Summary
Ici, nous décrivons la synthèse des liposomes drug-charged et de leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire dans le but de cibler l’administration de drogue aux cellules de macrophage-lignée.
Abstract
Les larves de poisson zèbre (Danio rerio) sont devenues un modèle populaire pour étudier les interactions hôte-pathogène et la contribution des cellules immunitaires innées aux maladies inflammatoires en raison de leur système immunitaire inné fonctionnellement conservé. Ils sont également largement utilisés pour examiner comment les cellules immunitaires innées aident à guider les processus de développement. En tirant parti de la transparence optique et de la tractabilité génétique du poisson zèbre larvaire, ces études se concentrent souvent sur des approches d’imagerie vivante pour caractériser fonctionnellement les macrophages et les neutrophiles fluorescents marqués chez les animaux intacts. En raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diverse et de leurs rôles sans cesse croissants dans la pathogénie de la maladie, les macrophages ont reçu une attention considérable. En plus des manipulations génétiques, les interventions chimiques sont maintenant couramment utilisées pour manipuler et examiner le comportement des macrophages chez les poissons zèbres larvaires. L’administration de ces médicaments se limite généralement au ciblage passif de médicaments gratuits par immersion directe ou microinjection. Ces approches reposent sur l’hypothèse que tout changement au comportement de macrophage sont le résultat d’un effet direct du médicament sur les macrophages eux-mêmes, et non pas une conséquence en aval d’un effet direct sur un autre type de cellule. Ici, nous présentons nos protocoles pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages de poissons zèbres larvaires en microinjectant des liposomes fluorescents chargés de médicaments. Nous révélons que les liposomes fluorescents bleus 188-modifiés de poloxamer-chargés de drogue sont facilement pris par des macrophages, et pas par des neutrophiles. Nous fournissons également la preuve que les médicaments livrés de cette façon peuvent avoir un impact sur l’activité des macrophages d’une manière compatible avec le mécanisme d’action du médicament. Cette technique sera utile aux chercheurs qui veulent assurer le ciblage des médicaments aux macrophages et lorsque les médicaments sont trop toxiques pour être livrés par des méthodes traditionnelles comme l’immersion.
Introduction
Le système de phagocytemono mononucléaire fournit une première ligne de défense contre les agents pathogènes envahissants. Ce système se compose de monocytes, de cellules dendritiques dérivées de monocytes et de macrophages, qui phagocytos activement les agents pathogènes étrangers, limitant ainsi la propagation des agents pathogènes. En plus de ces fonctions d’effectrice phagocytique et microbicides, les cellules dendritiques et les macrophages sont également capables de produire de la cytokine et de présenter des antigènes pour activer le système immunitaire adaptatif1. Parmi ces cellules, les macrophages ont reçu une attention particulière en raison de leur hétérogénéité fonctionnelle diversifiée et de leur implication dans de multiples maladies inflammatoires, de l’auto-immunité et des maladies infectieuses au cancer2,3,4,5,6,7. La plasticité des macrophages et leur capacité à s’adapter fonctionnellement aux besoins de leur environnement tissulaire nécessite des approches expérimentales pour observer et interroger directement ces cellules in vivo.
Le poisson zèbre larvaire est un organisme modèle idéal pour étudier la fonction et la plasticité des macrophages in vivo8. La transparence optique du poisson zèbre larvaire offre une fenêtre pour observer directement le comportement des macrophages, en particulier lorsqu’il est couplé avec des lignes de reporter transgéniques de marquage macrophage. Exploiter le potentiel d’imagerie en direct et la tractabilité expérimentale du poisson zèbre larvaire a conduit à de nombreuses idées significatives dans la fonction macrophage qui ont une pertinence directe à la maladie humaine9,10,11,12,13,14,15. Bon nombre de ces études ont également profité de la forte conservation de l’activité des drogues chez le poisson zèbre (un attribut qui sous-tend leur utilisation comme une plate-forme de découverte de médicaments animaux16,17,18), en utilisant des interventions chimiques pour manipuler pharmacologiquement la fonction macrophage. Jusqu’à présent, ces traitements pharmacologiques ont été pour la plupart administrés soit par immersion, ce qui exige que le médicament soit soluble dans l’eau, soit par microinjection directe de médicaments gratuits (Figure 1A). Les limites de ces stratégies d’administration passive comprennent des effets hors cible et une toxicité générale qui peuvent empêcher d’évaluer tout impact sur la fonction de macrophage. En outre, lors de l’étude des effets des drogues sur les macrophages, on ne sait pas si les médicaments agissent sur les macrophages eux-mêmes ou par des mécanismes plus indirects. Lors de l’exécution d’études d’intervention chimique similaires pour étudier la fonction de macrophage, nous avons reconnu qu’il y avait un besoin non satisfait de développer une méthode d’administration peu coûteuse et simple pour cibler les médicaments spécifiquement aux macrophages.
