Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

Published: February 18, 2020 doi: 10.3791/60198
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Molecular Medicine and Pathology, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland, 2School of Pharmacy, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland, 3School of Medicine, Faculty of Medical and Health Sciences, University of Auckland

Summary

כאן, אנו מתארים את הסינתזה של ליפוזומים בסמים שנטענו וההזרקה שלהם לזחל הדגים מטרה למטרה לכוון מסירת סמים לתאי השושלת מקרופאג.

Abstract

Zebrafish (danio rerio) הזחלים התפתחו למודל פופולרי לחקור אינטראקציות מארח הפתוגן והתרומה של תאים חיסוניים מולדים למחלות דלקתיות בשל המערכת החיסונית שלהם שימור פונקציונלית מולדים. הם גם משמשים רבות כדי לבחון כיצד תאים חיסוניים מולדים לסייע להדריך תהליכים התפתחותיים. על-ידי ניצול השקיפות האופטית ואת השיטות הגנטיות של זחל צברפיש, מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות על גישות הדמיה חיה לאפיין פונקציונלי מסומנים פלואורוסקופים ונויטרופילים בתוך בעלי חיים שלמים. בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם והרחבת תפקידים בפתוגנזה המחלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב משמעותית. בנוסף למניפולציות גנטיות, התערבויות כימיות משמשות כעת באופן שגרתי כדי לתמרן ולבחון התנהגות מקרופאג בזחל מדגים. מסירת תרופות אלה מוגבלת בדרך כלל למיקוד פסיבי של תרופה חופשית באמצעות טבילה ישירה או מיקרוהזרקה. גישות אלה מסתמכות על ההנחה כי כל שינוי התנהגות מקרופאג הם תוצאה של השפעה ישירה של הסם על מקרופאגים עצמם, ולא תוצאה במורד הזרם של השפעה ישירה על סוג תא אחר. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו במטרה לכוון תרופות במיוחד לזחל מקרופאגים באמצעות מיקרוהזרקת סמים שנטענו ליפוזומים. אנו חושפים כי poloxamer 188-שונה ליפוזומים לתרופות פלורסנט כחול הם נלקח בקלות על ידי מקרופאגים, ולא על ידי נויטרופילים. כמו כן, אנו מספקים ראיות לכך שסמים הנמסרים בדרך זו יכולים להשפיע על מקרופאג פעילות באופן עקבי עם מנגנון פעולת התרופה. טכניקה זו יהיה ערך לחוקרים המבקשים להבטיח המיקוד של תרופות מקרופאגים וכאשר הסמים רעילים מדי כדי להיגאל על ידי שיטות מסורתיות כמו טבילה.

Introduction

מערכת פגוציט מספק קו ההגנה הראשון נגד הפולשים פתוגנים. מערכת זו מורכבת מונוציטים, תאים דנדריטים מונוציט נגזר ו מקרופאגים, אשר באופן פעיל phagocytoze פתוגנים זרים, ובכך להגביל את התפשטות הפתוגן. בנוסף לפונקציות אלה phagocytic ו microbicidal התאים הדנדריטים מקרופאגים הם גם מסוגלים ייצור cy, אנטיגן-מצגת כדי להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית1. של תאים אלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב מיוחדת בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם ומעורבות מחלות דלקתיות מרובות, מ חסינות אוטומטית מחלות זיהומיות לסרטן2,3,4,5,6,7. הפלסטיות של מקרופאגים ויכולתם להסתגל מבחינה פונקציונלית לצרכים בסביבת הרקמה שלהם מחייבת גישות נסיוניות להתבונן ישירות ולחקור תאים אלה בvivo.

זחל זהפיש הם אורגניזם מודל אידיאלי שדרכו ללמוד את הפונקציה ואת הפלסטיות של מקרופאגים ב vivo8. השקיפות האופטית של זחל דג זברה מספק חלון כדי להתבונן ישירות התנהגות של מקרופאגים, במיוחד כאשר ביחד עם קווי הכתב הטרנסגניים מקרופאג. ניצול פוטנציאל ההדמיה החי ואת היכולת הניסיונית של זחל הדגים הובילו לתובנות משמעותיות רבות לפונקציה מקרופאג שיש להן רלוונטיות ישירה למחלה האנושית9,10,11,12,13,14,15. רבים ממחקרים אלה ניצלו גם את היתרון של שימור גבוה של פעילות הסמים ב-דג זברה (תכונה המסופינים השימוש שלהם בתור בעלי חיים לגילוי התרופה שלמה16,17,18), על ידי ניצול התערבויות כימיות כדי פרמקולוגית לטפל מקרופאג פונקציה. עד כה, טיפולים תרופתי אלה נמסרו בעיקר באמצעות טבילה, אשר דורש את הסם להיות מסיסים במים, או על ידי מיקרוהזרקה ישירה של תרופה חופשית (איור 1א). מגבלות אלה אסטרטגיות מסירה פסיבית כוללים אפקטים מחוץ ליעד ורעילות כללית העלולה למנוע הערכה כל השפעה על מקרופאג function. בנוסף, כאשר חקירת תופעות התרופה על מקרופאגים זה לא ידוע אם הסמים פועלים על מקרופאגים עצמם או באמצעות מנגנונים עקיפים יותר. בעת ביצוע התערבות כימית דומה במחקרים לחקור פונקציה מקרופאג, הכרנו היה צורך לא מוכר לפתח שיטת משלוח זולה וישירה כדי למקד את התרופות במיוחד מקרופאגים.

