Summary
Qui, descriviamo la sintesi dei liposomi caricati dai farmaci e la loro microiniezione nel pesce zebra larvale allo scopo di indirizzare la somministrazione di farmaci alle cellule di macrofago-lignaggio.
Abstract
Le larve di pesce zebra (Danio rerio) si sono sviluppate in un modello popolare per studiare le interazioni ospite-patogeno e il contributo delle cellule immunitarie innate alle malattie infiammatorie a causa del loro sistema immunitario innato contenuto funzionalmente conservato. Essi sono anche ampiamente utilizzati per esaminare come le cellule immunitarie innate aiutano a guidare i processi di sviluppo. Sfruttando la trasparenza ottica e la trattabilità genetica del pesce zebra larvale, questi studi spesso si concentrano su approcci di imaging dal vivo per caratterizzare funzionalmente macrofagi e neutrofili marcati fluorescenti all'interno di animali intatti. A causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e dei ruoli in continua espansione nella patogenesi della malattia, i macrofagi hanno ricevuto un'attenzione significativa. Oltre alle manipolazioni genetiche, gli interventi chimici sono ora regolarmente utilizzati per manipolare ed esaminare il comportamento dei macrofafi nel pesce zebra larvale. La consegna di questi farmaci è in genere limitata al targeting passivo di droga libera attraverso l'immersione diretta o microiniezione. Questi approcci si basano sul presupposto che qualsiasi modifica al comportamento dei macrofagi sia il risultato di un effetto diretto del farmaco sui macrofagi stessi, e non una conseguenza a valle di un effetto diretto su un altro tipo di cellula. Qui, presentiamo i nostri protocolli per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi di pesci zebra larve mediante microiniezione di liposomi fluorescenti caricati da farmaci. Vi riveliamo che i liposomi fluorescenti blu carichi di pallacaneggio 188 modificati sono prontamente assorbiti dai macrofagi e non dai neutrofili. Forniamo anche la prova che i farmaci consegnati in questo modo possono avere un impatto sull'attività dei macrofazini in modo coerente con il meccanismo d'azione del farmaco. Questa tecnica sarà di valore per i ricercatori che vogliono garantire il targeting dei farmaci ai macrofagi e quando i farmaci sono troppo tossici per essere consegnati con metodi tradizionali come l'immersione.
Introduction
Il sistema di fagociti mononucleari fornisce una prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori. Questo sistema è costituito da monociti, cellule dendritiche derivate da monciti e macrofagi, che attivamente fagocitozelare patogeni estranei, limitando così la diffusione di patogeni. Oltre a queste funzioni fagocitiche e microbicide, le cellule dendritiche e i macrofagi sono anche in grado di produzione di citochine e di presentazione dell'antigene per attivare il sistema immunitario adattivo1. Di queste cellule, i macrofagi hanno ricevuto particolare attenzione a causa della loro eterogeneità funzionale diversificata e del coinvolgimento in molteplici malattie infiammatorie, dall'autoimmunità e malattie infettive al cancro2,3,4,5,6,7. La plasticità dei macrofagi e la loro capacità di adattarsi funzionalmente alle esigenze del loro ambiente tissutale richiedono approcci sperimentali per osservare e interrogare direttamente queste cellule in vivo.
Il pesce zebra larvale è un organismo modello ideale con cui studiare la funzione e la plasticità dei macrofagi in vivo8. La trasparenza ottica del pesce zebra larvale fornisce una finestra per osservare direttamente il comportamento dei macrofagi, soprattutto se accoppiati con linee di reporter transgenici marcati macrofagi. Sfruttare il potenziale di imaging dal vivo e la trattatibilità sperimentale del pesce zebra larvale ha portato a molte intuizioni significative sulla funzione del macrofago che hanno una rilevanza diretta per la malattia umana9,10,11,12,13,14,15. Molti di questi studi hanno anche approfittato dell'alta conservazione dell'attività farmacologica nel pesce zebra (un attributo che sostiene il loro uso come piattaforma di scoperta di farmaci animali16,17,18), utilizzando interventi chimici per manipolare farmacologicamente la funzione macrofago. Ad oggi, questi trattamenti farmacologici sono stati per lo più erogati sia attraverso l'immersione, che richiede che il farmaco sia solubile in acqua, o per microiniezione diretta di droga libera (Figura 1A). Le limitazioni di queste strategie di consegna passiva includono effetti off-target e tossicità generale che possono impedire di valutare qualsiasi impatto sulla funzione del macrofago. Inoltre, quando si studiano gli effetti sui farmaci sui macrofagi non è noto se i farmaci agiscono sui macrofagi stessi o attraverso meccanismi più indiretti. Quando si eseguono studi di intervento chimico simili per studiare la funzione del macrofago, abbiamo riconosciuto che c'era una necessità insoddisfatta di sviluppare un metodo di somministrazione economico e diretto per indirizzare i farmaci specificamente ai macrofagi.
