas de nuevo a los medios E3 añadiendo medios E3 a la placa de inyección y agitando suavemente las larvas fuera de la celulosa de metilo utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
- Incubar las larvas a 28,5 oC (protegidas de la luz) hasta el análisis por imágenes confocales vivas.
5. Imágenes confocales y análisis de imágenes para confirmar la segmentación de macrófagos de liposomas
- Calentar un baño de agua a 50 oC.
- Las larvas inyectadas con liposomas anestetizas mediante la transferencia a una nueva placa Perti que contiene medios E3 complementados con 0,003% de PTU y 200 g/ml de tricaína.
- Preparar el medio de montaje de imágenes en vivo disolviendo 1% de agarosa de bajo punto de fusión en medios E3, complementado con 0.003% PTU, en un microondas. Colocar en el baño de agua y una vez que la solución se haya enfriado a 50 oC, añadir 200 g/ml de tricaína.
- Conservar el medio de montaje en el baño de agua de 50oC para evitar la polimerización prematura de la agarosa.
- Para tomar una imagen de la superficie dorsal del cerebro trasero en un microscopio confocal equipado con una lente de inmersión en agua(Figura 2E),incruste las larvas de la siguiente manera: Llene un plato de cultivo de 35 mm con el medio de montaje (a una profundidad de aproximadamente 5 mm) y déjelo polimerizar. Excava rinde una pequeña zanja en la agarosa que es de tamaño suficiente para acomodar el saco de yema.
- Llene una pipeta de transferencia de plástico con un medio de montaje fundido, expulse una pequeña cantidad y utilícela para recoger las larvas anestesiadas. Transfiera inmediatamente las larvas al plato de cultivo y oriente los sacos de yema, lado ventral hacia abajo, en los agujeros excavados, utilizando un cargador microcapilar. Manténgalos periódicamente en esta posición hasta que la agarosa se polimerice. Superposición con medios E3 complementados con 200 g/ml de tricaína.
NOTA: Al transferir y colocar larvas, tenga cuidado de no causar daño epitelial e inflamación local que puede influir en los estudios inmunológicos. Para el posicionamiento de las larvas a la imagen viva de la región CHT(Figura 2J), montar como se describió anteriormente, pero colocar las larvas dentro del agujero excavado lateralmente. - Al tomar imágenes en un microscopio confocal invertido, incruste las larvas, sin el lecho de agarosa, directamente en la parte inferior de un plato inferior de vidrio. Colóquelos en la superficie dorsal hacia abajo (o lateralmente) y después de la polimerización, cubra toda la superficie del plato con una capa uniforme de medio de montaje. Una vez polimerizado, añadir una capa delgada de medios E3 complementado con 200 g/ml de tricaína.
- Para ver en vivo el ventrículo hindbrain en un microscopio confocal, utilice los siguientes ajustes: 512 x 512 píxeles; 40 x 3 ám de z-pilas (que se extienden desde la superficie dorsal más dorsal del cerebro trasero); Objetivo 20x; Zoom de 2.5x.
NOTA: Al comparar las intensidades de la señal entre muestras (por ejemplo, al tomar imágenes de la adopción de liposomas con etiqueta Marina Blue inyectados dentro de líneas de reportero que marcan macrófagos [Tg(mpeg1:EGFP)33] o neutrófilos [Tg(lyz:EGFP)34]),es esencial que la configuración del láser se mantenga igual (por ejemplo, diámetro del agujero, voltaje láser, desplazamiento y ganancia) para ayudar a asegurar que las diferencias no son un artefacto de ajustes alterados de adquisición de imágenes. - Utilice el software de análisis de imágenes 3D para cuantificar la captura de macrófagos o neutrófilos de liposomas etiquetados por Marina Blue. Para cuantificar el número de células que contienen liposomas(Figura 2F) dentro de una pila Z, desplácese por las secciones Z individuales y cuente el número de células individuales que contienen liposomas etiquetados en azul marina. Para cuantificar la intensidad de fluorescencia de los liposomas dentro de las células(Figura 2G),dibuje una región de interés alrededor de cada célula (en las dimensiones X, Y y Z) para cuantificar la intensidad total o media de fluorescencia del azul marina intracelular.