ליפוזומים הינם מיקרוסקופיים, ביולוגיים, בעלי שומנים מיקרוסקופים, שיכולים לכמס חלבונים, נוקלאוטידים ומטענים של סמים19. מבנה השומנים הunilamellar או רב-לאמצ'יני במבנה של ליפוזומים מהווה לומן פנימי מימית שבו ניתן לשלב תרופות מסיסים במים בעוד תרופות הידרופובי ניתן לשלב בקרומים השומנים. בנוסף, המאפיינים הפיזיקליים של ליפוזומים, כולל גודל, חיוב ושינויי פני שטח ניתן לתמרן כדי להתאים את המיקוד שלהם לתאים ספציפיים20,21. תכונות אלה של ליפוזומים עשו להם רכב אטרקטיבי לספק סמים ולשפר את הדיוק של הטיפול הנוכחי משטרי20. כמו ליפוזומים הם באופן טבעי phagocytozed על ידי מקרופאגים (תכונה מנוצלת על ידי שימוש שגרתי שלהם באספקת clodronate במיוחד מקרופאגים עבור ניסויים אבלציה22), הם מציגים כאופציה אטרקטיבית עבור משלוח סמים ספציפי מקרופאג (איור 1B).

פרוטוקול זה מתאר את הניסוח של תרופות ליפוזומים כחול פלורסנט מצופה עם הידרופילי פולימר poloxamer 188, כי צורות שכבת הגנה על ליפוכמה משטח והוכח כדי לשפר את שמירת הסמים יש ביולוגי מעולה23. Poloxamer נבחרה לציפוי פני השטח של ליפוזומים כמו המחקר הקודם שלנו הראו כי, כאשר לעומת פוליאתילן גליקול שונה ליפוזומים, poloxamer שונה ליפוזומים הראה תאימות ביולוגית טובה יותר בעקבות הזרקה תת עורית של כפות הראש ואת פרמקוקינטיקה דומה בארנבים בעקבות עירוי אינפוזיה23. הפרוטוקולים מתוארים גם עבור המיקרו ההזרקה שלהם לתוך זחל הדמיה חיה להעריך את היכולת המקרופאג שלהם ולוקליזציה לתאים תאיים הנחוצים ליפוכמה השפלה ומשלוח תרופות cytoplasmic. כהוכחה-of-קונספט בעבר השתמשנו בטכניקה זו כדי למקד שתי תרופות מקרופאגים כדי לדכא את ההפעלה שלהם במודל זחל דג זברה של דלקת gouty חריפה24. טכניקה זו מסירת סמים מרחיבה את "ערכת הכלים" הכימית הזמינה לחוקרי דג זברה המבקשים להבטיח מקרופאג-פילוח של תרופות הריבית שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ליפוזומים בסמים שנטענו על ידי מרינה בלו

הערה: ליפוזומים הנושאים את צבע הפלורסנט הכחול, מרינה כחול וסמים מוכנים באמצעות שיטת השחות הסרט דק עם החדרת ההודעה של poloxamer 188. כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. ליפוזומים בקרה מעבירים. רק את מרינה בלו ו-PBS הדוגמה כאן מתארת את טעינת ליפוזומיםעם תרופה נגד נוגדי חמצון המיטו, המשמשת בתוצאות הנציגים כהוכחה למושג.

  1. כדי להכין ליפוזומים, לפזר 16.4 mg (22.2 μpa) של פוספוליפידים 1, 2-dipalmitoyl-sn-גליקו-3- פוספולולין (ראה טבלת חומרים), 4.3 mg (11.1 μov) כולסטרול (ראה טבלת חומרים) ו-2.8 מ"ג (3.7 μמול) 1, 2-מחלת-sn-סופרנובה-3-פוספולינולינה (ראה טבלת חומרים, ב 3 מ ל של כלורופורם: מתנול (3:1 v/v) ב 25 מ"ל בקבוקון עגול.
  2. לתערובת לעיל, להוסיף 31 nmol של מרינה כחול 1, 2-dihexadecanoyl-sn-פוספוליקו-פוחואטיאנמין (ראה טבלת חומרים) ו 300 nmol של תרופה מעכב mros (ראה טבלת חומרים) ו sonicate לזמן קצר כדי להמיס במלואו. עבור ליפוזומים בקרה, רק להוסיף מרינה כחול 1, 2-dihexadecanoyl-sn-גליליקו-פוספהואטיאנאמין.
    הערה: כדי למנוע הלבנה של צבע פלורסנט מרינה כחול רגיש לאור, להגן על כל ההליכים מפני אור, היכן שניתן. דבר זה חשוב גם אם התרופה לטעינה היא תלויית-אור.
  3. הסר את הממס לאט על מאייד רוטרי (ראה טבלת חומרים) על מקלחת טמפרטורה מבוקרת מים להגדיר 45 ° צ' על ידי סיבוב ב 75 סל ד תחת לחץ ואקום (200 mbar עבור 15 דקות ולאחר מכן 0 mbar עבור 20 דקות). זה יוצר סרט יבש השומנים דק בתוך קירות זכוכית של הבקבוקון כי הוא מיובש נוסף עבור 45 דקות תחת N2 כדי להקל על ההסרה המלאה של הממס האורגני.
  4. לאחר היווצרות של הסרט הדק, להגדיר את הלחץ ואקום כדי 40 mbar עבור 15 דקות, ואז לטהר עם גז חנקן עבור 30 דקות כדי להבטיח הסרה של שאריות הממס.
  5. מימה את הסרט הדק באמצעות 1 מ ל של מלוחים פוספט באגירה (PBS, pH 7.4) ו חותם עם parafilm לפני הלטרוף את הבקבוקון באמצעות מאייד רוטרי מעל 60 מעלות באמבט מים במשך 20 דקות כדי ליצור שלפוחיות.
  6. נושא ההשעיה להתייבש 7 מחזורים של הקפאה והפשרה על ידי הקפאת N נוזלי2 עבור 3 דקות ואחריו טבילה באמבט מים 45 ° c עבור 7 דקות.
  7. הבלטת ליפוזומים באמצעות קרום באמצעות הבלטת ממד (ראו טבלת חומרים) ו-1.0 יקרומטר ממברנות פוליקרבונט מעקב (ראה טבלת חומרים) עבור 2-6 מחזורים כדי להשיג unilamellar שלפוחיות גדולות.
    הערה: כדי להשיג התמקדות חיובית יותר כלפי מקרופאגים, לטפל מחזורים ההבלטה עד קוטר של ליפוזומים הוא כ 1 יקרומטר26,27,28.
  8. לדחוס את ליפוזומים טריים לתוך כדור על ידי מיקוד ב 186,000 x g ו-מארג עם 1 מ ל של 1% poloxamer 188 (ראה טבלת חומרים) פתרון (10 מ"ג/mL ב-PBS) ב 45 ° צ' ו 750 rpm עבור 30 דקות באמצעות thermomixer עם מצורף 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה (ראה לוח חומרים).
  9. Ultracentrifuge את התערובת ב 186,000 x g עבור 1 h ב 4 ° c ולהסיר את supernatant כדי להסיר פולימר או תרופה לא מאוגד. לאחסן את כדורי ליפוזומים ב -4 ° c, מוגן מפני אור.

