Summary
在这里，我们描述了药物加载脂体及其显微注射到幼虫斑马鱼的合成，目的是将药物输送到巨噬细胞。
Abstract
斑马鱼 （Danio rerio） 幼虫已经发展成为一个流行的模型，研究宿主-病原体相互作用和先天免疫细胞对炎症性疾病的贡献，由于其功能保守的先天免疫系统.它们还广泛用于研究先天免疫细胞如何帮助指导发育过程。通过利用幼虫斑马鱼的光学透明度和遗传可采性，这些研究通常侧重于活成像方法，以功能特征表荧光标记巨噬细胞和中性粒细胞在完整的动物。由于其在疾病发病机制中各异质性和不断扩大的作用，巨噬细胞受到广泛关注。除了基因操作，化学干预现在经常被用来操纵和检查幼虫斑马鱼的巨噬细胞行为。这些药物的输送通常仅限于通过直接浸泡或显微注射被动地瞄准免费药物。这些方法依赖于以下假设：对巨噬细胞行为的任何变化都是药物对巨噬细胞本身的直接影响的结果，而不是对另一种细胞类型的直接影响的下游后果。在这里，我们提出我们的方案，通过显微注射药物加载荧脂体，专门针对幼斑马鱼巨噬细胞的药物。我们揭示，波罗夏默188改性药物加载蓝色荧光脂质体很容易被巨噬细胞，而不是中性粒细胞。我们还提供了证据，证明以这种方式交付的药物可以按照药物作用机制的方式影响巨噬菌体活动。这项技术对于研究人员来说，如果能够确保药物针对巨噬细胞，当药物毒性太大，无法通过浸泡等传统方法输送时，这项技术将有价值的。
Introduction
单核噬菌体系统为抵御入侵病原体提供了第一道防线。该系统由单核细胞、单核衍生树突细胞和巨噬细胞组成，它们对外来病原体进行积极的噬菌体，从而限制病原体的传播。除了这些噬菌体和微生物效应器功能外，树突状细胞和巨噬细胞还能够产生细胞因子和抗原，以激活适应性免疫系统1。在这些细胞中，巨噬细胞由于功能异质性不同，并参与多种炎症性疾病而受到特别关注，从自身免疫和传染病到癌症2、3、4、5、6、7。巨噬细胞的可塑性及其在功能上适应组织环境需求的能力，需要采用实验方法直接观察和询问体内的这些细胞。
幼虫斑马鱼是研究体内巨噬细胞功能和可塑性的理想模型生物。幼虫斑马鱼的光学透明度为直接观察巨噬细胞的行为提供了一个窗口，特别是当与巨噬细胞标记转基因报告线结合时。利用幼虫斑马鱼的活成像潜力和实验可采性，对与人类疾病9、10、11、12、13、14、15直接相关的巨噬菌体功能提出了许多重要的见解。其中许多研究还利用斑马鱼药物活性的高保护（一个属性，支撑了它们作为整个动物药物发现平台16，17，18），利用化学干预药理作用操纵巨噬细胞功能。迄今为止，这些药理治疗主要通过浸泡（要求药物是水溶性的）或直接微注射免费药物（图1A）来提供。这些被动分娩策略的局限性包括脱靶效应和一般毒性，可能妨碍评估对巨噬菌体功能的任何影响。此外，在调查药物对巨噬细胞的影响时，不知道药物是作用于巨噬细胞本身或通过更间接的机制。在进行类似的化学干预研究以研究巨噬细胞功能时，我们认识到，开发一种廉价而直接的传递方法，专门针对巨噬细胞的药物，是未满足的。
脂质体是微观的，生物相容性，脂质双层囊泡，可以封装蛋白质，核苷酸和药物货物19。脂质体的单层或多层脂质双层结构形成水性内流明，其中水溶性药物可以结合，而疏水性药物可以集成到脂质膜中。此外，脂质体的物理化学性质，包括大小，电荷和表面修改可以操纵，以定制其靶向到特定的细胞20，21。脂体的这些特点，使他们成为一个有吸引力的工具，提供药物，并提高目前的治疗方案20的精度。由于脂质体是由巨噬细胞自然噬菌体（一种利用其常规使用，专门用于向巨噬细胞进行消融实验的结节功能的一种特征22），它们作为巨噬细胞特异性药物输送的一个有吸引力的选择（图1B）。
该协议描述了药物配方成蓝色荧光脂质体涂覆与亲水性聚合物波罗沙默188，在脂质体表面形成保护层，并已证明，以提高药物保留，并具有优越的生物相容性23。Poloxamer被选择用于脂质体的表面涂层，因为我们先前的研究表明，与聚乙烯乙二醇改性脂质体相比，Poloxamer修饰的脂质体在静脉注射大鼠爪和类似的药代动力学后，在兔子的皮下注射后表现出更好的生物相容性23。还介绍了其向幼虫斑马鱼和活成像进行显微注射的规程，以评估其巨噬细胞靶向能力和细胞内腔内的定位，这些细胞是脂质降解和细胞质药物输送所必需的。作为概念验证，我们以前曾使用这种技术来瞄准两种药物，以巨噬细胞来抑制其激活在幼虫斑马鱼模型急性痛风炎症24。这种药物输送技术扩展了斑马鱼研究人员的化学"工具包"，这些研究人员希望确保其感兴趣的药物的巨噬菌体靶向。