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Representative Results
El enfoque de hidratación de película delgada descrito aquí para la preparación de liposomas fluorescentes que encierran fármacos es un método simple y rentable. Con el protocolo utilizado en este estudio, se espera que los liposomas sean unilamellar23,24. El tamaño, el potencial zeta, la carga de fármacos y la eficiencia de atrapamiento de los liposomas producidos se resumen en la Tabla 1. El tamaño de partícula de los liposomas (antes y después de la carga del fármaco) es similar (Tabla 1). La carga superficial (potencial zeta) de liposomas cargados por drogas es ligeramente más neutra en comparación con los liposomas de control, sin embargo, todos se cargan negativamente lo que significa que esto no cambiará significativamente su patrón de biodistribución.
La microinyección de liposomas con etiqueta marina en azul en el ventrículo trasero da como resultado una rápida adopción por los macrófagos residentes que pueden ser observados fácilmente por microscopía confocal por 3 h después de la inyección, cuando se inyectan en la línea de reportero transgénica de marcado de linaje de macrófagos Tg(mpeg1:EGFP)33 (Figura 2C,E-G). Esto contrasta con los neutrófilos (marcados dentro de la línea de reportero Tg(lyz:EGFP)34 específica de los neutrófilos) que rara vez se observan conliposomas intracelulares(Figura 2E-G). Dentro de los macrófagos individuales cargados de liposomas, los liposomas se acumulan dentro de los compartimentos fagolysosomal(Figura 2H),que es necesario para la degradación de los liposomas y la posterior liberación de su contenido de fármacos en el citoplasma35. La selección de diferentes sitios de microinyección para la administración de liposomas puede afectar a qué macrófagos residentes en el tejido están dirigidos. Como ejemplos, la entrega en el ventrículo trasero del cerebro posterior se dirige eficientemente a los macrófagos residentes en el cerebro trasero(Figura 2D,E) mientras que la microinyección en el venoso sinusal puede entregar los liposomas a los macrófagos residentes en CHT a través de la circulación(Figura 2I,J).
La consideración del sitio de microinyección para la administración de liposomas es importante cuando se utiliza esta técnica para interrogar la respuesta de los macrófagos a un desafío inmunológico, ya que ayuda a garantizar que los macrófagos particulares bajo investigación están recibiendo el medicamento. Hemos utilizado rutinariamente este protocolo para la administración de liposomas cargados con drogas en el ventrículo trasero para evaluar el impacto de estos fármacos en la respuesta de los macrófagos a los cristales de urate monosódico (MSU), inyectados de forma similar en el compartimento del cerebro trasero(Figura 3A). Como agente causal de la inflamación aguda de la gologia, los cristales de MSU activan los macrófagos residentes en los tejidos para producir mediadores proinflamatorios, incluyendo Interleucina-1o (IL-1o) a través de un proceso dependiente de las especies de oxígeno reactivo mitocondrial (mROS)10,36,37,38. Estos macrófagos activados entonces impulsan la infiltración de neutrófilos, un sello distintivo de la inflamación aguda de la gota. La microinyección de liposomas cargados con un fármaco inhibidor de mROS en el ventrículo trasero puede suprimir significativamente la producción de mROS impulsado por cristal de MSU dentro de los macrófagos residentes en el cerebro trasero cargados de liposomas(Figura 3B-D). Utilizando el protocolo descrito aquí, logramos una eficiencia de atrapamiento de 49,12 a 0,17 %, lo que dio lugar a una formulación con una concentración de fármacos de 103,05 a 0,36 m. Cabe destacar que la inyección de un volumen de 1 nL a esta concentración no dio lugar a toxicidad observable durante nuestros experimentos, como lo demuestran los cambios morfológicos graves o el paro cardíaco. La validación adicional de los efectos supresores de este fármaco en el estado de activación de los macrófagos se puede realizar investigando la expresión il1b (el ortolog de pez cebra de IL-1o) por hibridación in situ de montaje completo(Figura 4A,B)y el reclutamiento temporal de neutrófilos (Figura 4C,D).