I liposomi sono vesciche microscopiche, biocompatibili, lipidi che possono incapsulare proteine, nucleotidi e merci di droga19. La struttura di unilamellar o bistrato lipidico multilamellar dei liposomi forma un lumen interno acquoso dove i farmaci solubili in acqua possono essere incorporati mentre i farmaci idrofobici possono essere integrati nelle membrane lipidiche. Inoltre, le proprietà fisico dei liposomi, comprese le modifiche di dimensioni, cariche e superfici, possono essere manipolate per adattare il loro targeting a celle specifiche20,21. Queste caratteristiche dei liposomi li hanno resi un veicolo attraente per fornire farmaci e migliorare la precisione degli attuali regimi di trattamento20. Poiché i liposomi sono naturalmente fagocitoscitosamente dai macrofagi (una caratteristica sfruttata dal loro uso di routine nel fornire clodrinonato specificamente ai macrofagi per esperimenti di ablazione22), presentano come un'opzione attraente per la somministrazione di farmaci specifici per i macrofagi (Figura 1B).
Questo protocollo descrive la formulazione di farmaci in liposomi fluorescenti blu rivestiti con il poloxamer polimerico idrofilo 188, che forma uno strato protettivo sulla superficie liposomica e ha dimostrato di migliorare la ritenzione dei farmaci e avere una biocompatibilità superiore23. Poloxamer è stato scelto per il rivestimento superficiale dei liposomi come la nostra ricerca precedente aveva dimostrato che, rispetto ai liposomi modificati in polietilene glicole, i liposomi modificati poloxamer hanno mostrato una migliore biocompatibilità dopo l'iniezione sottocutanea di zampe di ratto e simili farmacocinetici nei conigli che hanno seguito l'infusione endovenosa23. I protocolli sono descritti anche per la loro microiniezione nel pesce zebra larvale e nell'imaging vivo per valutare la loro capacità di targeting dei macrofagi e la localizzazione in compartimenti intracellulari necessari per la degradazione liposomica e la somministrazione di farmaci citoplasmici. Come prova di concetto abbiamo usato questa tecnica per indirizzare due farmaci ai macrofagi per sopprimere la loro attivazione in un modello di pesce zebra larvale di infiammazione gotta acuta24. Questa tecnica di somministrazione di farmaci espande il "toolkit" chimico disponibile per i ricercatori di pesci zebra che vogliono garantire il targeting dei macrofagi dei loro farmaci di interesse.
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Protocol
1. Preparazione di Liposomes Marina con carico di droga
NOTA: I liposomi che portano il colorante fluorescente blu, Marina Blue e la droga vengono preparati utilizzando un metodo di idratazione del film sottile con post-inserimento del poloxamer 188. Tutte le procedure vengono eseguite a temperatura ambiente se non diversamente specificato. I liposomi di controllo portano solo Marina blu e PBS. L'esempio qui descrive il caricamento di liposomi con un farmaco antiossidante25 di puntamento ai mitocondri che viene utilizzato nei risultati rappresentativi come un proof-of-concept.
- Per preparare i liposomi, sciogliere 16,4 mg (22,2 smol) dei fosfolipidi 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (vedi Tabella dei materiali),4.4.3 mg (11,1 mol) di colesterolo (vedi Tabella dei Materiali)e 2,8 mg (3,7 -mol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (vedi Tabella dei materiali, in 3 mL di cloroformio:metanolo (3:1 v/v) in un flacone rotondo-inferiore da 25 mL.
- Alla miscela di cui sopra, aggiungere 31 nmol di Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (vedi Tabella dei materiali)e 300 nmol di un farmaco inibitore mROS (vedi Tabella dei materiali)e sonicare brevemente per sciogliersi completamente. Per i liposomi di controllo, aggiungere solo Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine.
NOTA: Per evitare il fotosbiancamento del colorante fluorescente Marina Blue sensibile alla luce, proteggere tutte le procedure dalla luce, ove possibile. Questo è anche importante se il farmaco da caricare è sensibile alla luce. - Rimuovere lentamente il solvente su un evaporatore rotante (vedi Tabella dei materiali)su un bagno d'acqua a temperatura controllata impostato a 45 gradi centigradi ruotando a 75 giri sotto pressione sotto vuoto (200 mbar per 15 min quindi 0 mbar per 20 min). Questo forma una pellicola lipidica sottile secca all'interno delle pareti di vetro del pallone che viene ulteriormente essiccato per 45 minuti sotto N2 per facilitare la completa rimozione del solvente organico.
- Dopo la formazione della pellicola sottile, impostare la pressione del vuoto a 40 mbar per 15 min, quindi spurdare con gas di azoto per 30 min per garantire la rimozione del solvente residuo.
- Idratare la pellicola sottile utilizzando 1 mL di salina tampone fosforo (PBS, pH 7.4) e sigillare con parafilm prima di agitare il flacone utilizzando un evaporatore rotante su un bagno d'acqua di 60 gradi per 20 min al fine di formare vesciche.
- Sottoporre la sospensione idratata a 7 cicli di congelamento e scongelamento congelando nel liquido N2 per 3 min seguito da immersione in un bagno d'acqua a 45 gradi centigradi per 7 min.
- Estrusive i liposomi attraverso una membrana utilizzando un mini-estrusore (vedi Tabella dei materiali)e 1,0 m di membrane in policarbonato incise da pista (vedi Tabella dei materiali)per 2-6 cicli al fine di ottenere grandi vescicle di unilamellar.