Les liposomes sont des vésicules bicouches microscopiques, biocompatibles et lipidiques qui peuvent encapsuler les protéines, les nucléotides et la cargaison de médicaments19. La structure bicouche lipidique unilamellar ou multilamellar des liposomes forme un lumen intérieur aqueux où les drogues solubles dans l’eau peuvent être incorporées tandis que les drogues hydrophobes peuvent être intégrées dans les membranes lipidiques. En outre, les propriétés physicochimiques des liposomes, y compris la taille, la charge et les modifications de surface peuvent être manipulées pour adapter leur ciblage à des cellules spécifiques20,21. Ces caractéristiques des liposomes ont fait d’eux un véhicule attrayant pour livrer des médicaments et d’améliorer la précision des régimes de traitement actuels20. Comme les liposomes sont naturellement phagocytozed par les macrophages (une caractéristique exploitée par leur utilisation courante dans la livraison de clodronate spécifiquement aux macrophages pour les expériences d’ablation22), ils présentent comme une option attrayante pour l’administration de médicaments spécifiques aux macrophages (Figure 1B).
Ce protocole décrit la formulation des médicaments en liposomes fluorescents bleus recouverts du poloxamer 188 polymère hydrophile, qui forme une couche protectrice sur la surface liposome et a été montré pour augmenter la conservation de drogue et ont la biocompatibilité supérieure23. Poloxamer a été choisi pour le revêtement de surface des liposomes comme notre recherche précédente avait montré que, par rapport aux liposomes modifiés de polyéthylène glycol, les liposomes modifiés de poloxamer ont montré une meilleure biocompatibilité suivant l’injection sous-cutanée des pattes de rat et pharmacocinétique semblable dans les lapins suivant l’infusion intraveineuse23. Des protocoles sont également décrits pour leur microinjection dans le poisson zèbre larvaire et la formation image vivante pour évaluer leur capacité de ciblage de macrophage et la localisation aux compartiments intracellulaires nécessaires pour la dégradation de liposome et l’administration cytoplasmique de drogue. Comme preuve de concept, nous avons déjà utilisé cette technique pour cibler deux médicaments aux macrophages pour supprimer leur activation dans un modèle larvaire de poisson zèbre de l’inflammation goutte aigu24. Cette technique d’administration de médicaments élargit la « boîte à outils » chimique à la disposition des chercheurs sur le poisson zèbre qui veulent assurer le ciblage des macrophages de leurs médicaments d’intérêt.
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Protocol
1. Préparation de Liposomes à étiquette bleue Marina
REMARQUE: Liposomes portant le colorant fluorescent bleu, Marina Blue et la drogue sont préparés en utilisant une méthode d’hydratation mince film avec l’insertion post de poloxamer 188. Toutes les procédures sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire. Les liposomes de contrôle ne portent que Le bleu Marina et le PBS. L’exemple décrit ici le chargement de liposomes avec un médicament antioxydant mitochondrie25 qui est utilisé dans les résultats représentatifs comme une preuve de concept.
- Pour préparer les liposomes, dissoudre 16,4 mg (22,2 'mol) des phospholipides 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (voir Tableau des matériaux), 4. 3 mg (11,1 'mol) cholestérol (voir Tableau des matériaux)et 2,8 mg (3,7 'mol) 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (voir Tableau des matériaux, dans 3 ml de chloroforme:méthanol (3:1 v/v) dans un flacon à fond rond de 25 ml.
- Au mélange ci-dessus, ajouter 31 nmol de Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (voir Table of Materials) et 300 nmol d’un médicament inhibiteur mROS (voir Tableau des matériaux) et sonicate brièvement pour se dissoudre complètement. Pour les liposomes témoins, ajoutez seulement Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine.
REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment du colorant fluorescent Marina Blue sensible à la lumière, protégez toutes les procédures de la lumière, dans la mesure du possible. Ceci est également important si le médicament à charger est sensible à la lumière. - Retirer le solvant lentement sur un évaporateur rotatif (voir Tableau des matériaux)sur un bain d’eau à température contrôlée réglé à 45 oC en tournant à 75 tr/min sous pression sous vide (200 mbar pendant 15 min puis 0 mbar pendant 20 min). Ceci forme un film mince sec de lipide dans les murs en verre du flacon qui est encore séché pendant 45 min sous N2 pour faciliter l’enlèvement complet du solvant organique.
- Après la formation du film mince, régler la pression du vide à 40 mbar pendant 15 min, puis purger avec du gaz azoté pendant 30 min pour assurer l’élimination du solvant résiduel.
- Hydrater le film mince à l’aide d’un ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) et sceller avec du parafilm avant d’agiter le flacon à l’aide d’un évaporateur rotatif au-dessus d’un bain d’eau de 60 oC pendant 20 min afin de former des vésicules.
- Soumettre la suspension hydratée à 7 cycles de gel et de dégel en congelant dans le liquide N2 pendant 3 min, suivie d’une immersion dans un bain d’eau de 45 oC pendant 7 min.
- Extruder les liposomes à travers une membrane à l’aide d’un mini-extrudeur (voir Tableau des matériaux) et de 1,0 m de membranes en polycarbonate gravées sur piste (voir Tableau des matériaux)pendant 2-6 cycles afin d’obtenir de grandes vésicules unilamellar.
REMARQUE: Afin d’atteindre un ciblage plus favorable envers les macrophages, manipuler les cycles d’extrusion jusqu’à ce que le diamètre des liposomes est d’environ 1 m26,27,28. - Condensez les liposomes frais en granulés par ultracentrifugation à 186 000 x g et incubez avec 1 ml de 1 % de poloxamer 188 (voir Table of Materials) solution (10 mg/mL en PBS) à 45 oC et 750 tr/min pendant 30 min à l’aide d’un thermomélangeur avec un tube microrifuge de 2 ml (voir Tableau des matériaux).