Figura 1: Esquema que ilustra la administración de fármacos libres convencionales frente a la administración de fármacos mediados por liposomas al pez cebra larvaria. (A) Las estrategias utilizadas habitualmente para la administración de medicamentos a peces cebra larvarios se limitan en gran medida a la inmersión o microinyección de drogas libres. (B) La microinyección de liposomas con carga farmacológica permite la orientación directa a los macrófagos, donde la degradación de los liposomas dentro de los compartimentos fagolysosomal da como resultado la administración de fármacos citoplasmáticos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Dirigir fármacos a macrófagos usando liposomas fluorescentes. (A) Configuración de microinyección que muestra la aguja de microinyección (flecha negra) y larvas en un plato de cultivo de tejido de 35 mm dentro de 3% metilcelulosa. (B) Vista ampliada de larvas arrayadas como en A. (C) Imagen confocal viva de 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP) larvas, anteriores a izquierda. (D) Vista ampliada de larvas en conjunto, como en A, que demuestra la microinyección en el ventrículo del cerebro trasero (flecha negra marca la aguja de microinyección). (E) Esquema que ilustra la orientación de macrófagos residentes en el cerebro trasero y las imágenes confocales en vivo (vistas dorsales, de anterior a izquierda) de la región del cerebro trasero de las larvas Tg(mpeg1:EGFP) y Tg(lyz:EGFP), 3 h después de la microinyección del cerebro trasero de liposomas marcados con Marina Blue (las flechas blancas marcan los macrogrifos cargados de liposoma). (F y G) Cuantificación de la ingesta de liposomas por macrófagos y neutrófilos (como se detecta en E), medida como el número de células que contienen (F) y la intensidad/célula de fluorescencia (G) de los liposomas marcados en azul Marina. (H) Imagen confocal viva de macrófago cargado de liposomas dentro del cerebro trasero marcado con un marcador fluorescente rojo de fagosomas y un marcador fluorescente muy rojo de lisosomas dentro de las larvas de Tg(mpeg1:EGFP), 3 h después de la microinyección del cerebro trasero de liposomas etiquetados Marina Blue. (I) Vista ampliada de larvas arrayed, como en A, demostrando microinyección en el venoso sinusal (flecha negra marca la aguja de microinyección). (J) Esquema que ilustra la orientación de macrófagos residentes en CHT e imágenes confocales en vivo (vistas laterales, de anterior a izquierda) de la región CHT de las larvas Tg(mpeg1:EGFP) y Tg(lyz:EGFP), 3 h después de la microinyección de liposomas marcados con Marina Blue en el sinusvenosus (flechas blancas marcan macrófagos con labiomas). Media de visualización de las barras de error: SD. *p<0.05; p < 0.0001, Prueba tdel estudiante. Barras de escala a 100 mm (A), 100 m (B), 250 m (C, D e I), 10 m (E), 5 m (h), 50 m (J). Esta cifra ha sido modificada de la publicación anterior24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La microinyección de liposomas cargados con un fármaco inhibidor de mROS suprime la producción de mROS dentro de los macrófagos activados. (A) Esquema que ilustra la orientación de un fármaco inhibidor de mROS a los macrófagos y evalúa su impacto en la activación de los macrófagos después de la estimulación del cristal de MSU. (B y C) Imágenes confocales en vivo de macrófagos cargados de liposomas (liposomas de control/L-C (B) o liposomas inhibidores de mROS/L-MI(C)) dentro del cerebro posterior de las larvas de Tg(mpeg1:EGFP), también marcado con una sonda fluorescente específica de mROS (ver Tabla de Materiales,donde la señal fluorescente se muestra como un mapa de calor con colores cálidos que representan niveles más altos de mROS), 3 h después de la microinyección del cerebro trasero de liposomas con etiqueta Azul Marina y cristales MSU. La fluorescencia Marina Blue es pseudocoloren escala de grises. (D) Cuantificación de la intensidad de fluorescencia de la sonda