2. אפיון ליפופי גודל ופוטנציאל זטה

  1. לדלל ליפודי ניסוח עם מים באולטרסאונד (1:100) ולמדוד את גודל החלקיקים, המדד הפולידיפיטיות (PDI) ו זטה פוטנציאל של ליפוזומים באמצעות מנתח פיזור אור דינמי (ראה טבלת חומרים), בטריליפיאט ב -25 ° c.
    הערה: ה-PDI הוא מדד לפיזור הגודל של האוכלוסיה הננו-חלקיק. ערכי PDI < 0.05 מציין התפלגות אחידה יותר בעוד שהערכים הקרובים ל-1 מצביעים על התפלגות גודל גדולה יותר. פוטנציאל הזטה הוא. המטען הכולל של השטח

3. חישוב יעילות מלכודת והעמסה של סמים בליזומים

הערה: כדי לקבוע את יעילות המלכוד של התרופה ליפוזומים, תכולת התרופה הכלולה בסופרנטאנט וליפוכי הגלולה נמדדת.

  1. להשעות את הגלולה בתוך 1 מ ל של PBS.
  2. מסירים את הסופרנטאנט, מדלל 10 x עם מים באולטרטהורים ומנתחים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים.
  3. כדי לקבוע את ריכוז התרופה בתוך ליפוזומים, להוסיף 100 μL של ליפוכי ההשעיה כדי 900 μL של 10% טריטון-X100 פתרון (כדי להרוס את קרום השומנים, שחרור התרופה לכוד ומניעת השומנים לבנות בתוך העמודה ולאחר מכן) ומערבולת עבור 3 דקות לפני הניתוח.
  4. הכנס 20 μl של מדגם לתוך מערכת המערכת המורכבת של משאבת הרביעון, התרמוסטט אוטומטי-דוגם ו 3 יקרומטר 250 x 4.6 mm עמודה. הגדר את השלב הנייד (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrile ו מתנול (30:40:30, v/v/v)) שיעור הזרימה 0.9 mL/min ולהשיג פרופילים ספקטרליים באמצעות גלאי מערך דיודה להגדיר ב 230 mM.
  5. לחשב את יעילות מלכודת (הנדסת חשמל) והעמסת סמים (DL) באמצעות המשוואות הבאות:
    EE (100%)
    DL (100%)
    כאשר אני המסה של התרופה המאסיבית, Mt הוא מסה כוללת של התרופה המשמשת במהלך ניסוח ו-Mlip הוא מסה כוללת של השומנים (כולל כולסטרול) ותרופות שעברו אנקפסולציה.