- Ultracentrifuger le mélange à 186 000 x g pendant 1 h à 4 oC et retirer le supernatant afin d’enlever tout polymère ou médicament non lié. Entreposer les granulés de liposomes à 4 oC, à l’abri de la lumière.
2. Caractérisation de la taille Liposome et du potentiel Zeta
- Diluer la formulation liposome avec de l’eau ultrapure (1:100) et mesurer la taille des particules, l’indice de polydispersité (PDI) et le potentiel zeta des liposomes à l’aide d’un analyseur dynamique de diffusion de lumière (voir Tableau des matériaux),en tripler à 25 oC.
REMARQUE : Le PDI est une mesure de la distribution de la taille de la population de nanoparticules. Les valeurs PDI 'lt; 0.05 indiquent une distribution plus uniforme tandis que les valeurs plus proches de 1 indiquent une distribution de taille plus grande. Le potentiel zeta est la charge globale de surface.
3. Calcul de l’efficacité de piégeage et du chargement de drogue dans les Liposomes
REMARQUE : Pour déterminer l’efficacité de piégeage du médicament dans les liposomes, la teneur en drogue contenue dans le supernatant et le granule de liposome sont mesurées.
- Resuspendre la pastille liposome dans 1 ml de PBS.
- Retirez le supernatant, diluez 10 x avec de l’eau ultrapure et analysez par chromatographie liquide de haute performance (HPLC).
- Pour déterminer la concentration de médicaments dans les liposomes, ajouter 100 ll de suspension liposome à 900 oL de 10 % de solution triton-X100 (pour détruire la membrane lipidique, libérer le médicament piégé et prévenir l’accumulation de lipides dans la colonne HPLC) et vortex pendant 3 min avant l’analyse.
- Injecter 20 ll d’échantillon dans un système HPLC composé d’une pompe quaternaire, d’un auto-échantillonneur à thermostat et d’une colonne de 3 m 250 x 4,6 mm. Définir la phase mobile (10 mM PBS pH 2,5, acetonitrile et méthanol (30:40:30, v/v/v)) le débit à 0,9 mL/min et obtenir des profils spectrals à l’aide d’un détecteur de tableau à diodes réglé à 230 mM.
- Calculez l’efficacité de piégeage (EE) et le chargement de médicaments (DL) à l’aide des équations suivantes :
EE (%) [Moi / Mt] x 100
DL (%) -[Moi / Mlip] x 100
Là où Me est la masse de la drogue encapsulée, Mt est la masse totale de médicament utilisé pendant la formulation et Mlip est la masse totale des lipides (y compris le cholestérol) et la drogue encapsulée.
4. Préparation et injection de Liposomes
- Préparer les aiguilles à microinjection borosilicate en insérant un mince mur borosilicate verre capillaire (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm de longueur) dans un dispositif de traction micropipette (voir Tableau des matériaux) avec les réglages génériques suivants puller (chaleur 680, traction 75, vitesse 40, temps 55 et pression 530) pour produire une aiguille microinjection conique.
- Placer les aiguilles dans un plat Petri sur l’argile de modélisation et disposer d’une manière que l’extrémité tirée ne touche pas le fond du plat. Gardez le couvercle de la vaisselle Petri fermé pour éviter la contamination par la poussière jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
- Diluer les formulations liposome fraîchement préparées 1:1 dans le PBS stérile (pH 7.4) et brièvement le vortex (2-3 s) pour mélanger.
REMARQUE : Protégez les liposomes de la lumière jusqu’à ce que les larves soient prêtes pour la microinjection. - Mettre en place des couples adultes de reproducteurs de poissons zèbres la veille et recueillir des embryons comme décrit précédemment par Rosen et coll.29.
- Transférer les embryons dans un plat Petri (100 mm x 20 mm avec environ 60 embryons par plat) contenant un milieu E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) complété par 0,1 % de méthylène bleu pour inhiber la croissance fongique. Enlever tous les embryons morts ou non fécondés et incuber pendant la nuit à 28,5 oC.
- Pour faciliter l’imagerie en direct, ajouter 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) au média E3 lorsque les embryons atteignent 24 h de développement pour prévenir la formation de pigments (mélanisation).
- Déchorionate manuel les embryons à environ 30 h après la fécondation (hpf) à l’aide de forceps à pointe fine.
REMARQUE : N’utilisez pas le traitement enzymatique pour déchorionate embryons car ceci peut causer des dommages épithélial et l’inflammation locale influençant de ce fait des études immunologiques - Laisser les embryons se développer à 28,5 oC jusqu’à 2 jours après la fécondation (dpf).
- Préparer une plaque d’injection en versant suffisamment de 3% de cellulose méthyle (dans le support E3) dans le couvercle d’un petit plat de culture de 35 mm pour former un film mince couvrant toute la surface.
REMARQUE : Lors de la préparation de la cellulose méthyle de 3 % dans les médias E3, il faut plusieurs jours pour que la cellulose méthyle se dissolve avec une douce agitation sur un shaker orbital. - Anesthésiez les larves en couvant dans des médias E3 complétés par 200 g/mL de Tricaine.
- Recueillir un bassin d’environ 20-25 larves à l’aide d’une pipette de transfert en plastique et permettre aux embryons de se concentrer à l’extrémité de la pipette par gravité. En prenant soin de transférer les larves avec un minimum de liquide, placez-les au milieu du couvercle de la culture de 35 mm.