NOTA: Al fine di ottenere un targeting più favorevole verso i macrofagi, manipolare i cicli di estrusione fino a quando il diametro dei liposomi è di circa 1 m26,27,28. - Condensare i liposomi freschi in un pellet con ultracentrifugazione a 186.000 x g e incubare con 1 mL di 1% poloxamer 188 (vedi Tabella dei materiali) soluzione (vedi Tabella dei materiali)soluzione (10 mg/mL in PBS) a 45 gradi centigradi e 750 rpm per 30 min utilizzando un termomixer con un attacco a 2 mL microcentrico
- Ultracentrifuga la miscela a 186.000 x g per 1 h a 4 gradi centigradi e rimuovere il supernatante al fine di rimuovere qualsiasi polimero non legato o farmaco. Conservare i liposomi pellet a 4 gradi centigradi, protetti dalla luce.
2. Caratterizzazione delle dimensioni del liposomo e del potenziale di zeta
- Diluire la formulazione liposomica con acqua ultrapura (1:100) e misurare la dimensione delle particelle, l'indice di polidispersità (PDI) e il potenziale zeta dei liposomi utilizzando un analizzatore di dispersione della luce dinamico (vedi Tabella dei materiali), in triplice copia a 25 gradi centigradi.
NOTA: Il PDI è una misura della distribuzione delle dimensioni della popolazione di nanoparticelle. I valori PDI < 0.05 indicano una distribuzione più uniforme, mentre i valori più vicini a 1 indicano una distribuzione di dimensioni maggiori. Il potenziale zeta è la carica complessiva della superficie.
3. Calcolo dell'efficienza dell'ingresso e del caricamento dei farmaci nei liposomi
NOTA: Per determinare l'efficienza di intrappolamento del farmaco nei liposomi, viene misurato il contenuto di farmaci contenuto nel pellet supernatale e liposomano.
- Risospendere il pellet lipososo in 1 mL di PBS.
- Rimuovere il supernatante, diluire 10 x con acqua ultrapura e analizzare con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).
- Per determinare la concentrazione di droga all'interno dei liposomi, aggiungere 100 l una di sospensione lipososoa a 900 L di 10% soluzione triton-X100 (per distruggere la membrana lipidica, rilasciando il farmaco intrappolato e prevenendo l'accumulo di lipidi all'interno della colonna HPLC) e vortice per 3 minoni prima dell'analisi.
- Iniettare 20 l di campione in un sistema HPLC costituito da una pompa quaternaria, un termostato autocampionatore e una colonna di 3 m 250 x 4,6 mm. Impostare la fase mobile (10 mPB PBS pH 2.5, acetonitrile e metanolo (30:40:30, v/v/v)) sulla velocità di flusso di 0,9 mL/min e ottenere profili spettrali utilizzando un rilevatore di matrice di diodo impostato su 230 mM.
- Calcolare l'efficienza di intrappolamento (EE) e il carico di droga (DL) utilizzando le seguenti equazioni:
EE (%) - [Me / Mt] x 100
DL (%) : [Me / Mlip] x 100
Dove Me è la massa di farmaco incapsulato, Mt è la massa totale del farmaco utilizzato durante la formulazione e Mlip è la massa totale dei lipidi (compreso il colesterolo) e farmaco incapsulato.
4. Preparazione e iniezione di liposomi
- Preparare gli aghi di microiniezione borosilicato inserendo un capillare di vetro borosilicato sottile (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm di lunghezza) in un dispositivo di emissione di micropipette (vedi Tabella dei materiali) con le seguenti impostazioni generiche di trazione (calore 680, pull 75, velocità 40, tempo 55 e pressione 530) per produrre un microiniezione contanto.
- Mettere gli aghi in un piatto Petri sull'argilla di modellazione e disporre in modo che l'estremità tirata non tocchi il fondo del piatto. Tenere il coperchio del piatto Petri chiuso per evitare la contaminazione da polvere fino a quando non è pronto per l'uso.
- Diluire le formulazioni lipososo appena preparate 1:1 in PBS sterile (pH 7.4) e per creare brevemente vortice (2-3 s) da mescolare.
NOTA: Proteggere i liposomi dalla luce fino a quando le larve sono pronte per la microiniezione. - Istituire coppie adulte di allevamento di pesci zebra la sera prima e raccogliere gli embrioni come descritto in precedenza da Rosen et al.29.
- Trasferire gli embrioni in un piatto Petri (100 mm x 20 mm in stile con circa 60 embrioni per piatto) contenente mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) integrato con 0,1% di blu di metilene per inibire la crescita fungina. Rimuovere tutti gli embrioni morti o non fecondati e incubare durante la notte a 28,5 gradi centigradi.
- Per facilitare l'imaging dal vivo, aggiungere 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) ai media E3 quando gli embrioni raggiungono i 24 h di sviluppo per prevenire la formazione di pigmenti (melanizzazione).
- Dechorionate manualmente gli embrioni a circa 30 h dopo la fecondazione (hpf) utilizzando pinze di punta fine.