4. הכנה והזרקה של ליפוזומים

  1. הכנת בורוסיליקט מחטים מיקרו הזרקה על ידי החדרת הקיר דק בורוסיליקט זכוכית נימי (1 מ"מ מנת יתר x 0.78 מ"מ זיהוי x 10 ס מ אורך) לתוך מכשיר פולר מיקרופיפטה (ראה טבלת חומרים) עם הגדרות הפולר הגנרית הבאים (חום 680, משוך 75, מהירות 40, זמן 55 ולחץ 530)
  2. מניחים את המחטים לתוך צלחת פטרי על חימר הדוגמנות ולסדר בדרך כי הסיום הוא לא נוגע בתחתית המנה. שמרו על מכסה הצלחת פטרי סגור כדי למנוע זיהום אבק עד שהוא מוכן לשימוש.
  3. לדלל טרי-מוכן ליפוכמה ניסוחים 1:1 ב-PBS סטרילי (pH 7.4) ובקצרה מערבולת (2-3 s) כדי לערבב.
    הערה: הגנו על ליפוזומים מהאור עד שהזחלים יהיו מוכנים להזרקה.
  4. כוונן זוגות מבוגרים של הרבייה דגים בלילה לפני ולאסוף את העוברים כפי שתוארו בעבר על ידי רוזן ואח '29.
  5. להעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ בסגנון עם כ 60 עוברים לכל מנה) המכיל E3 בינוני (5 מ"מ הנאגל, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 Mm MgSO4) שיושלם עם 0.1% מתילן כחול לעכב צמיחה פטרייתיים. הסירו את כל העוברים המתים או הבלתי מופרות במשך הלילה ב-28.5 ° c.
  6. כדי להקל על הדמיה חיה, להוסיף 0.003% N-פניylourea (ptu) לתוך E3 מדיה כאשר העוברים להגיע 24 h של פיתוח כדי למנוע היווצרות פיגמנט (מלאניזציה).
  7. באופן ידני לביטול העוברים ב כ 30 h הפריה הפוסט (hpf) באמצעות מלקחיים טיפ עדין.
    הערה: אין להשתמש בטיפול אנזימטי לעוברי הדאוורגון, העלולים לגרום נזק לאפיתל ולדלקת מקומית ובכך להשפיע על לימודים אימונולוגיים.
  8. תנו לעוברים להתפתח ב-28.5 ° צ' עד 2 ימים לאחר ההפריה (dpf).
  9. להכין צלחת זריקה על ידי שפיכת 3% מתיל תאית (ב E3 מדיה) לתוך המכסה של מאכל קטן 35 mm התרבות כדי ליצור סרט דק המכסה את המשטח כולו.
    הערה: בעת הכנת 3% מתיל תאית ב E3 מדיה, זה לוקח כמה ימים עבור מתיל תאית להתמוסס עם עצבנות עדינה על שייקר מסלולית.
  10. הרדים הזחלים על ידי דגירה ב E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL של Tricaine.
  11. לאסוף בריכה של כ 20-25 הזחלים באמצעות פיפטה העברה פלסטיק ולאפשר לעוברים להתרכז בקצה של הפיפטה על ידי כוח הכבידה. מטפל להעביר את הזחלים עם נוזל מינימלי, למקם אותם באמצע המכסה של מכסה התרבות 35 מ"מ.
  12. באמצעות מטעין מיקרונימי, לסדר את הזחלים בדרכים הבאות: קדמית לקראת החלק העליון של צלחת ההזרקה עם המשטח הקדמי פונה לכיוון המחט מיקרוהזרקה, כדי להזריק לתוך החדר הקדמי המוח (איור 2a-D); או, הקדמי לכיוון שמאל של לוחית ההזרקה (בעת הזרקת מימין) עם המשטח הגחוני פונה לכיוון המחט מיקרוהזרקה כדי להזריק לתוך venosus הסינוס (איור 2I).
    הערה: כאשר מוזרק בדרך זו, המוח השחדר לחדר-תושב (איור 2E) ו הרקמה המטודתית (CHT)-תושב (איור 2J) מקרופאגים ניתן לפלח, בהתאמה. אזור הCHT של הזחל הוא אתר המטפטי הדומה לכבד העוברי של היונקים. לשים לב בנוסף לא לפגוע העוברים תוך הסדרת כי זה עלול לגרום לדלקת מקומית ובכך להשפיע על לימודים אימונולוגיים.
  13. לקחת ליפוזומים טרי (משלב 4.3) ובחזרה למלא מחט הזריקה עם כ 5 μL של ליפוכמה לערבב הזרקה באמצעות מטעין מיקרונימי (ראה טבלת חומרים).
    הערה: בעת הערכת הלוקליזציה של ליפוזומים לתאי phagolysoזומאים של מקרופאגים (איור 2H), תוספת זו לערבב הזרקה עם 200 μg/mL של סמן פלורסנט אדום של phagoזומים (ראה טבלה של חומרים) ו 100 nM של סמן פלורסנט אדום רחוק של lysosomes (ראה טבלת חומרים) כדי לסמן phagoזומים30,31 ו lysosomes32, בהתאמה.
  14. טעינת המחט לתוך מיקרומניפולציה (ראו טבלת חומרים) המחוברת למעמד מגנטי ומזרק ללחץ (ראו לוח חומרים). מיקום תחת stereomicroscope ולהגדיר את מזרק על משך הדופק של כ 50 ms ו לחץ הזרקה של כ 40 psi.
  15. חותכים את הקצה של המחט מיקרוהזרקה עם מלקחיים משובחים בסדר תשר כדי ליצור פתיחה של כ 5 יקרומטר קוטר.
  16. כיול את עוצמת הקול המוזרקת על-ידי הזרקת מנת ההזנה לתוך טיפה של שמן מינרלי הממוקם מעל קווי הרשת של הומוציטוטומטר. כוונן את משך הפעימה ו/או לחץ ההזרקה עד שקוטרו של ההזנה מכסה 2.5 של קווי הרשת הקטנים ביותר (זה מתאים לנפח של כ-1 nL).
  17. בזהירות להזריק 1 nL של ליפוכמה לערבב הזרקה לתוך החדר המוח השמאלי של כל הזחלים.
    הערה: כאשר מזריקים לחדר האחורי של המוח האחורי, יש לדאוג לא לחדור מרחוק מדי (מעבר לראש המוח), שכן הדבר עלול לשבש את היסוד המוביל לדימום. כאשר מזריקים לתוך venosus הסינוס, יש לנקוט כדי להבטיח את קצה המחט הוא רק בתוך קרום הלב ולא חודר את החלמון.
  18. לאחר ההזרקה, העבר מיד את הזחלים המוזרקים חזרה לתוך E3 מדיה על ידי הוספת E3 מדיה לצלחת ההזרקה בעדינות להפוך את הזחלים מתוך התאית מתיל באמצעות פיפטה העברה פלסטיק.
  19. מודגנת את הזחלים ב 28.5 ° צ' (מוגן מפני אור) עד לניתוח על ידי הדמיה מיקוד חי.