- À l’aide d’une chargeuse microcapillaire, disposer les larves de la manière suivante : antérieure vers le haut de la plaque d’injection avec la surface dorsale orientée vers l’aiguille de microinjection, pour injecter dans le ventricule postérieur(figure 2A-D); ou, antérieure vers la gauche de la plaque d’injection (lors de l’injection de la droite) avec la surface ventrale orientée vers l’aiguille de microinjection pour injecter dans le venosus sinus (Figure 2I).
REMARQUE : Lorsqu’on leur injecte de cette façon, les macrophages de ventricule-résident arrière-cerveau(figure 2E) et les macrophages hématopoïétiques caudaux (Cht)(figure 2J)peuvent être ciblés, respectivement. La région du TCS du poisson zèbre larvaire est un site hématopoïétique analogue au foie fœtal des mammifères. Portez une attention particulière à ne pas endommager les embryons tout en organisant car cela peut causer une inflammation locale influençant ainsi les études immunologiques. - Prendre des liposomes fraîchement préparés (à partir de l’étape 4.3) et remplir à l’arrière une aiguille d’injection avec environ 5 ll du mélange d’injection liposome à l’aide d’une chargeuse microcapillaire (voir tableau des matériaux).
REMARQUE : Lors de l’évaluation de la localisation des liposomes dans les compartiments phagolysosomal des macrophages (Figure 2H), complétez ce mélange d’injection avec 200 g/mL d’un marqueur fluorescent rouge de phagosomes (voir Tableau des matériaux) et 100 nM d’un marqueur fluorescent rouge lointain de lysosomes (voir Tableau des matériaux)pour marquer les phagosomes30,31 et lysosomes32respectivement. - Monter l’aiguille dans un micromanipulateur (voir Tableau des matériaux) relié à un support magnétique et à un injecteur de pression (voir Tableau des matériaux). Placer sous un stéréomicroscope et placer l’injecteur à une durée d’impulsion d’environ 50 ms et une pression d’injection d’environ 40 psi.
- Couper la pointe de l’aiguille de microinjection avec des pointes fines propres pour générer une ouverture d’environ 5 m de diamètre.
- Calibrer le volume à injecter en injectant un bolus dans une goutte d’huile minérale placée sur les lignes de grille d’un hémocytomètre. Ajuster la durée de l’impulsion et/ou la pression d’injection jusqu’à ce que le diamètre du bolus couvre 2,5 des plus petites lignes de grille (ce qui correspond à un volume d’environ 1 nL).
- Injecter soigneusement 1 nL du mélange d’injection de liposome dans le ventricule postérieur de chaque larve.
REMARQUE : Lorsque vous injectez dans le ventricule postérieur, prenez soin de ne pas pénétrer trop loin ventrale (au-delà du cerveau postérieur) car cela peut perturber la vascularisation sous-jacente conduisant à des hémorragies. Lors de l’injection dans le venosus sinus, il faut veiller à ce que la pointe de l’aiguille se trouve juste à l’intérieur du péricarde et ne pénètre pas le jaune. - Après l’injection, transférez immédiatement les larves injectées dans le support E3 en ajoutant des supports E3 à la plaque d’injection et en agitant doucement les larves hors de la cellulose méthyle à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
- Incuber les larves à 28,5 oC (protégé de la lumière) jusqu’à l’analyse par imagerie confocale vivante.
5. Imagerie confocale et analyse d’image pour confirmer le ciblage macrophage des Liposomes
- Chauffer un bain d’eau à 50 oC.
- Anesthésiez les larves à injection de liposome en transférant vers un nouveau plat Perti contenant des supports E3 complétés par 0,003% de PTU et 200 'g/mL Tricaine.
- Préparer le milieu de montage d’imagerie en direct en dissolvant 1% de faible point de fusion agarose dans les médias E3, complété par 0,003% PTU, dans un micro-ondes. Placer dans le bain d’eau et une fois que la solution a refroidi à 50 oC, ajouter 200 g/mL de Tricaine.
- Gardez le milieu de montage dans le bain d’eau de 50 oC pour éviter la polymérisation prématurée de l’agarose.
- Pour imager la surface dorsale du cerveau postérieur sur un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion en eau (figure 2E), intégrez les larves comme suit : Remplissez un plat de culture de 35 mm avec le milieu de montage (jusqu’à une profondeur d’environ 5 mm) et laissez-le polymériser. Excaver une petite tranchée dans l’agarose qui est de taille suffisante pour accueillir le sac jaune.
- Remplissez une pipette de transfert en plastique avec un milieu de montage en fusion, expulsez une petite quantité et utilisez-la pour recueillir les larves anesthésiées. Transférer immédiatement les larves dans le plat de culture et orienter les sacs de jaune, côté ventral vers le bas, dans les trous excavés, à l’aide d’une chargeuse microcapillaire. Maintenir périodiquement dans cette position jusqu’à ce que l’agarose polymérise. Regroupez-vous avec des supports E3 complétés par une Tricaine de 200 g/mL.