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Protocol
1. 制备药物装的玛丽娜蓝标记脂体
注：携带蓝色荧光染料、Marina Blue 和药物的脂质体使用薄膜水化方法制备，后插入了 poloxamer 188。除非另有规定，否则所有程序均在室温下进行。控制脂体只携带滨海蓝色和PBS。此处的示例描述了使用线粒体靶向抗氧化药物25加载脂体，该药物在代表性结果中用作概念验证。
- 为了制备脂质体，溶解16.4毫克（22.2μmol）的磷脂1，2-二氨基-sn-甘油-3磷脂（见材料表），4。 3毫克（11.1μmol）胆固醇（见材料表）和2.8毫克（3.7μmol）1，2-二乙酰-sn-甘油-3磷脂蛋白（见材料表，在3 mL的氯仿：甲醇（3：1 v/v）在25 mL圆底烧瓶。
- 在上述混合物中，加入31 nmol Marina Blue 1，2-二十二二十二二二二苯丙胺-甘油-磷酸二胺（见材料表）和300 nmol的mROS抑制药物（见材料表）和声波短暂完全溶解。对于控制脂质体，只需添加Marina Blue 1，2-二十二十二十进制-sn-甘油-磷乙醇胺。
注：为避免光敏滨海蓝荧光染料的光漂白，请尽可能保护所有程序免受光照射。如果要装载的药物是光敏的，这也很重要。 - 在温度控制水浴设定为 45°C 的温度下，在真空压力下以 75 rpm 转速旋转（200 mbar 15 分钟，然后 0 mbar 20 分钟），缓慢地在旋转蒸发器上去除溶剂。 这在烧瓶的玻璃壁内形成干燥的薄脂膜，在N2下进一步干燥45分钟，以利于有机溶剂的完全去除。
- 薄膜形成后，将真空压力设定为40 mbar 15分钟，然后用氮气清洗30分钟，以确保去除残留溶剂。
- 使用 1 mL 的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）将薄膜水化，并用副膜密封，然后用旋转蒸发器在 60°C 水浴上搅拌烧瓶 20 分钟，形成囊泡。
- 将水合悬浮液冷冻至液体N2中，冷冻3分钟，然后浸泡在45°C水浴中7分钟，使水合悬浮液保持7次冷冻和解冻。
- 使用微型挤出机（参见材料表）和1.0μm轨道蚀刻聚碳酸酯膜（见材料表）将脂体挤出膜，进行2-6个周期，以获得大型单片杆菌囊泡。
注：为了达到对巨噬细胞更有利的目标，操纵挤出周期，直到脂体直径约为1μm 26，27，28。 - 在186，000 x g处通过超离心化将新鲜脂体冷凝成颗粒，并在45°C和750 rpm下使用具有2 mL微离心管附件的热敏混合器孵育1mL 188（见材料表）溶液（PBS中10mg/mL），30分钟使用热混合器（见材料表）。
- 在186，000 x g的1小时4°C下超离混合物1小时，并去除上清液，以去除任何未结合的聚合物或药物。将脂体颗粒储存在4°C，防止光线照射。
2. 脂质体大小和齐塔电位的特征
- 用超纯水（1：100）稀释脂质体配方，并使用动态光散射分析仪（见材料表）在25°C下测量脂质体颗粒大小、多分散指数（PDI）和zeta电位。
注：PDI是纳米粒子总体大小分布的度量。PDI 值 < 0.05 表示更均匀的分布，而接近 1 的值表示更大的分布。齐塔电位是整体表面电荷。
3. 脂体中诱捕效率与药物负荷的计算
注：为了确定脂蛋白体中药物的诱捕效率，测量上清液和脂体颗粒中所含的药物含量。
- 在 PBS 的 1 mL 中重新悬浮脂量颗粒。
- 去除上清液，用超纯水稀释10 x，并通过高性能液相色谱法（HPLC）进行分析。
- 要确定脂质体内的药物浓度，将100μL脂质体悬浮液加入900μL的10%triton-X100溶液（破坏脂质膜，释放被困药物，防止脂质在HPLC柱内积聚）和涡旋3分钟分析前。
- 将 20 μL 样品注入 HPLC 系统，该系统由四元泵、恒温器自动采样器和 3 μm 250 x 4.6 mm 柱组成。将移动相位（10 mM PBS pH 2.5、醋酸酯和甲醇（30：40：30，v/v/v）））流量设置为0.9 mL/min，并使用设置为 230 mM 的二极管阵列探测器获得光谱配置文件。
- 使用以下方程计算捕获效率 （EE） 和药物负载 （DL）：
EE （%） = [我 / 公吨] x 100
DL （%） = [我 / 利普] x 100