5. הדמיה confocal וקד וניתוח תמונה כדי לאשר מקרופאג פילוח של ליפוזומים

  1. מחממים אמבט מים עד 50 ° c.
  2. הרדים ליפופי מוזרק הזחלים על ידי העברת תבשיל Perti חדש המכיל E3 מדיה בתוספת 0.003% PTU ו 200 μg/mL Tricaine.
  3. להכין הדמיה חיה הרכבה בינונית על ידי המסת 1% התכה נמוכה agarose ב E3 מדיה, שיושלם עם 0.003% PTU, במיקרוגל. מקום באמבט מים ופעם הפתרון מקורר 50 ° c, להוסיף 200 μg/mL של Tricaine.
  4. שמרו על מדיום ההרכבה באמבט המים 50 ° c כדי למנוע פילמור מוקדם של הצמח.
  5. כדי לדמות את המשטח החלק הפנימי של המוח השטרם על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בעדשה טבילה מים (איור 2E), להטביע את הזחלים כדלקמן: למלא את הגידול 35 mm עם בינוני הרכבה (לעומק של כ 5 מ"מ) ולתת לו לפולימו. חפירת תעלה קטנה ב-agarose, כי הוא בגודל מספיק כדי להכיל את שק החלמון.
  6. מילוי פיפטה להעברת פלסטיק עם מדיום הרכבה מותכת, לגרש כמות קטנה, ולהשתמש בו כדי לאסוף את הזחלים רדימים. העבירו מיד את הזחלים לתוך קערת התרבות, והפכו את שקי החלמון למטה, לתוך החורים שנחפרו, בעזרת מטעין מיקרונימי. מדי פעם שומרים אותם בתנוחה הזאת עד שהוא התעורר. כיסוי עם E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL Tricaine.
    הערה: בעת העברת ומיקום הזחלים, לדאוג לא לגרום נזק אפיתל ודלקת מקומית אשר יכול להשפיע על לימודים אימונולוגיים. לצורך מיקום הזחלים לחיות תמונה באזור CHT (איור 2J), הר כפי שמתואר לעיל, אלא למקם את הזחלים בתוך החור שנחפר בחפירות.
  7. כאשר הדמיה על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, להטביע את הזחלים, ללא מיטה agarose, ישירות על החלק התחתון של הצלחת התחתונה זכוכית. מסדרים אותם למטה (או מתחת למים) ובעקבות הפלמור, כסו את משטח הכלים כולו עם שכבה אפילו של מדיום. לאחר הפילמור, להוסיף שכבה דקה של E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL של Tricaine.
  8. כדי לחיות את התמונה החדר השמאלי המוח על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, להשתמש בהגדרות הבאות: 512 x 512 פיקסלים; 40 x 3 יקרומטר Z-ערימות (הארכת מן המשטח הפנימי ביותר של המוח המוחלק); המטרה 20x; 2.5 x זום.
    הערה: בעת השוואת עוצמות האות בין דגימות (לדוגמה, בעת הדמיה של קליטת ליפוזומים מרינה כחול המוזרקים בתוך קווי הכתב לסמן את מקרופאגים [Tg (mpeg1: egfp)33] או נויטרופילים [Tg (lyz: egfp)34]), חיוני כי הגדרות לייזר נשמרות זהה (למשל, בקוטר חריר, מתח לייזר, היסט ולהרוויח) כדי לסייע להבטיח כל הבדלים אינם פריט של הגדרות רכישת תמונה משתנה.
  9. השתמש 3D ניתוח תמונה התוכנה כדי לכמת מקרופאג או הספיגה נויטרופילים של מרינה כחול התווית ליפוזומים. כדי לכמת את מספר התאים המכילים ליפוזומים (איור 2F) בתוך z-מחסנית, לגלול בסעיפים z בודדים ולספור את מספר התאים הבודדים המכילים ליפוזומים מרינה כחול התווית. כדי לכמת את העוצמה הפלואורסצנטית של ליפוזומים בתוך תאים (איור 2G), לצייר אזור של עניין סביב כל תא (ב X, Y ו-Z ממדים) כדי לכמת את העוצמה הכוללת או מתכוון הזריחה של מרינה כחול תאיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הגישה של הסרט הדק המתואר כאן להכנת ליפוזומים פלורסנט התרופה התוחמת היא שיטה פשוטה וחסכונית. עם הפרוטוקול המשמש במחקר זה, היפוזומים צפויים להיות unilamellar23,24. הגודל, פוטנציאל זטה, העמסה של סמים ויעילות מלכודת של ליפוזומים המיוצרים מסוכמים בטבלה 1. גודל החלקיקים של הליזומים (לפני ואחרי העמסת הסמים) דומים (טבלה 1). מטען השטח (הפוטנציאל זיטה) של סמים טעונים ליפוזומים הוא מעט נייטרלי יותר לעומת ליפוזומים שליטה, עם זאת, הם כולם טעונה שלילית משמעות זה לא לשנות באופן משמעותי את דפוס biodistribution התפלגות שלהם.