específica de mROS dentro de los macrófagos, tal como se detecta en B y C. La media de visualización de las barras de error es SD. ****p < 0.0001, Prueba tdel estudiante. Barra de escala a 10 m (B). Esta cifra ha sido modificada de la publicación anterior24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La microinyección de liposomas cargados con un inhibidor de mROS suprime la expresión il1b dentro de los macrófagos activados y el reclutamiento de neutrófilos impulsado por macrófagos. (A) Expresión de il1b (marcada por flechas negras), detectada por la hibridación in situ de montaje completo, dentro de la región del cerebro trasero 3 h después de la microinyección del cerebro trasero de control (L-C) o liposomas inhibidores de mROS (L-MI) y cristales MSU, anteriores a izquierda. Los números representan la proporción de larvas con fenotipos mostrados. (B) Cuantificación de la expresión il1b, tal como se detecta en A, mostrada como porcentaje de larvas que demuestran una expresión alta, baja o nula. (C) Imágenes confocales de neutrófilos dentro de la región del cerebro trasero de larvas tg(lyz:EGFP) (vistas dorsales, de antes a la izquierda), detectadas por inmunofluorescencia 3 (3 hpi) y 6 (6 hpi) h tras la microinyección del cerebro trasero de cristales L-C o L-MI y MSU. (D) Cuantificación temporal de neutrófilos, detectada en C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) y 9 (9 hpi) h tras la microinyección de cerebro trasero de cristales L-C o L-MI y MSU. La media de visualización de las barras de error es SD. ****p < 0.0001, n.s. no significativa, ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Dunnett. Barras de escala a 100 m (A), 50 m (C). Esta cifra ha sido modificada de la publicación anterior24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Propiedad fisicoquímica de liposomas (L) | Controlar liposomas | liposomas inhibidores de mROS |
| Tamaño (m) | 1,2 á 0,07 | 1,1 a 0,04 |
| Potencial Zeta (mV) | -25,9 a 0,57 | -13,0 a 0,11 |
| Eficiencia de atrapamiento (EE, %) | N/A | 49,12 a 0,17 |
| Carga de fármacos (DL, %) | N/A | 0,37 á <0.01 |
Tabla 1: Características fisicoquímicas de los liposomas inhibidores de PBS (control) o mROS (los datos son medios de desviación estándar, n a 3). Todos los liposomas fueron etiquetados con Marina Blue.
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Discussion
Aquí, hemos proporcionado un protocolo detallado para formular liposomas cargados con fármacos para apuntar específicamente a los macrófagos en peces cebra larvales. Este método se puede utilizar para diseccionar el papel de los macrófagos en ciertos modelos de enfermedades garantizando la administración directa dirigida de medicamentos específicamente a los macrófagos. Además, se puede utilizar cuando la toxicidad general de los medicamentos limita su uso cuando se administra por rutas más convencionales, como la inmersión. El protocolo descrito aquí proporciona una alternativa a otros sistemas de nanopartículas que se han utilizado para atacar células inmunitarias innatas en peces cebra larvales. Estos incluyen apuntar al fármaco antipalúdico rifampicina a Mycobacterium marinum-macrophages infectados para promover el aclaramiento bacteriano utilizando nanopartículas poliméricas de tamaño sub-micron39. En otro ejemplo, se ha demostrado que la encapsulación de (R)-roscovitatina, un inductor de apoptosis neutrófila, dentro de los polímeros, dirige este fármaco a los neutrófilos, promoviendo así la resolución de la inflamación40. En este protocolo, hemos utilizado liposomas como vehículo para la administración de fármacos debido a sus propiedades no tóxicas, biocompatibles y biodegradables. Además, no son inmunogénicos, lo que es de particular importancia cuando se utilizan para investigar las respuestas inmunológicas, como las descritas aquí. Una gama de cargas también se pueden llevar incluyendo fármacos hidrófilos, hidrófobos, anfipáticos y lipofílicos.