NOTA: Non utilizzare il trattamento enzimatico per dechorinate embrioni in quanto ciò può causare danni epiteliali e infiammazione locale influenzando così gli studi immunologici - Lasciare che gli embrioni si sviluppino a 28,5 gradi centigradi fino a 2 giorni dopo la fecondazione (dpf).
- Preparare una piastra di iniezione versando abbastanza 3% cellulosa metilica (in e3 media) nel coperchio di un piccolo piatto di coltura 35 mm per formare una pellicola sottile che copre l'intera superficie.
NOTA: Quando si prepara la cellulosa metilico 3% nei media E3, ci vogliono diversi giorni perché la cellulosa metile si dissolva con agitazione delicata su uno shaker orbitale. - Anasthetizzare le larve incubando nei media E3 integrato con 200 g/mL di Tricaine.
- Raccogliere una pozza di circa 20-25 larve utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica e consentire agli embrioni di concentrarsi sulla punta della pipetta per gravità. Avendo cura di trasferire le larve con un liquido minimo, metterle al centro del coperchio del piatto di coltura 35 mm.
- Utilizzando un caricatore a microcapillare, disporre le larve nei seguenti modi: anteriore verso la parte superiore della piastra di iniezione con la superficie dorsale rivolta verso l'ago di microiniezione, per iniettare nel ventricolo del cervello posteriore (Figura 2A-D); o, anteriore verso sinistra della piastra di iniezione (quando si inietta da destra) con la superficie ventrale rivolta verso l'ago di microiniezione per iniettare nel veleno del seno (Figura 2I).
NOTA: Se iniettato in questo modo, possono essere presi di mira anche i macrofagi del ventricolo posteriore (Figura 2E) e dei tessuti ematopoietici caudali (CHT)-residente(Figura 2J). La regione CHT del pesce zebra larvale è un sito ematopoietico analogo al fegato fetale dei mammiferi. Prestare particolare attenzione a non danneggiare gli embrioni durante l'organizzazione in quanto ciò può causare infiammazione locale influenzando così gli studi immunologici. - Prendere i liposomi appena preparati (dal punto 4.3) e il retro riempire un ago di iniezione con circa 5 anni l della miscela di iniezione liposoma utilizzando un caricatore microcapillare (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Quando si valuta la localizzazione dei liposomi nei compartimenti phagolysosomi dei macrofagi (Figura 2H), integrare questa miscela di iniezione con 200 g/mL di un marcatore fluorescente rosso di fagosoma (vedi Tabella dei materiali) e 100 nM di un marcatore fluorescente di gran lunga rosso di lisosomi (vedi Tabella dei materiali)per contrassegnare rispettivamente i fagosomi30,31 e i lisosomi32 . - Montare l'ago in un micromanipolatore (vedi Tabella dei materiali) collegato a un supporto magnetico e a un iniettore di pressione (vedere Tabella dei materiali). Posizionare sotto uno stereoscopio e impostare l'iniettore su una durata dell'impulso di circa 50 ms e una pressione di iniezione di circa 40 psi.
- Tagliare la punta dell'ago di microiniezione con pinze di punta fine pulita per generare un'apertura di circa 5 m di diametro.
- Calibrare il volume da iniettare iniettando un bolus in una goccia di olio minerale posizionato sopra le linee della griglia di un emocitometro. Regolare la durata dell'impulso e/o la pressione di iniezione fino a quando il diametro del bolus copre 2,5 delle linee della griglia più piccole (corrisponde ad un volume di circa 1 nL).
- Iniettare con attenzione 1 nL della miscela di iniezione di liposoma nel ventricolo cervello posteriore di ogni larva.
NOTA: Quando si inietta nel ventricolo del cervello posteriore, fare attenzione a non penetrare troppo ventlarally (oltre il cervello posteriore) in quanto ciò può interrompere la vascolatura sottostante che porta a emorragie. Quando si inietta nel veleno del seno, occorre prestare attenzione per garantire che la punta dell'ago sia appena all'interno del pericardio e non penetrare nel tuorlo. - Dopo l'iniezione, trasferire immediatamente le larve iniettate nel supporto E3 aggiungendo un supporto E3 alla piastra di iniezione e agitando delicatamente le larve dalla cellulosa metile utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica.
- Incubare le larve a 28,5 gradi centigradi (protetti dalla luce) fino all'analisi mediante imaging confocale vivo.
5. Imaging confocale e analisi delle immagini per confermare il targeting macrofago dei liposomi
- Riscaldare un bagno d'acqua a 50 gradi centigradi.
- Anestetizza le larve iniettate di liposomi mediante il trasferimento in un nuovo piatto Perti contenente supporti E3 integrati con 0,003% PTU e 200 Tricaine.
- Preparare il supporto di montaggio dell'imaging dal vivo sciogliendo l'agarose in un supporto di fusione basso dell'1% nei supporti E3, integrato con lo 0,003% di PTU, in un forno a microonde. Mettere nel bagno d'acqua e una volta che la soluzione si è raffreddata a 50 gradi centigradi, aggiungere 200 g/mL di Tricaine.
- Mantenere il supporto di montaggio nel bagno d'acqua di 50 gradi centigradi per evitare una prematura polimerizzazione dell'agarose.