הזרקה של מרינה כחול שכותרתו ליפוזומים לתוך החדר המוח המטופל התוצאות ספיגה מהירה על ידי מקרופאגים תושב זה יכול להיות נצפתה בקלות על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד על ידי הזרקת ההודעה 3 h, כאשרמוזרק לתוך מקרופאג שושלת היוחסין לסימון הכתב קו Tg (mpeg1: egfp)33 ( זה בניגוד נויטרופילים (כפי שמסומן בתוך נויטרופילים ספציפי Tg (lyz: EGFP)34 הכתב קו) כי הם נצפו לעתים רחוקות המכיל ליפוזומים תאיים (איור 2E-G). בתוך ליפופאגים בודדים לאדן, הליזומים להצטבר בתוך תאי phagolysoזומיום (איור 2H), אשר הכרחי ליפוכמה השפלה ושחרורו הבאים של תוכן הסמים שלהם לתוך ציטופלסמה35. בחירת אתרים שונים מיקרו הזרקה עבור ליפומי משלוח יכול להשפיע איזה רקמה תושבת מקרופאגים מיועדים. כדוגמאות, משלוח לתוך חדר המוח השטרם ביעילות מטרות מקרופאגים שוכני המוח (איור 2D, E) ואילו מיקרוהזרקה לתוך venosus הסינוס יכול לספק את ליפוזומים כדי מקרופאגים המתמחים באמצעות זרימת הדם (איור 2I, J).

התחשבות באתר המיקרו הזרקה עבור ליפומה המסירה חשוב בעת שימוש בטכניקה זו כדי לחקור את התגובה מקרופאג לאתגר אימונוולוגי כפי שהוא מסייע להבטיח מקרופאגים מסוימים תחת החקירה מקבלים את הסם. השתמשנו באופן שגרתי פרוטוקול זה עבור מסירת סמים טעונים ליפוזומים לתוך החדר המוח המבוקר כדי להעריך את ההשפעה של תרופות אלה על התגובה מקרופאג מוננתרן urate (MSU) קריסטלים, באופן דומה מוזרק לתוך תא המוח המוחלק (איור 3א). כמו סוכן סיבתי של דלקת gouty חריפה, קריסטלים msu להפעיל מקרופאגים שוכני רקמות לייצר pro-דלקתיים מגשרים כולל interleukin-1β (IL-1β) באמצעות תהליך התלוי על מינים החמצן תגובתי מיטוכונדריאלי (msu)10,36,37,38. אלה מקרופאגים שהופעלו לאחר מכן לכונן הסתננות נויטרופילים, סימן ההיכר של דלקת gouty חריפה. הזרקה של ליפוזומים טעון עם תרופה mROS מעכבים לתוך החדר המוח הפנימי יכול באופן משמעותי לדכא את הייצור של מונחה קריסטל MROS בתוך ליפוגים המוח המקרופאאגים תושב (איור 3ב-D). באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, השגנו יעילות מלכודת של 49.12 ± 0.17%, אשר הביא ניסוח עם ריכוז התרופה של 103.05 ± 0.36 μM. לתשומת לב, הזרקת אמצעי אחסון אחד בריכוז זה הביאה לחוסר הרעלה במהלך הניסויים שלנו, כפי שמעידים על שינויים מורפולוגיים ברוטו או דום לב. אימות נוסף של ההשפעות המדכא של תרופה זו על מצב הפעלה מקרופאג יכול להתבצע על ידי חקירת il1b ביטוי (הדו האורתופיש של IL-1β) על ידי הר שלם היברידיזציה באתרו (איור 4A, B) ואת הגיוס הזמני של נויטרופילים (איור 4C, D).