REMARQUE : Lors du transfert et du positionnement des larves, prenez soin de ne pas causer de dommages épithéliales et d’inflammation locale qui peuvent influencer les études immunologiques. Pour le positionnement des larves à l’image vivante de la région du TCS (figure 2J), monter comme décrit ci-dessus, mais positionner les larves dans le trou excavé latéralement. - Lors de l’imagerie sur un microscope confocal inversé, encastrez les larves, sans le lit d’agarose, directement sur le fond d’un plat en verre. Disposez-les de la surface dorsale vers le bas (ou latéralement) et après la polymérisation, couvrez toute la surface du plat avec une couche uniforme de milieu de montage. Une fois polymérisé, ajouter une fine couche de support E3 complétée par 200 g/mL de Tricaine.
- Pour vivre l’image du ventricule postérieur sur un microscope confocal, utilisez les paramètres suivants : 512 x 512 pixels; 40 x 3 piles Z (s’étendant de la surface la plus dorsale de l’arrière-cerveau); objectif 20x; 2.5x zoom.
REMARQUE : En comparant les intensités du signal entre les échantillons (par exemple lors de l’imagerie de l’appréhende de liposomes étiquetés Marina Blue injectés dans les lignes de reporter marquant soit des macrophages [Tg(mpeg1:EGFP)33] ou des neutrophiles [Tg(lyz:EGFP)34]), il est essentiel que les réglages laser soient maintenus les mêmes (g. g., diamètre de trou d’épingle, tension laser, décalage et gain) pour aider à s’assurer que les différences ne sont pas un artefact de paramètres d’acquisition d’image modifiés. - Utilisez un logiciel d’analyse d’image 3D pour quantifier l’utilisation de macrophages ou de neutrophiles des liposomes labellisés Marina Blue. Pour quantifier le nombre de cellules contenant des liposomes (Figure 2F) dans une pile Z, faites défiler les différentes sections Z et comptez le nombre de cellules individuelles contenant des liposomes étiquetés Marina Blue. Pour quantifier l’intensité de fluorescence des liposomes dans les cellules (Figure 2G), dessinez une région d’intérêt autour de chaque cellule (dans les dimensions X, Y et Z) pour quantifier l’intensité de fluorescence totale ou moyenne de Marina Blue intracellulaire.
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Representative Results
L’approche d’hydratation des couches minces décrite ici pour la préparation de liposomes fluorescents enveloppant les médicaments est une méthode simple et rentable. Avec le protocole utilisé dans cette étude, les liposomes devraient être unilamellar23,24. La taille, le potentiel zeta, le chargement des médicaments et l’efficacité du piégeage des liposomes produits sont résumés dans le tableau 1. La taille des particules des liposomes (avant et après la charge de la drogue) est similaire (tableau 1). La charge de surface (potentiel zeta) des liposomes chargés de drogue est légèrement plus neutre par rapport aux liposomes de contrôle, cependant, ils sont tous négativement chargés signifiant ceci ne changera pas de manière significative leur modèle de biodistribution.
La microinjection de liposomes étiquetés Marina Blue dans le ventricule postérieur a comme conséquence l’apaisement rapide par les macrophages résidants qui peuvent être facilement observés par microscopie confocale par l’injection post de 3 h, une fois injectés dans la lignée macrophage-marquage ligne transgénique de journaliste Tg (mpeg1:EGFP)33 (figure 2C,E-G). Cela contraste avec les neutrophiles (comme indiqué dans la ligne de journaliste Tg (lyz:EGFP)34 qui sont rarement observées contenant des liposomes intracellulaires (Figure 2E-G). Dans les macrophages individuels chargés de liposomes, les liposomes s’accumulent dans les compartiments phagolysosomal (Figure 2H), qui est nécessaire pour la dégradation du liposome et la libération ultérieure de leur contenu de drogue dans le cytoplasme35. La sélection de différents sites de microinjection pour l’administration de liposomes peut avoir un impact sur les macrophages tissulaires-résidents qui sont ciblés. À titre d’exemple, la livraison dans le ventricule postérieur cible efficacement les macrophages résidant le cerveau postérieur(figure 2D,E) tandis que la microinjection dans le venosus des sinus peut délivrer les liposomes aux macrophages résidant le TCS par l’intermédiaire de la circulation (Figure 2I,J).
La considération du site de microinjection pour l’administration de liposome est importante en utilisant cette technique pour interroger la réponse de macrophage à un défi immunologique car elle aide à s’assurer que les macrophages particuliers sous l’étude reçoivent le médicament. Nous avons régulièrement utilisé ce protocole pour la livraison de liposomes chargés de médicaments dans le ventricule postérieur pour évaluer l’impact de ces médicaments sur la réponse macrophage aux cristaux d’urate monosodique (MSU), injectés de la même façon dans le compartiment postérieur(figure 3A). En tant qu’agent causal de l’inflammation aigue de goutte, les cristaux de MSU activent des macrophages de tissu-résident pour produire des médiateurs pro-inflammatoires comprenant l’Interleukin-1 (IL-1) par un processus dépendant des espèces réactives mitochondriales d’oxygène (mROS)10,36,37,38. Ces macrophages activés conduisent alors l’infiltration de neutrophile, une marque de l’inflammation goutteuse aigue. La microinjection de liposomes chargés d’un médicament inhibiteur du mROS dans le ventricule du cerveau postérieur peut supprimer considérablement la production de mROS à base de cristaux MSU dans les macrophages de liposome-chargés de liposome -résident de l’arrière-cerveau (Figure 3B-D). En utilisant le protocole décrit ici, nous avons atteint une efficacité de piégeage de 49,12 à 0,17 %, ce qui a donné lieu à une formulation avec une concentration de médicaments de 103,05 à 0,36 m. Il convient de noter que l’injection d’un volume de 1 nL à cette concentration n’a donné lieu à aucune toxicité observable au cours de nos expériences, comme en témoignent les changements morphologiques bruts ou l’arrêt cardiaque. Une validation plus poussée des effets suppressifs de ce médicament sur l’état d’activation des macrophages peut être effectuée en étudiant l’expression il1b (l’ortholog de poisson zèbre de l’IL-1) par l’hybridation in situ de montage entier(figure 4A,B) et le recrutement temporel des neutrophiles (figure 4C,D).