- Per rappresentare la superficie dorsale del cervello posteriore su un microscopio confocale dotato di una lente ad immersione dell'acqua (Figura 2E), incorporare le larve come segue: Riempire un piatto di coltura di 35 mm con il mezzo di montaggio (a una profondità di circa 5 mm) e lasciarlo polimerizzare. Scavare una piccola trincea nell'agarose che è di dimensioni sufficienti per ospitare il sacco del tuorlo.
- Riempire una pipetta di trasferimento di plastica con un supporto di montaggio fuso, espellere una piccola quantità e usarla per raccogliere le larve aestiste. Trasferire immediatamente le larve nel piatto di coltura e orientare le sacche del tuorlo, lato ventrale verso il basso, nei fori scavati, utilizzando una palaforno microcapillare. Periodicamente mantenerli in questa posizione fino a quando l'agarose polimerizza. Sovrapposizione con supporti E3 integrati con 200 sg/mL Tricaine.
NOTA: Durante il trasferimento e il posizionamento delle larve, fare attenzione a non causare danni epiteliali e infiammazioni locali che possono influenzare gli studi immunologici. Per il posizionamento delle larve per vivere l'immagine della regione CHT (Figura 2J), montare come descritto sopra, ma posizionare le larve all'interno del foro scavato lateralmente. - Quando si fa l'imaging in un microscopio confocale invertito, incorporare le larve, senza il letto di agarose, direttamente sul fondo di un piatto di fondo di vetro. Disporli superficie dorsale verso il basso (o lateralmente) e dopo la polimerizzazione, coprire l'intera superficie piatto con uno strato uniforme di supporto di montaggio. Una volta polimerizzato, aggiungere un sottile strato di supporti E3 integrati con 200 g/mL di Tricaine.
- Per animare dal vivo il ventricolo del cervello posteriore su un microscopio confocale, utilizzare le seguenti impostazioni: 512 x 512 pixel; 40 x 3 s-stacks (estendendosi dalla superficie più dorsale del cervello posteriore); Obiettivo 20x; 2,5 volte lo zoom.
NOTA: Quando si confrontano le intensità del segnale tra i campioni (ad esempio durante l'imaging dell'assorbimento di liposomi con etichetta blu Marina iniettati all'interno delle linee dei reporter che marcano i macrofagi [Tg (mpeg1:EGFP)33] o i neutrofili [Tg(lyz:EGFP)34]), è essenziale che le impostazioni laser siano mantenute le stesse (ad es., diametro del foro stenopeico, tensione laser, offset e guadagno) per contribuire a garantire eventuali differenze non sono un artefatto di impostazioni di acquisizione dell'immagine alterate. - Utilizzare il software di analisi delle immagini 3D per quantificare l'assorbimento del macrofago o dei neutrofili dei liposomi con etichetta marina Blue. Per quantificare il numero di cellule contenenti liposomi (Figura 2F) all'interno di una pila z, scorrere le singole sezioni di z e contare il numero di singole celle contenenti liposomi con etichetta Marina Blue. Per quantificare l'intensità di fluorescenza dei liposomi all'interno delle cellule (Figura 2G), disegnare una regione di interesse intorno a ciascuna cella (nelle dimensioni X, Y e z) per quantificare l'intensità di fluorescenza totale o media di Marina Blue intracellulare.
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Representative Results
L'approccio di idratazione delle pellicole sottili descritto qui per la preparazione di liposomi fluorescenti che racchiudono farmaci è un metodo semplice ed economico. Con il protocollo utilizzato in questo studio, i liposomi dovrebbero essere unilamellar23,24. Le dimensioni, il potenziale di zeta, il carico di droga e l'efficienza di intrappolamento dei liposomi prodotti sono riassunti nella Tabella 1. Le dimensioni delle particelle dei liposomi (prima e dopo il caricamento del farmaco) sono simili (Tabella 1). La carica superficiale (potenziale zeta) dei liposomi caricati da farmaci è leggermente più neutra rispetto ai liposomi di controllo, tuttavia, sono tutti caricati negativamente, il che significa che questo non cambierà in modo significativo il loro modello di biodistribuzione.
La microiniezione di liposomi con etichettatura Marina Blue nel ventricolo del cervello posteriore si traduce in un rapido assorbimento da parte dei macrofagi residenti che possono essere facilmente osservati mediante microscopia confocale di 3 h dopo l'iniezione, quando iniettati nella linea di reporter transgenica Tg(mpeg1:EGFP)33 (Figura 2C,E-G). Questo è in contrasto con i neutrofili (come segnato all'interno della lineadi giornalisti Tg (lyz:EGFP)specifica per i neutrofi) che sono raramente osservati contenenti liposomi intracellulari (Figura 2E-G). All'interno dei singoli macrofagi liposomici, i liposomi si accumulano all'interno di compartimenti fagolysosomi (Figura 2H), che è necessario per la degradazione liposomica e il successivo rilascio del loro contenuto di droga nel citoplasma35. La selezione di diversi siti di microiniezione per la somministrazione del liposoma può influire sui macrofagi residenti nei tessuti. Ad esempio, la consegna nel ventricolo del cervello posteriore si rivolge in modo efficiente ai macrofagi residenti nel cervello posteriore (Figura 2D,E) mentre la microiniezione nel veleno del seno può fornire i liposomi ai macrofagi residenti in CHT attraverso la circolazione (Figura 2I,J).