Figure 1
איור 1: סכימטי הממחישות משלוח סמים קונבנציונאלי בחינם לעומת העברת סמים בתיווך מסירת התרופה לזחל הדגים. (א) אסטרטגיות המשמשות באופן שגרתי להעברת תרופות לזחל בדגים מוגבלים במידה רבה לטבילה, או הזרקה של, תרופה חופשית. (ב) מיקרוהזרקה של ליפוזומים בסמים שנטענו מאפשר מיקוד ישיר מקרופאגים, שם השפלה ליפוכמה בתוך תאי phagolysoזומביים תוצאות משלוח תרופות cytoplasmic. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: לכוון תרופות מקרופאגים באמצעות ליפוזומים פלורסנט. (א) הגדרת מיקרוהזרקה המציגה מחט מיקרוהזרקה (חץ שחור) והזחלים ה35 בצלחת תרבות הרקמה בתוך 3% מתילתאית. (ב) הנוף המוגדל של הזחלים מסודר כמו בשנת A. (C) לחיות בדמות הזחלים 2 DPF (mpeg1: egfp) , הקדמי לשמאל. (ד) תצוגה מוגדלת של הזחלים הסדר, כמו ב, הוכחת מיקרוהזרקה לתוך החדר המוח השטרם (סימני חץ שחור המחט מיקרוזרקת). (ה) סכמטי התמקדות במיקוד של מקרופאגים שוכני-המוח ותמונות בשידור חי (תצוגות מקדמיות, קדמית לשמאל) של אזור המוח הקודם של tg (MPEG1: egfp) ו TG (lyz: egfp) הזחלים, 3 h לאחר הזרקת המוח הקודם של מרינה כחול ליפוזומים בעלי תווית (F ו- G) הקוונפיקציה של ליפומה ספיגה של מקרופאגים ו נויטרופילים (כפי שזוהו ב-E), נמדד כמספר התאים המכילים (F) ואת עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית/תא (G) של מרינה כחול התווית ליפוזומים. (ח) לחיות בדמות מוקד של ליפופי מקרופאג בתוך המוח המוחלק מסומן עם סמן פלורסנט אדום של phagosomes וסמן פלורסנט אדום רחוק של lysosomes בתוך Tg (MPEG1: egfp) הזחלים, 3 H לאחר הזרקת המוח בעקבות מיקרו ליפוזומים מרינה כחול. (I) מוגדלת התצוגה של הזחלים הסדר, כמו ב, הוכחת מיקרוהזרקה לתוך venosus סינוס (שחור החץ סימני המחט מיקרוזרקת). (J) סכמטי התמקדות כמטרה של מקרופאגים בעלי תושבת האזור ובשידור חי (השקפות לרוחב, קדמית לשמאל) של הזחלים של ה-cht (mpeg1: egfp) ו -tg (lyz: egfp) , 3 שעות לאחר ההזרקה של מרינה כחול ליפוזומים בצבע הסינוס (החצים ל קווי שגיאה להציג ממוצע ± SD. *p< 0.05; p < 0.0001, מבחן tשל הסטודנט. סרגל ברים = 100 מ"מ (A), 100 יקרומטר (ב), 250 יקרומטר (C, D, ואני), 10 יקרומטר (E), 5 יקרומטר (ח), 50 יקרומטר (J). איור זה שונה מהפרסום הקודם24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הזרקה של ליפוזומים טעון עם תרופה mROS מעכב מדכא ייצור mros בתוך מקרופאגים המופעל. (A) סכמטי המדגימה את המיקוד של תרופה mros מעכב מקרופאגים והערכת ההשפעה של זה על הפעלה מקרופאג לאחר גירוי בדולח mros. (B ו- C) לחיות בתמונות קונפוקלית וקד של ליפוקרופאגים מסוימים (ליפוזומים שליטה/l-C (ב) או mros-מעכב ליפוזומים/L-MI (ג)) בתוך המוח הקדמי של Tg (mpeg1: egfp) הזחלים, מסומנים גם עם החללית פלורסנט mros ספציפי (ראה טבלת חומרים, שם אות פלורסנט מוצג כמפת החום עם צבעים חמים המייצגים רמות גבוהות יותר של mros), 3 h לאחר הזרקת המוח מיקרוהזרקה של מרינה כחול התווית ליפוזומים וקריסטלים mros. מרינה פלואורסצנטית כחול בצבע מדומה בגווני אפור. (ד) כימות של עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית ספציפי של mros בתוך מקרופאגים, כפי שזוהו B ו-C. בסרגלי שגיאות להציג ממוצע ± SD. * * * *p < 0.0001, מבחן tשל הסטודנט. סרגל קנה מידה = 10 יקרומטר (ב). איור זה שונה מהפרסום הקודם24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הזרקה של ליפוזומים טעון עם מעכב mROS מדכא ביטוי il1b בתוך מקרופאגים הופעל מקרופאג מונחה נויטרופילים הגיוס. (א) ביטוי של il1b (מסומןעל ידי חיצים שחורים), כפי שזוהו על ידי הר שלם בהיברידיזציה באתרו, בתוך אזור המוח הקודם 3 h לאחר הזרקת המוח הקודם של שליטה (l-C) או mros-עיכוב ליפוזומים (l-MI) ו-mros קריסטלים, הקדמי לשמאל מספרים מייצגים חלק של זחלים עם פנוטיפים מוצגים. (ב) כימות של ביטוי il1b , כפי שזוהה ב-A, כפי שהוא מראה הזחלים אחוז המפגינים גבוה, נמוך או לא ביטוי. (ג) תמונות confocal וקד של נויטרופילים בתוך האזור הקודם של Tg (LYZ: egfp) הזחלים (מצופה, הקדמי לשמאל), כפי שזוהה על ידי immunofluorescence 3 (3 hpi) ו-6 (6 hpi) h בעקבות הזרקת המוח של L-C או l-MI ו msu קריסטלים (ד) הקוונפיקציה הטמפורלית של נויטרופילים, כפי שזוהה C, 1 (1 hpi), 3 (3 hpi), 6 (6 hpi) ו -9 (9 hpi) h לאחר הזרקת המוח מיקרוהזרקה של l-C או l-MI ו-msu קריסטלים. קווי שגיאה להציג ממוצע ± SD. * * * *p < 0.0001, נ לא משמעותי, בכיוון אחד ANOVA, מבחן post-הוק של דנטו. קנה מידה ברים = 100 יקרומטר (A), 50 יקרומטר (ג). איור זה שונה מהפרסום הקודם24. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מאפיין ליפוזומים (L) ליפוזומים בקרה ליפוזומים מעכבים
גודל (μm) 1.2 ± 0.07 1.1 ± 0.04
פוטנציאל זטה (mV) -25.9 ± 0.57 -13.0 ± 0.11
יעילות מלכודת (הנדסת חשמל,%) N/A 49.12 ± 0.17
טעינת סמים (DL,%) N/A 0.37 ± < 0.01