其中，Me 是封装药物的质量，Mt 是配方过程中使用的药物的总质量，Mlip 是脂质（包括胆固醇）和封装药物的总质量。
4. 脂体制备和注射
- 通过将薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管（1 mm O.D. x 0.78 mm I.D. x 10 cm 长度）插入微移液器拉拔器装置（参见材料表），使用以下通用拉拔器设置（热 680、拉 75、速度 40、时间 55 和压力 530）来制备硼硅酸盐显微注射针，以产生锥形微注射针。
- 将针头放入培养皿中，放在造型粘土上，并安排拉端不接触盘子底部的方式。保持培养皿盖关闭，以避免灰尘污染，直到准备好使用。
- 在无菌PBS（pH 7.4）中稀释新鲜制备的脂体配方1：1，并短暂涡旋（2-3s）混合。
注：保护脂质体免受光，直到幼虫准备显微注射。 - 建立成年斑马鱼繁殖对前一天晚上，并收集胚胎之前由罗森等人29。
- 将胚胎转移到培养皿（100毫米x20毫米风格，每盘约60个胚胎），含有E3培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4），辅以0.1%的亚甲基蓝，以抑制真菌生长。取出所有死亡或未受精的胚胎，并在28.5°C孵育过夜。
- 为了方便活成像，当胚胎达到24小时发育时，向E3介质中加入0.003%的N-苯硫尿（PTU），以防止色素形成（黑色化）。
- 使用细尖钳在受精后大约 30 小时（hpf）处手动将胚胎分化。
注：不要使用酶治疗来治疗二呼胚胎，因为这可能导致上皮损伤和局部炎症，从而影响免疫学研究 - 让胚胎在28.5°C发育，直到受精后2天（dpf）。
- 将足够的 3% 甲基纤维素（在 E3 介质中）倒入 35 mm 小型培养盘的盖子中，形成覆盖整个表面的薄膜，从而准备注射板。
注：在E3介质中制备3%甲基纤维素时，甲基纤维素在轨道摇床上以温和的搅拌器溶解需要几天时间。 - 通过在E3介质中孵育，辅以200μg/mL的三叶草，对幼虫进行麻醉。
- 使用塑料转移移液器收集大约 20-25 个幼虫的池，让胚胎通过重力集中在移液器的尖端。小心用最少的液体转移幼虫，将它们放在35毫米培养盘盖的中间。
- 使用微毛细管装载机，以下列方式排列幼虫：朝向注射板顶部，背表面朝向显微注射针，注入后脑心室（图2A-D）;或者，朝向注射板左侧（从右侧注射时），腹腔表面朝向显微注射针，以注射到静脉注射（图2I）。
注：以这种方式注射时，后脑心室驻留（图2E）和胆囊造血组织（CHT）驻留（图2J）巨噬细胞可分别被瞄准。幼斑马鱼的CHT区域是类似于哺乳动物胎儿肝脏的造血位点。在安排时不要损坏胚胎，因为这可能导致局部炎症，从而影响免疫学研究。 - 服用新鲜制备的脂质体（从步骤 4.3 开始），并使用微毛细管装载机回填注射针约 5 μL 的脂质体注射混合物（参见材料表）。
注：在评估脂质体到巨噬细胞的噬菌体咽喉的定位时（图2H），用200微克/mL的噬菌体红色荧光标记物（见材料表）和100 nM的远红色荧光标记（参见材料表）来补充这种注射混合物，分别标记噬菌体30、31和脂质体32。 - 将针头安装到连接到磁性支架和压力喷射器的微操作器（参见材料表）中（参见材料表）。在立体显微镜下放置，并将喷油器设置为约 50 ms 的脉冲持续时间和约 40 psi 的喷射压力。
- 用干净的细尖钳切割显微注射针的尖端，产生直径约5μm的开口。
- 通过将喷油注入位于于流量计网格线上的矿物油滴中，校准要注入的体积。调整脉冲持续时间和/或喷射压力，直到 bolus 的直径覆盖 2.5 条最小网格线（这相当于大约 1 nL 的体积）。
- 小心地将1 nL的脂质体注射混合物注射到每个幼虫的后脑心室。
注：注射到后脑心室时，注意不要穿透过于远的口（后脑以外），因为这可能破坏导致出血的底层血管。注射到鼻坐静脉时，应小心确保针头正好在心周下，不要穿透蛋黄。 - 注射后，立即将注射的幼虫转移到E3介质中，将E3介质加入注射板，并使用塑料转移移液器轻轻搅拌甲基纤维素中的幼虫。
- 在28.5°C（防止光线）下孵育幼虫，直到通过实时共聚焦成像进行分析。
5. 共聚焦成像和图像分析，确认脂体巨噬菌体靶向
- 将水浴加热至50°C。
- 麻醉脂质体注射幼虫，通过转移到含有E3介质的新的Perti培养皿，辅以0.003%PTU和200μg/mL三叶草。