La considerazione del sito di microiniezione per la somministrazione di liposomi è importante quando si utilizza questa tecnica per interrogare la risposta del macrofago a una sfida immunologica in quanto aiuta a garantire che i macrofagi particolari in esame ricevano il farmaco. Abbiamo regolarmente usato questo protocollo per la consegna di liposomi caricati da farmaci nel ventricolo del cervello posteriore per valutare l'impatto di questi farmaci sulla risposta dei macrofaci ai cristalli di aureomono (MSU), iniettati allo stesso modo nel compartimento del cervello posteriore (Figura 3A). Come agente causale dell'infiammazione gotta acuta, i cristalli MSU attivano macrofagi residenti in tessuto per produrre mediatori pro-infiammatori tra cui Interleukin-1 (IL-1) attraverso un processo dipendente da specie di ossigeno reattivo mitocondriale (mROS)10,36,37,38. Questi macrofagi attivati poi guidano l'infiltrazione dei neutrofili, un segno distintivo dell'infiammazione gotta acuta. La microiniezione di liposomi carichi di un farmaco che inibisce mROS nel ventricolo del cervello posteriore può sopprimere significativamente la produzione di mROS a cristalli MSU all'interno di macrofagi liposomici residenti sul cervello (Figura 3B-D). Utilizzando il protocollo qui descritto, abbiamo raggiunto un'efficienza di intrappolamento del 49,12 x 0,17 %, che ha portato a una formulazione con una concentrazione di droga di 103,05 x 0,36 M. Da notare, l'iniezione di un volume di 1 nL a questa concentrazione non ha provocato tossicità osservabile durante i nostri esperimenti, come dimostrano i cambiamenti morfologici grossolani o l'arresto cardiaco. Un'ulteriore convalida degli effetti soppressivi di questo farmaco sullo stato di attivazione dei macrofagi può essere eseguita studiando l'espressione il1b (l'ortologo del pesce zebra dell'IL-1) da un'ibridazione in situ di montaggio completo (Figura 4A,B) e il reclutamento temporale di neutrofili (Figura 4C,D).
Figura 1: Schema che illustra la somministrazione di farmaci liberi convenzionale rispetto alla somministrazione di farmaci mediata dal liposoma al pesce zebra larvale. (A) Le strategie abitualmente utilizzate per la somministrazione di farmaci al pesce zebra larvale sono in gran parte limitate all'immersione o alla microiniezione di droga libera. (B) La microiniezione di liposomicaricati carichi di farmaci consente di indirizzare direttamente ai macrofagi, dove la degradazione liposomica all'interno dei compartimenti fantasmasomi provoca la somministrazione di farmaci citoplasmici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Targeting di farmaci ai macrofagi usando liposomi fluorescenti. (A) Set-up di microiniezione che mostra ago di microiniezione (freccia nera) e larve disposti in un piatto di coltura dei tessuti di 35 mm entro il 3% di metilcellulosa. (B) Vista ingrandita delle larve schierate come in A.(C ) Immagine confocale live di 2 dpf Tg(mpeg1:EGFP), anteriore a sinistra. (D) Vista ingrandita delle larve in serie, come in A, dimostrando la microiniezione nel ventricolo del cervello posteriore (aghi di microiniezione a freccia nera). (E) Schematico che illustra il targeting di macrofagi residenti in cervello posteriore e immagini confocalie vive (viste dorsali, anteriori a sinistra) della regione del cervello posteriore delle larve Tg(mpeg1:EGFP) e Tg(lyz:EGFP), 3 h a seguito della microiniezione cerebrale di liposomi con etichetta blu (macroosole con etichette di macchie bianche). (F e G) Quantificazione dell'assorbimento del liposoma da parte di macrofagi e neutrofili (come rilevato in E), misurato come numero di cellule contenenti (F) e intensità/cellula di fluorescenza (G) dei liposomi con etichetta Marina Blue. (H) Immagine confocale dal vivo di macrofago lipososoo-carico all'interno del cervello posteriore contrassegnata da un marcatore fluorescente rosso di fagosomi e un marcatore fluorescente di gran lunga rosso di lisosomi all'interno della larva Tg(mpeg1:EGFP), 3 h a seguito della microiniezione di microcerebrale di liposomi marcati Marina Blue. (I) Vista ingrandita delle larve in serie, come in A, che dimostra la microiniezione nel seno venosus (aghi di microiniezione con frecce nere). (J) Schematico che illustra il targeting di macrofagi residenti in CHT e immagini confocalie vive (viste laterali, anteriori a sinistra) della regione CHT di Tg(mpeg1:EGFP) e Tg(lyz:EGFP), 3 h a seguito di microiniezione di liposomi con etichetta blu Marina nei venosus del seno (frecce bianche markosome-laden macrofaages). Le barre di errore vengonovisualizzate in modo significario: SD. p < 0.0001, test tdi Student. Barre di scala: 100 mm (A), 100 m (B), 250 m (C, D e I), 10 m (E), 5 m (H), 50 m (J). Questa cifra è stata modificata rispetto alla precedente pubblicazione24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: La microiniezione di liposomi carichi di un farmaco