Al realizar este protocolo, hay una serie de pasos críticos donde se debe tener especial cuidado. Estos incluyen pasos donde las larvas se manipulan físicamente y se debe tener cuidado para minimizar cualquier daño involuntario a las larvas. Esto incluye al desconforionar manualmente las larvas (especialmente evitar el contacto con el delicado revestimiento epitelial de la yema), la matriz de larvas en la placa de inyección, su eliminación de la placa después de las inyecciones y su montaje para imágenes confocales en vivo. Un componente inevitable de este protocolo es la necesidad de entregar los liposomas (y cualquier desafío inmune) a través de la microinyección que puede causar inflamación local y por lo tanto puede influir en el resultado experimental. La microinyección en el pez cebra larvaria requiere un cierto grado de entrenamiento para minimizar el daño tisular. En nuestro trabajo, la generación de un diámetro de punta de aguja de microinyección de aproximadamente 5 m genera un daño epitelial superficial muy menor (como lo demuestra la expresión muy baja de la matriz marcadora inflamatoria metalopeptidasa 9 dentro de las células epiteliales de superficie en las inmediaciones de la herida de microinyección10) al inyectar en el ventrículo cerebral de larvas de 2 dpf. Esta punta de diámetro también es lo suficientemente pequeña como para evitar fugas de contenido inyectado, fuera del ventrículo del cerebro trasero, cuando se retira la aguja de microinyección. Es importante tener en cuenta aquí que los volúmenes de inyección superiores a 2 nL a menudo darán lugar a que algunos de los contenidos inyectados se desborden a través del orificio de inyección como resultado de exceder el volumen del ventrículo. Un diámetro de punta de 5 m también es de tamaño suficiente para inyectar los desafíos inmunes posteriores, tales como cristales MSU10. Biselar la punta de la aguja de microinyección a 45o con un microgrinder para generar una punta afilada puede proporcionar una mejor penetración del periderm exterior y de las capas epiteliales basales internas que cubren el ventrículo41del cerebro trasero. Es importante tener en cuenta que las inyecciones de control como las utilizadas aquí (es decir, liposomas de control) son esenciales al evaluar los efectos de los liposomas cargados con fármacos en la función de los macrófagos para controlar el proceso de inyección en sí. La selección de una concentración para un medicamento dado al formular en liposomas también es un paso importante, ya que las concentraciones de fármacos eficaces establecidas, cuando se administran por inmersión, pueden diferir de las necesarias cuando se utiliza la administración de fármacos mediados por liposomas. Además, al utilizar este protocolo, se debe tener cuidado de no alterar las características fisicoquímicas de los liposomas después de la modificación con poloxámero, ya que esto puede afectar a su patrón de biodistribución.
Un área de modificación y desarrollo futuro de este protocolo será investigar la incorporación de diferentes características superficiales a los liposomas como ligandos o receptores para mejorar aún más la orientación y la admisión de macrófagos, o para apuntar a diferentes células inmunes, como los neutrófilos. Este enfoque avanzado requerirá más estudios para descubrir características superficiales que son únicas para los diferentes compartimentos de células inmunitarias de peces cebra, que actualmente se entienden mal. Otras áreas para la modificación de este protocolo incluyen la incorporación de otras sondas fluorescentes en los liposomas para ampliar su versatilidad (por ejemplo, cuando se inyectan en otras líneas de reportero transgénico) y alterar sus propiedades físicas tales tal tamaño y carga42,43. También será importante examinar si las diferentes vías de administración de liposomas en diferentes etapas larvales pueden ampliar su versatilidad para dirigirse a poblaciones adicionales de macrófagos, por ejemplo, células epiteliales intestinales. En el protocolo detallado aquí, todas las inyecciones se realizaron en larvas de 2 dpf. Durante el tercer día de desarrollo del pez cebra se forma un solo lumen continuo de la boca a la forma del ano, tras la apertura de la boca44. Al cuarto día se abre el ano dando como resultado un tubo completamente abierto forrado con un epitelio polarizado44. Será interesante ver si la inmersión de larvas más viejas en liposomas puede facilitar la focalización de fármacos encapsulados a las células epiteliales intestinales.
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Disclosures
Los autores declaran que no existen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones otorgadas a C.J.H. (Consejo de Investigación de la Salud de Nueva Zelanda y Fondo Marsden, Royal Society of New Zealand) y Z.W. (Faculty Research Development Fund de la Universidad de Auckland). Los autores agradecen a Alhad Mahagaonkar por la gestión experta de las instalaciones de pez cebra, la Unidad de Investigación de Imágenes Biomédicas, la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Auckland por su ayuda con las imágenes confocales y Graham Lieschke por regalar la línea de reporteros Tg(mpeg1:EGFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