Figure 1 : Schématique illustrant l’administration gratuite de médicaments conventionnels par rapport à l’administration de médicaments à médiation liposome au poisson zèbre larvaire. (A) Les stratégies couramment utilisées pour l’administration de médicaments au poisson zèbre larvaire se limitent en grande partie à l’immersion ou à la microinjection de médicaments gratuits. (B) La microinjection de liposomes chargés de médicaments permet le ciblage direct vers les macrophages, où la dégradation du liposome dans les compartiments phagolysosomal entraîne l’administration de médicaments cytoplasmiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Cibler les médicaments sur les macrophages à l’aide de liposomes fluorescents. (A) Microinjection set-up montrant l’aiguille de microinjection (flèche noire) et les larves disposées dans un plat de culture de tissu de 35 mm dans 3% méthylcellulose. (B) Vue agrandie des larves rangées comme dans A. (C) Image confocale vivante de 2 larves de Tg (mpeg1:EGFP), antérieure à gauche. (D) Vue agrandie des larves rangées, comme dans A, démontrant la microinjection dans le ventricule postérieur (flèche noire marque l’aiguille de microinjection). (E) Illustration schématique du ciblage des macrophages postaux-résidents du cerveau postérieur et des images confocales vivantes (vues dorsales, antérieure à gauche) de la région du cerveau postérieur des larves de Tg (mpeg1:EGFP) et de Tg(lyz:EGFP), 3 h suivant la microinjection de liposomes de Marina Blue (les flèches blanches marquent les macrophages chargés de liposome). (F et G) Quantification de l’utilisation de liposome par des macrophages et des neutrophiles (tel que détecté dans E), mesuré comme le nombre de cellules contenant (F) et l’intensité/cellule de fluorescence (G) des liposomes Marina Blue-labeled. (H) Image confocale vivante du macrophage chargé de liposome dans le cerveau postérieur marqué d’un marqueur fluorescent rouge des phagosomes et d’un marqueur fluorescent rouge lointain des lysosomes dans les larves de Tg (mpeg1:EGFP), 3 h suivant la microinjection de cerveaux postérieurs des liposomes de Marina Blue-labeled. (I) Vue agrandie des larves rangées, comme dans A, démontrant la microinjection dans le venosus de sinus (flèche noire marque l’aiguille de microinjection). (J) Illustration schématique du ciblage des macrophages résidant sur le TCS et des images confocales vivantes (vues latérales, antérieure à gauche) de la région du TCS des larves de Tg (mpeg1:EGFP) et de Tg (lyz:EGFP), 3 h après microinjection de liposomes labellisés Marina Blue dans le sinus venosus (flèches blanches marquent des macrophages chargés de liposome). Les barres d’erreur affichent la moyenne de SD. p lt; 0,0001, Student’s t-test. Barres d’échelle de 100 mm (A), 100 m (B), 250 m (C, D et I), 10 m (E), 5 m (H), 50 m (J). Ce chiffre a été modifié par rapport à la publication précédente24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : La microinjection de liposomes chargés d’un médicament inhibiteur du mROS supprime la production de mROS dans les macrophages activés. (A) Schématique illustrant le ciblage d’un médicament inhibiteur du mROS aux macrophages et évaluant son impact sur l’activation du macrophage après stimulation du cristal MSU. (B et C) Images confocales vivantes de macrophages chargés de liposomes (liposomes de contrôle/L-C (B) ou liposomes/L-MI(C))dans le cerveau postérieur des larves de Tg (mpeg1:EGFP), également marqué d’une sonde fluorescente spécifique au mROS (voir Tableau des matériaux, où le signal fluorescent est affiché comme une carte thermique avec des couleurs chaudes représentant des niveaux plus élevés de mROS), 3 h suivant la microinjection de liposomes étiquetés Marina Blue et cristaux MSU. La fluorescence Bleu Marina est pseudo-colorée à l’échelle grise. (D) Quantification de l’intensité de fluorescence de la sonde spécifique au mROS dans les macrophages, telle que détectée dans b et C. Les barres d’erreur affichent la moyenne d’affichage de la dis . Barre d’échelle de 10 m (B). Ce chiffre a été modifié par rapport à la publication précédente24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : La microinjection de liposomes chargés d’un inhibiteur mROS supprime l’expression il1b dans les macrophages activés et le recrutement de neutrophiles à macrophage. (A) Expression de l’il1b (marquée par des flèches noires), telle qu’elle est détectée par l’hybridation in situ de monture entière, dans la région de l’arrière-cerveau 3 h suivant la microinjection de contrôle de l’arrière-cerveau (L-C) ou les liposomes mROS-inhibiteurs (L-MI) et cristaux de MSU, antérieurà à gauche. Les nombres représentent la proportion de larves présentant des phénotypes affichés. (B) Quantification de l’expression il1b, telle qu’indiquée dans A, indiquée comme des larves en pourcentage démontrant une expression élevée, faible ou nulle. (C) Images confocales de neutrophiles dans la région du cerveau postérieur des larves de Tg (lyz:EGFP) (vues dorsales, antérieure à gauche), telles qu’elles sont détectées par immunofluorescence 3 (3 hpi) et 6 (6 hpi) h après microinjection de l’arrière-cerveau de cristaux L-C ou L-MI et MSU. (D) Quantification temporelle des neutrophiles, détectée dans C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) et 9 (9 hpi) h suite à une microinjection de cristaux L-C ou L-MI et MSU. Les barres d’erreur affichent la moyenne de sD.p 'lt; 0.0001, n.s. pas significatif, à sens unique ANOVA, du test post hoc de Dunnett. Barres d’échelle de 100 m (A), 50 m (C). Ce chiffre a été modifié par rapport à la publication précédente24. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Propriété physicochimique des liposomes (L) | Contrôler les liposomes | liposomes mROS-inhibiteurs |
| Taille (m) | 1,2 à 0,07 | 1,1 à 0,04 |
| Potentiel Zeta (mV) | -25,9 à 0,57 | -13,0 à 0,11 |
| Efficacité de piégeage (EE, %) | N/A | 49,12 à 0,17 |
| Chargement de médicaments (DL, %) | N/A | 0,37 euros(lt;0,01) |
Tableau 1 : Caractéristiques physicochimiques des liposomes PBS (contrôle) ou mROS inhibant (les données sont des moyens - déviation standard, n - 3). Tous les liposomes ont été étiquetés avec Marina Blue.