- 通过在微波炉中溶解 E3 介质中 1% 的低熔点胶合酶，并在 0.003% PTU 中补充，准备实时成像安装介质。放入水浴中，溶液冷却至50°C后，加入200微克/mL的三香。
- 将安装介质保存在 50°C 水浴中，以防止角胶过早聚合。
- 要在配备水浸透镜（图2E）的共聚焦显微镜上成像后脑的背表面，请嵌入幼虫，如下所示：用安装介质（深度约5毫米）填充35毫米培养皿，并让它聚合。在肌蔗糖中挖出一个小沟沟，其大小足以容纳蛋黄囊。
- 用熔融安装介质填充塑料转移移液器，排出少量，并用它来收集麻醉幼虫。立即将幼虫转移到培养皿中，并使用微毛细管装载机将蛋黄囊、腹腔侧向下、进入挖掘的孔中。定期保持它们在这个位置，直到胶着胶聚合。与E3介质叠加，辅以200μg/mL三合一。
注：转移和定位幼虫时，注意不要造成上皮损伤和局部炎症，这可能会影响免疫学研究。为了定位幼虫，活图像的CHT区域（图2J），安装如上所述，但将幼虫置于挖掘孔内横向。 - 在倒置共聚焦显微镜上成像时，将幼虫嵌入，没有角质玫瑰床，直接嵌入玻璃底盘的底部。将它们的背表面向下（或横向）排列，然后进行聚合，用均匀的安装介质覆盖整个盘面。聚合后，加入一层薄薄的E3介质，辅以200μg/mL的三聚一苯。
- 要在共聚焦显微镜上实时成像后脑心室，请使用以下设置：512 x 512 像素;40 x 3 μm Z 型堆栈（从后脑最背表面延伸）;20 倍目标;2.5 倍变焦。
注：在比较样品之间的信号强度时（例如，当成像在记录巨噬细胞[tg1：EGFP）33] 或嗜中性粒细胞 [Tg（lyz：EGFP）34] 的报检线内注入的 Marina 蓝色标记脂质体吸收时，必须保持相同（例如， 针孔直径、激光电压、偏移和增益），有助于确保任何差异不是图像采集设置更改的伪影。 - 使用 3D 图像分析软件量化玛丽娜蓝标脂质体宏噬细胞或中性粒细胞的吸收。要量化 Z 堆栈中包含脂体（图 2F） 的细胞数（图 2F），请滚动浏览各个 Z 部分，并计算包含 Marina 蓝色标记脂体的各个单元格的数量。要量化细胞内脂质体荧光强度（图2G），绘制每个细胞周围感兴趣的区域（在X、Y和Z维度中），以量化细胞内滨海蓝的总荧光强度或平均荧光强度。
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Representative Results
本文描述的用于制备荧光脂质体封闭药物的薄膜水化方法是一种简单而经济高效的方法。根据本研究所使用的方案，脂体有望成为单层23、24。表1总结了所生产的脂质体的大小、齐塔潜力、药物载荷和诱捕效率。脂体粒体（药物加载前后）的粒径相似（表1）。与对照脂质体相比，药物载脂质体的表面电荷（Zeta电位）略为中性，但是，它们都是负电荷，这意味着不会显著改变其生物分布模式。
将Marina蓝标脂质体微注射到后脑心室，导致居民巨噬细胞快速吸收，注射后3小时可通过共聚焦显微镜快速观察，注射到巨噬细胞系标转基因报告线Tg（mpeg1：EGFP）33（图2C，E-G）。这与中性粒细胞（如中性粒细胞特异性Tg（lyz：EGFP）34报告线中标记的那样），很少观察到含有细胞内脂质体（图2E-G）。在单个含脂量体巨噬细胞内，脂质体在方体腔内积累（图2H），这是脂质降解和随后的释放其药物含量进入细胞质35所必需的。为脂体输送选择不同的显微注射部位会影响组织驻留巨噬细胞的目标。例如，输送到后脑心室有效地针对后脑驻大噬细胞（图2D，E），而微注射到窦静脉注射可以通过循环将脂质体输送到CHT驻大噬细胞（图2I，J）。
考虑显微注射部位的脂质体交付是重要的，当使用这种技术询问巨噬细胞对免疫学挑战的反应，因为它有助于确保被调查的特定巨噬细胞正在接受药物。我们经常使用此协议将药物加载的脂体输送到后脑心室，以评估这些药物对单酸钠（MSU）晶体的巨噬细胞反应的影响，同样被注射到后脑腔（图3A）。作为急性痛风炎症的病原体，MSU晶体激活组织驻留巨噬细胞，通过依赖线粒体活性氧（mROS）10、36、37、38的过程产生亲炎介子，包括美莱金-1+（IL-1+）。这些激活的巨噬细胞然后驱动中性粒细胞渗透，急性痛风炎症的标志。将装有mROS抑制药物的脂体微注射到后脑心室，可以显著抑制MSU晶体驱动的mROS在脂肪体载载的后脑驻足巨噬细胞内的产生（图3B-D）。使用此处描述的协议，我们实现了49.12 ± 0.17%的诱捕效率，从而产生了药物浓度为103.05 ±0.36 μM的制剂。值得注意的是，在这个浓度下注射1 nL体积在我们的实验中没有可观察到的毒性，这从严重的形态变化或心脏骤停就证明了这一点。通过研究il1b表达（IL-1+的斑马鱼正交）和中性粒细胞的暂时招募（图4C，D），可以进一步验证这种药物对巨噬细胞激活状态的抑制作用（图4C，D）。