inibitore di mROS sopprime la produzione di mROS all'interno dei macrofagi attivati. (A) Schematico che illustra il targeting di un farmaco inibitore mROS ai macrofagi e valutailil impatto sull'attivazione dei macrofagi a seguito della stimolazione in cristallo MSU. (B e C) Immagini confocali intempo di macrofagi liposomi (liposomi di controllo/L-C (B) o liposomi inibitori di mROS/L-MI (C)) all'interno del cervello posteriore della larva Tg(mpeg1:EGFP), contrassegnato anche da una sonda fluorescente specifica mROS (vedi Tabella dei materiali, dove il segnale fluorescente viene visualizzato come una mappa di calore con colori caldi che rappresentano livelli più elevati di mROS), 3 h dopo la microiniezione del cervello retropiede di liinfonoso marina blu e cristalli MSU. La fluorescenza Marina Blue è pseudo-colorata in scala di grigi. (D) Quantificazione dell'intensità della fluorescenza della sonda specifica di mROS all'interno dei macrofagi, come rilevato nelle barre di errore B e C. vengono visualizzate la media (SD. )< 0.0001, student's -test. Barra della scala: 10 m (B). Questa cifra è stata modificata rispetto alla precedente pubblicazione24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: La microiniezione di liposomi carichi di un inibitore mROS sopprime l'espressione il1b all'interno dei macrofagi attivati e del reclutamento di neutrofili trainati dai macrofagi. (A) Espressione di il1b (contrassegnata da frecce nere), come rilevata dall'ibridazione in situ, come rilevata dall'intermount in situ ibridazione, all'interno della regione del cervello posteriore 3 h a seguito della microiniezione cerebrale posteriore di controllo (L-C) o dei liposomi inibitori di mROS (L-MI) e dei cristalli MSU, anteriori a sinistra. I numeri rappresentano la proporzione di larve con fenotipi visualizzati. (B) Quantificazione dell'espressione il1b, come rilevato in A, indicato come percentuale larve che dimostra un'espressione alta, bassa o nulla. (C) Immagini confocali di neutrofili all'interno della regione del cervello posteriore delle larve Tg(lyz:EGFP) (viste dorsali, da anteriore a sinistra), come rilevato dall'immunofluorescenza 3 (3 hpi) e 6 (6 hpi) h dopo microiniezione di microiniezione di hbrain di cristalli L-C o L-MI e MSU. (D) Quantificazione temporale dei neutrofili, come rilevato nei cristalli C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) e 9 (9 hpi) h a seguito della microiniezione di cristalli L-C o L-MI e MSU. Le barre di errore vengono visualizzate in modo che indicano : SD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Barre della scala: 100 m (A), 50 m (C). Questa cifra è stata modificata rispetto alla precedente pubblicazione24. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Proprietà fisiochimica dei liposomi (L) | Liposomi di controllo | lisomei inibitori di mROS |
| Dimensioni (m) | 1,2 - 0,07 | 1,1 x 0,04 |
| Potenziale di zeta (mV) | -25,9 x 0,57 | -13,0 - 0,11 |
| Efficienza dell'aumento (EE, %) | N/D | 49.12 - 0,17 |
| Carico di farmaci (DL, %) | N/D | 0,37 - <0.01 |
Tabella 1: Caratteristiche fisiologiche di PBS (controllo) o liposomi inibitori di mROS (i dati sono mezzi di deviazione standard, n . 3). Tutti i liposomi sono stati etichettati con Marina Blue.
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Discussion
Qui, abbiamo fornito un protocollo dettagliato per formulare liposomi caricati da farmaci per indirizzare specificamente i macrofagi nel pesce zebra larvale. Questo metodo può essere utilizzato per sezionare il ruolo dei macrofagi in alcuni modelli di malattia garantendo la somministrazione diretta mirata di farmaci specificamente ai macrofagi. Inoltre, può essere utilizzato quando la tossicità generale dei farmaci limita il loro uso quando viene consegnato da percorsi più convenzionali, come l'immersione. Il protocollo qui descritto fornisce un'alternativa ad altri sistemi nanoparticolati che sono stati utilizzati per colpire le cellule immunitarie innate nel pesce zebra larvale. Questi includono il targeting del farmaco antimalarico rifampicina a i macrofagi infettati da Mycobacterium marinumper promuovere la clearance batterica utilizzando nanoparticelle polimeriche di dimensioni sub-micron39. In un altro esempio, l'incapsulamento di (R)-roscovitine, un induttore di apoptosi neutrofilo, all'interno di polimerosos ha dimostrato di indirizzare questo farmaco ai neutrofili, promuovendo così la risoluzione dell'infiammazione40. In questo protocollo, abbiamo usato i liposomi come veicolo per la somministrazione di farmaci a causa delle loro proprietà non tossiche, biocompatibili e biodegradabili. Inoltre, sono non immunogenici, il che è di particolare importanza quando viene utilizzato per studiare le risposte immunologiche, come quelle descritte qui. Una gamma di carichi può anche essere trasportata tra cui farmaci idrofili, idrofobici, anfipatici e lipofilici.