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Discussion
Ici, nous avons fourni un protocole détaillé pour formuler des liposomes chargés de médicaments pour cibler spécifiquement les macrophages chez les poissons zèbres larvaires. Cette méthode peut être utilisée pour disséquer le rôle des macrophages dans certains modèles de maladies en assurant l’administration ciblée directe de médicaments spécifiquement aux macrophages. En outre, il peut être utilisé lorsque la toxicité générale des médicaments limite leur utilisation lorsqu’ils sont livrés par des routes plus conventionnelles, comme l’immersion. Le protocole décrit ici offre une alternative à d’autres systèmes nanoparticulaires qui ont été utilisés pour cibler les cellules immunitaires innées chez les poissons zèbres larvaires. Il s’agit notamment de cibler le médicament antipaludique rifampicin à Mycobacterium marinum-infectémacrophages pour promouvoir le dégagement bactérien en utilisant des nanoparticules polymères de taille sous-micron39. Dans un autre exemple, l’encapsulation de (R)-roscovitine, un inducteur de l’apoptosis de neutrophile, dans les polymères a été montré pour cibler ce médicament aux neutrophiles, favorisant de ce fait la résolutiond’inflammation 40. Dans ce protocole, nous avons utilisé des liposomes comme véhicule pour la livraison de médicaments en raison de leurs propriétés non toxiques, biocompatibles et biodégradables. En outre, ils sont non immunogènes, ce qui est d’une importance particulière lorsqu’ils sont utilisés pour étudier les réponses immunologiques, telles que celles décrites ici. Une gamme de cargaisons peut également être transportée, y compris les médicaments hydrophiles, hydrophobes, amphipathiques et lipophiles.
Lors de l’exécution de ce protocole, il y a un certain nombre d’étapes critiques où une attention particulière doit être prise. Il s’agit notamment d’étapes où les larves sont manipulées physiquement et des soins doivent être pris pour minimiser les dommages involontaires aux larves. Cela comprend la déchorionating manuel les larves (en particulier en évitant le contact avec la muqueuse épithéliale délicate du jaune), l’alignement des larves sur la plaque d’injection, leur retrait de la plaque après les injections et leur montage pour l’imagerie confocale vivante. Un composant inévitable de ce protocole est la nécessité de livrer les liposomes (et tous les défis immunitaires) par microinjection qui peut causer l’inflammation locale et peut donc influencer les résultats expérimentaux. La microinjection dans le poisson zèbre larvaire nécessite un certain degré de formation pour minimiser les lésions tissulaires. Dans le cadre de nos travaux, la génération d’une microinjection de diamètre de la pointe de l’aiguille d’environ 5 m génère des dommages épithéliales de surface très mineurs (comme en témoigne l’expression très faible de la matrice de marqueur séminciaire inflammatoire metallopeptidase 9 dans les cellules épithéliales de surface à proximité immédiate de la plaie de microinjection10) lors de l’injection dans le ventricule postérieur de 2 larves de dpf. Cette pointe de diamètre est également assez petite pour éviter les fuites de contenu injecté, hors du ventricule postérieur, lorsque l’aiguille de microinjection est enlevée. Il est important de noter ici que les volumes d’injection supérieurs à 2 nL se traduira souvent par une partie du contenu injecté déborder à travers le trou d’injection en raison de dépasser le volume du ventricule. Un diamètre de pointe de 5 m est également de taille suffisante pour injecter des défis immunitaires ultérieurs, tels que les cristaux MSU10. Le fait de léper la pointe de l’aiguille de microinjection à 45 degrés à l’aide d’un microgrinder afin de générer une pointe pointue peut fournir une meilleure pénétration du périridere externe et des couches épithéliales basales intérieures couvrant le ventricule postérieur41. Il est important de noter que les injections de contrôle comme celles utilisées ici (c.-à-d., les liposomes de contrôle) sont essentielles lors de l’évaluation des effets des liposomes de drogue-chargés sur la fonction de macrophage pour commander pour le processus d’injection lui-même. Le choix d’une concentration pour un médicament donné lors de la formulation en liposomes est également une étape importante car les concentrations de médicaments efficaces établies, lorsqu’elles sont administrées par immersion, peuvent différer de celles nécessaires lors de l’utilisation de liposome-mediated livraison de médicaments. En outre, lors de l’utilisation de ce protocole, il faut faire attention de ne pas modifier les caractéristiques physicochimiques des liposomes après la modification avec poloxamer que cela peut affecter leur modèle de biodistribution.