图1：说明传统免费药物输送与脂质介导药物向幼虫斑马鱼输送的原理图。（A） 经常用于向幼虫斑马鱼提供药物的策略，主要限于浸入或微注射免费药物。（B） 药物加载脂质体的显微注射允许直接靶向巨噬细胞，其中方体腔内的脂质降解导致细胞质药物输送。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：使用荧光脂体将药物定位到巨噬细胞。（A） 显微注射针（黑箭）和幼虫的显微注射设置，在3%甲基纤维素内的35毫米组织培养盘中排列。（B） 放大的幼虫视图排列在 A . （C） 2 dpf Tg （mpeg1：EGFP）幼虫的实时共聚焦图像， 前到左.（D） 放大阵列幼虫的视图，如 A，显示微注射到后脑心室（黑色箭头标记显微注射针）。（E） 图解说明针对后脑驻大噬细胞和Tg（mpeg1：EGFP）和Tg（lyz：EGFP）幼虫的后脑聚居性聚居图像（背观，左前）的活共聚焦图像（前视，左前）幼虫，在玛丽娜蓝标脂质体（白色箭头标记脂质体-大噬细胞）后脑显注3小时之后。（F和G） 巨噬细胞和嗜中性粒细胞的脂质吸收定量（如在 E 中检测到），以含有（F）的细胞数量和玛丽娜蓝标记脂质体体荧光强度/细胞（G）为单位进行测量。（H） 后脑中含脂质体巨噬菌体的实时共聚焦图像，标记有一个红色的噬菌体荧光标记和Tg（mpeg1：EGFP）幼虫体内的乳液体远红色荧光标记，在玛丽娜蓝标记脂质体后脑微注射3小时之后。（I） 放大阵列幼虫的视图，如 A，显示微注射到鼻液（黑色箭头标记显微注射针）。（J） 图解说明针对 CHT 驻留巨噬细胞和Tg（mpeg1：EGFP）和Tg（lyz：EGFP）幼虫的 CHT 区域（横向视图，左前向左）的实时共聚焦图像，在将玛丽娜蓝标记脂质体微注射到鼻孔（白色箭头标记脂质体）后 3 小时。误差条显示平均值 = SD =p<0.05;p < 0.0001， 学生t-测试。刻度条 = 100 毫米 （A）、100 μm （B）、250 μm（C、D 和 I）、10 μm （E）、5 μm （H）、50 μm （J）。这个数字已由以前的出版物24修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：含有mROS抑制药物的脂体体微注射抑制活性巨噬细胞内的mROS生产。（A） 说明mROS抑制药物对巨噬细胞的靶向，并评估它在MSU晶体刺激后对巨噬细胞活化的影响。（B和C） Tg（mpeg1：EGFP）幼虫后脑内含脂质体巨噬细胞（控制脂质体/L-C（B）或 mROS 抑制脂质体/L-MI（C）的实时共聚焦图像， 还标有荧光mROS特异性探针（见材料表，其中荧光信号显示为热图，暖色代表更高级别的mROS），3小时后脑微注射玛丽娜蓝标记脂体和MSU晶体。玛丽娜蓝荧光是灰度伪色。（D） 在巨噬细胞中检测到的 mROS 特异性探针的荧光强度的定量，如 B 和 C 中检测到的。 误差条显示平均值 = SD=p < 0.0001，学生t-测试。刻度条 = 10 μm （B）。这个数字已由以前的出版物24修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：含有mROS抑制剂的脂质体微注射抑制活性巨噬细胞和巨噬细胞驱动的中性粒细胞的表达。 （A） 在后脑显微注射控制（L-C）或mROS抑制脂体（L-MI）和MSU晶体后脑区域3小时内，通过全位位杂交检测出il1b（以黑色箭头标记）和MSU晶体的表达，从左前。数字表示具有显示表型的幼虫的比例。（B） 在 A 中检测到的il1b表达的量化，显示为表示高、低或无表达的幼虫百分比。（C） 在 L-C 或 L-MI 和 MSU 晶体的后脑微注射后，通过免疫荧光 3 （3 hpi） 和 6 （6 hpi） h 检测的嗜中性粒细胞在Tg（lyz：EGFP）幼虫（背视图，从左前到左）的后脑区域的共聚焦图像。（D） 在 L-C 或 L-MI 和 MSU 晶体的后脑微注射后，在 C、1 （1 hpi）、3 （3 hpi）、6 （6 hpi） 和 9 （9 hpi） h 中检测到的嗜中性粒细胞的暂时定量。误差条显示平均值 = SD=p < 0.0001，n.s. 不显著，单向 ANOVA，Dunnett 的后临时测试。刻度条 = 100 μm （A），50 μm （C）。这个数字已由以前的出版物24修改。请点击此处查看此图的较大版本。