Quando si esegue questo protocollo, ci sono una serie di passaggi critici in cui è necessario prestare particolare attenzione. Questi includono passi in cui le larve sono fisicamente trattate e deve essere presa cura per ridurre al minimo eventuali danni involontari alle larve. Ciò include quando si dechorionanoling manualmente le larve (soprattutto evitando il contatto con il delicato rivestimento epiteliale del tuorlo), larve di arraying sulla piastra di iniezione, la loro rimozione dalla piastra dopo iniezioni e il loro montaggio per l'imaging confocale vivo. Una componente inevitabile di questo protocollo è la necessità di somministrare i liposomi (e le eventuali sfide immunitarie) attraverso la microiniezione che può causare infiammazione locale e quindi può influenzare l'esito sperimentale. La microiniezione nel pesce zebra larvale richiede un certo grado di allenamento per ridurre al minimo i danni ai tessuti. Nel nostro lavoro, la generazione di un diametro della punta dell'ago di microiniezione di circa 5 m genera danni epiteliali superficiali molto minori (come dimostra una bassissima espressione della matrice del marcatore infiammatorio metallopeptidase 9 all'interno delle cellule epiteliali superficiali nelle immediate vicinanze della microiniezione10) quando si inietta nel ventricolo cerebrale posteriore di 2 larve dpf. Questa punta di diametro è anche abbastanza piccola da evitare perdite di contenuto iniettato, dal ventricolo del cervello posteriore, quando l'ago di microiniezione viene rimosso. È importante notare qui che i volumi di iniezione superiori a 2 nL spesso si traducono in alcuni dei contenuti iniettati traboccante attraverso il foro di iniezione come risultato di superare il volume del ventricolo. Un diametro della punta di 5 m è anche di dimensioni sufficienti per iniettare le successive sfide immunitarie, come i cristalli MSU10. Smussare la punta dell'ago di microiniezione a 45 gradi con una microgrinder in modo da generare una punta affilata può fornire una migliore penetrazione del periderm esterno e degli strati epiteliali basali interni che coprono il ventricolo del cervello posteriore41. È importante notare che le iniezioni di controllo come quelle qui utilizzate (cioè i liposomi di controllo) sono essenziali quando si valutano gli effetti dei liposomi caricati dai farmaci sulla funzione macrofago per controllare il processo di iniezione stesso. La scelta di una concentrazione per un dato farmaco durante la formulazione in liposomi è anche un passo importante in quanto le concentrazioni di farmaci efficaci stabiliti, quando somministrati per immersione, potrebbero differire da quelli necessari quando si utilizza la somministrazione di farmaci mediati di liposoma. Inoltre, quando si utilizza questo protocollo, si dovrebbe fare attenzione a non alterare le caratteristiche fisicochimiche dei liposomi dopo la modifica con poloxamer in quanto ciò può influenzare il loro modello di biodistribuzione.
Un'area di modifica e di sviluppo futuro di questo protocollo sarà quella di studiare l'incorporazione di diverse caratteristiche superficiali ai liposomi come ligandi o recettori per migliorare ulteriormente il targeting e l'assorbimento dei macrofagi, o per colpire diverse cellule immunitarie, come i neutrofili. Questo approccio avanzato richiederà ulteriori studi per scoprire caratteristiche superficiali uniche per i diversi compartimenti cellulari immunitari del pesce zebra, che sono attualmente poco compresi. Ulteriori aree di modifica di questo protocollo includono l'incorporazione di altre sonde fluorescenti nei liposomi per espandere la loro versatilità (ad esempio, quando iniettato in altre linee di reporter transgenici) e alterando le loro proprietà fisiche tali dimensioni e carica42,43. Sarà anche importante esaminare se diverse vie di somministrazione liposoma in diversi stadi larvali possono espandere la loro versatilità per indirizzare ulteriori popolazioni di macrofagi, ad esempio le cellule epiteliali intestinali. Nel protocollo qui dettagliato, tutte le iniezioni sono state eseguite su 2 larve dpf. Durante il terzo giorno di sviluppo del pesce zebra un unico lume continuo dalla bocca all'ano forma, dopo l'apertura della bocca44. Entro il giorno successivo l'ano si apre risultando in un tubo completamente aperto foderato con un epitelio polarizzato44. Sarà interessante vedere se l'immersione delle larve più vecchie nei liposomi può facilitare il targeting di farmaci incapsulati alle cellule epiteliali intestinali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non esistono interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni assegnate a C.J.H. (Health research Council of New sealand and Marsden Fund, Royal Society of New zeealand) e .W. (Faculty Research Development Fund dell'Università di Auckland). Gli autori ringraziano Alhad Mahagaonkar per la gestione esperta della struttura di pesce zebra, la Biomedical Imaging Research Unit, la School of Medical Sciences, l'Università di Auckland per l'assistenza con l'imaging confocale e Graham Lieschke per aver donato la linea di giornalisti Tg(mpeg1:EGFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
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