Une zone pour la modification et le développement futur de ce protocole sera d’étudier l’intégration de différentes caractéristiques de surface aux liposomes tels que les ligands ou les récepteurs pour améliorer davantage le ciblage et l’adoption des macrophages, ou pour cibler différentes cellules immunitaires, telles que les neutrophiles. Cette approche avancée nécessitera d’autres études pour découvrir des caractéristiques de surface qui sont uniques aux différents compartiments à cellules immunitaires du poisson zèbre, qui sont actuellement mal compris. D’autres domaines de modification de ce protocole comprennent l’incorporation d’autres sondes fluorescentes dans les liposomes afin d’élargir leur polyvalence (par exemple, lorsqu’elles sont injectées dans d’autres lignes de reporter transgéniques) et de modifier leurs propriétés physiques telles que la taille et la charge42,43. Il sera également important d’examiner si différentes voies d’administration du liposome à différents stades larvaires peuvent étendre leur polyvalence pour cibler d’autres populations de macrophages, par exemple les cellules épithéliales intestinales. Dans le protocole détaillé ici, toutes les injections ont été effectuées sur 2 larves de dpf. Au cours de la troisième journée de développement du poisson zèbre un seul lumen continu de la bouche à l’anus se forme, après l’ouverture de la bouche44. Le jour de l’ouverture de l’anus, l’anus se traduit par un tube complètement ouvert bordé d’un épithélium polarisé44. Il sera intéressant de voir si l’immersion de larves plus âgées dans les liposomes peut faciliter le ciblage des médicaments encapsulés aux cellules épithéliales intestinales.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions accordées à C.J.H. (Health Research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) et Z.W. (Faculty Research Development Fund de l’Université d’Auckland). Les auteurs remercient Alhad Mahagaonkar pour la gestion experte de l’installation de poisson zèbre, de l’unité de recherche en imagerie biomédicale, de l’école des sciences médicales, de l’Université d’Auckland pour son aide en imagerie confocale et graham Lieschke d’avoir offert la ligne de journalistes Tg(mpeg1:EGFP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850355P | |
| 1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850367P | |
| 1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes | GE Healthcare Life Sciences | 110610 | |
| 25 mL round-bottom flask | Sigma-Aldrich | Z278262 | |
| 35 mm culture dish | Thermo Scientific | 150460 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | |
| Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector | Agilent Technologies | G4212B | |
| Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump | Agilent Technologies | G1311B | |
| Agilent 1290 Infinity Series Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | |
| Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | ||
| borosilicate microinjection needles | Warner Instruments | 203-776-0664 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901-100G | |
| cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| Dumont No.5 fine tip forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Eppendorf Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242956003 | |
| Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels | Eppendorf | 4053-6038 | |
| eyelash manipulator | Ted Pella Inc. | 113 | |
| hemocytometer | Hawksley | BS.748 | |
| HEPES | BDH Chemicals | 441474J | |
| HPLC system | Agilent Technologies | 1260 series HPLC system | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1KG | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | |
| LysoTracker Deep Red | Invitrogen | L12492 | 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light. |
| LysoTracker Deep Red | Thermo Scientific | L12492 | |
| magnetic stand | Narishige | GJ-1 | |
| Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) | Invitrogen | M12652 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387-500G | |
| methylene blue | Alfa Aesar | 42771 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-500G | |
| micromanipulator | Narishige | M-152 | |
| mineral oil | Sigma-Aldrich | M-3516 | |
| Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | |
| MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator | Thermo Scientific | M36008 | |
| MitoTEMPO | Sigma-Aldrich | SML0737 | Keep at -20 °C and protect from light. |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | Take care when handling, toxic. |
| NaCl | BDH Chemicals | 27810.295 | |
| PBS (pH 7.4) | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm x 20 mm) | Corning Inc. | 430167 | |
| Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column | Phenomenex | 00G-4439-E0 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Thermo Scientific | P35361 | |
| pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate | Invitrogen | P35361 | Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4. |
| plastic transfer pipette | Medi'Ray | RL200C | |
| poloxamer 188 | BASF Corporation | ||
| pressure injector | Applied Scientific Instruments | MPPI-2 | |
| rotary evaporator | Büchi, Flawil, Switzerland | Büchi R-215 Rotavapor | |
| Scanning confocal microscope | Olympus | Olympus FV1000 FluoView | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 75000090 | |
| stereomicroscope | Leica | MZ12 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C. |
| triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Ultrasonic bath | Thermo Scientific | FB-11205 | |
| Volocity Image Analysis Software | PerkinElmer | version 6.3 | |
| water bath | |||
| Zetasizer Nano | Malvern Instruments Ltd | Zetasizer Nano ZS ZEN 3600 |
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