| 脂质体的物理化学特性（L） | 控制脂体 | mROS 抑制脂体 |
| 尺寸（微米） | 1.2 ± 0.07 | 1.1 ± 0.04 |
| 齐塔电位（mV） | -25.9 ± 0.57 | -13.0 ± 0.11 |
| 诱捕效率 （EE， % | 不适用 | 49.12 ± 0.17 |
| 药物装载（DL，%） | 不适用 | 0.37 ± <0.01 |
表1：PBS（控制）或mROS抑制脂质体的物理化学特性（数据为均值 = 标准偏差，n = 3）。所有脂体都标有玛丽娜蓝。
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Discussion
在这里，我们提供了一个详细的协议，以制定药物加载的脂体，专门针对幼虫斑马鱼的巨噬细胞。该方法可用于剖析巨噬细胞在某些疾病模型中的作用，确保直接有针对性地向巨噬细胞提供药物。此外，当药物的一般毒性限制其使用时，如浸泡等更常规的路线，可以使用。此处描述的协议提供了用于靶向幼虫斑马鱼中先天免疫细胞的其他纳米颗粒系统的替代方案。这些措施包括将抗疟药物利法平瞄准感染海南的巨噬细胞分枝杆菌，以利用亚微米大小的聚合纳米颗粒39促进细菌清除。在另一个例子中，在聚合体内，将中性粒细胞凋亡的诱导剂（R）-罗斯科维汀的封装被证明针对中性粒细胞，从而促进炎症分辨率40。在此协议中，由于脂质体具有无毒、生物相容和可生物降解的特性，我们使用脂质体作为药物输送的工具。此外，它们是非免疫性的，在用于研究免疫反应时特别重要，如此处所述。也可以携带一系列货物，包括亲水性、疏水性、两栖和亲脂药物。
执行此协议时，必须特别注意许多关键步骤。这些步骤包括对幼虫进行物理处理的步骤，必须小心，以尽量减少对幼虫的任何意外损害。这包括当手动排除幼虫时（特别是避免接触蛋黄的细腻上皮衬里），将幼虫排列到注射板上，在注射后从板上取出，并安装用于实时共聚焦成像。该协议的一个不可避免的组成部分是通过显微注射来传递脂质体（和任何免疫挑战），这可能导致局部炎症，因此可能会影响实验结果。微注射幼虫斑马鱼确实需要一定程度的训练，以尽量减少组织损伤。在我们的工作中，在注射到2 dpf幼虫的后脑心室时，产生大约5μm的显微注射针尖直径会产生非常轻微的表面上皮损伤（炎症标记基质基质金属肽酶9在显微注射伤口10附近表面上皮细胞内的表达非常低，就证明了这一点。当取出显微注射针时，这个直径尖端也足够小，以避免注射内容物渗漏，从后脑心室流出。这里需要注意的是，超过 2 nL 的注射体积通常会导致某些注射内容因超过心室的体积而溢出注射孔。尖直径为5μm也足以注入后续的免疫挑战，如MSU晶体10。用微磨机将显微注射针尖倾斜到45°，从而产生锋利的尖端，可以更好地穿透覆盖后脑心室41的外侧尖和内基上皮层。需要注意的是，控制注射，如这里使用（即控制脂质体）是至关重要的，当评估药物加载的脂质体对巨噬菌体功能的影响，以控制注射过程本身。当形成脂质体时，选择特定药物的浓度也是一个重要步骤，因为通过浸泡传递的既定有效药物浓度可能与使用脂质体介导的药物输送时所需的浓度不同。此外，在使用此协议时，应注意不要改变使用 poloxamer 修改后的脂质体的物理化学特性，因为这可能会影响其生物分布模式。
修改和今后开发该协议的一个领域是研究将不同的表面特征纳入脂质体，如配体或受体，以进一步增强巨噬细胞靶向和吸收，或针对不同的免疫细胞，如中性粒细胞。这种先进的方法需要进一步的研究，以发现表面特征，这是独特的不同的斑马鱼免疫细胞室，这是目前鲜为人知的。修改该协议的进一步领域包括将其他荧光探针加入脂质体以扩大其多功能性（例如，当注入其他转基因报告线时），并改变其物理特性，如大小和电荷42，43。研究不同幼虫阶段不同脂质体给药途径是否可以扩展其多功能性以靶向额外的巨噬细胞群体（例如肠道上皮细胞）也很重要。在此详述的协议中，所有注射均对2dpf幼虫进行。在斑马鱼发育的第三天，从嘴到心形形成单连续流明，开口后44。到了第四天，胎盘打开，导致一个完全开放的管子内衬与极化上皮44。这将是有趣的，看看是否浸泡在脂质体中的旧幼虫可以促进封装药物靶向肠道上皮细胞。
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Disclosures
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了向C.J.H.（新西兰卫生研究理事会和马斯登基金、新西兰皇家学会）和Z.W.（奥克兰大学学院研究发展基金）提供的赠款的支持。作者感谢阿尔哈德·马哈贡卡尔对斑马鱼设施、生物医学成像研究室、奥克兰大学医学院的辅助成像和格雷厄姆·利施克（Graham Lieschke）赠送Tg（mpeg1：EGFP）记者专线的专家管理。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
References
- Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
- Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
- Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
- Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
- Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P.
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
- Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
- Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
- Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
- Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
- Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
- Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
- Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
- Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
- Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
- Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
- Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
- Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
- Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
- Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
- Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
- Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
- Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
- Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
- Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
- Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
- Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
- Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).