טבלה 1: המאפיינים הפיזיקליים של PBS (שליטה) או ליפוזומים מעכבים של mROS (נתונים משמעו ± סטנדרטי, n = 3). כל הליפוזומים סומנו. באמצעות מרינה בלו

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט כדי לנסח ליפוזומים בסמים שנטענו למטרה במיוחד מקרופאגים בזחל החוצה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח את התפקיד של מקרופאגים במודלים של מחלות מסוימות על ידי הבטחת מסירת ממוקדות ישירה של תרופות במיוחד מקרופאגים. כמו-כן, ניתן להשתמש בה כאשר רעילות כללית של סמים מגבילה את השימוש בהם כאשר הם מועברים על ידי נתיבים קונבנציונליים יותר, כמו טבילה. הפרוטוקול המתואר כאן מספק אלטרנטיבה למערכות nanoparticulate אחרות, ששימשו למטרת מטרה בתאי החיסון המוולדים בזחל-דג. אלה כוללים מיקוד גריסופלובין התרופה מלריה, כדי מקרופאגים הנגועים של פטרתלקדם את הסיווג חיידקים באמצעות sub-מיקרון גודל פולימריים חלקיקים39. בדוגמה אחרת, כריכת (R)-roscovitine, השראה של נויטרופילים ואפופטוזיס, בתוך polymerosomes הוכח למקד את הסם הזה נויטרופילים, ובכך לקדם את הרזולוציה דלקת40. בפרוטוקול זה, השתמשנו ליפוזומים ככלי לאספקת סמים עקב תכונות שאינן רעילות, סתיימים ומתכלה. כמו-כן, הם לא-אימונוגניים, שהיא בעלת חשיבות מיוחדת כאשר משתמשים בהם לחקירת תגובות אימונולוגיים, כגון אלה המתוארים כאן. ניתן לשאת מגוון של קאראגוס גם כולל הידרופיפילית, הידרופובי, אמפיפתיים ותרופות ליפופילית.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, ישנם מספר שלבים קריטיים שבהם יש לנקוט טיפול מיוחד. אלה כוללים שלבים בהם הזחלים מטופלים פיזית וטיפול יש לנקוט כדי למזער כל נזק לא מכוון לזחלים. זה כולל כאשר באופן ידני להסיר את הזחלים (במיוחד הימנעות מגע עם רירית האפיתל עדין של החלמון), הזחלים לסדר את לוחית ההזרקה, הוצאתם מן הצלחת בעקבות זריקות והרכבה שלהם עבור הדמיה מיקוד חי. מרכיב בלתי נמנע של פרוטוקול זה הוא הצורך לשלוח את הליזומים (ואת כל האתגרים החיסוניים) באמצעות מיקרו הזרקה אשר יכול לגרום לדלקת מקומית ולכן עשוי להשפיע על התוצאה הניסיונית. הזרקת מיקרוזפיש לזחל מחייבת מידה מסוימת של הכשרה כדי למזער את הנזק לרקמות. בעבודתנו, יצירת מחט מיקרוהזרקה בקוטר טיפ של כ 5 יקרומטר יוצר נזק משטח מאוד מינורי האפיתל (כפי שמעידים על ידי ביטוי נמוך מאוד של מטריקס סמן מטריצה דלקתית מטטיפדאז 9 בתוך התאים האפיתל משטח בסביבה הקרובה של הפצע מיקרוהזרקה10) כאשר מזריקים לתוך החדר התחתון של עצה בקוטר זה הוא גם קטן מספיק כדי למנוע דליפה של תוכן מוזרק, מתוך החדר המוח השטרם, כאשר המחט מיקרוהזרקה מוסרת. חשוב לציין כאן כי אמצעי ההזרקה גדול יותר 2 nL לעתים קרובות לגרום לחלק מהתוכן המוזרקים מוצפת בחור ההזרקה כתוצאה מחריגה מנפח החדר. קוטר העצה של 5 יקרומטר הוא גם בגודל מספיק כדי להזריק את האתגרים החיסונית הבאים, כגון קריסטלים msu10. מסתובב את המחט מיקרו הזרקה כדי 45 ° עם מיקרו מטחנת כדי ליצור טיפ חדה עשוי לספק חדירה טובה יותר של החיצוני periderm הרובד הפנימי שכבות האפיתל המכסה את המוח השטרם הראש41. חשוב לציין כי זריקות שליטה כמו אלה המשמשים כאן (כלומר, שליטה ליפוזומים) חיוניים בעת הערכת ההשפעות של ליפוזומים סמים טעון על מקרופאג פונקציה לשלוט על תהליך ההזרקה עצמה. בחירת ריכוז עבור תרופה נתונה כאשר הניסוח ליפוזומים הוא גם צעד חשוב כמו הוקמה ריכוז התרופה יעיל, כאשר מועברת על ידי טבילה, עשוי להיות שונה מאלה הנחוצים בעת שימוש ליפומם בתיווך התרופה. בנוסף, בעת שימוש בפרוטוקול זה, צריך להיזהר לא לשנות את המאפיינים הפיזיקליים של השינוי ליפוזומים פוסט עם poloxamer כמו זה עשוי להשפיע על דפוס biodistribution התפלגות שלהם.

אזור לשינוי ופיתוח עתידי של פרוטוקול זה יהיה לחקור את שילוב תכונות שונות של פני השטח ליפוזומים כגון ליגונים או קולטנים כדי לשפר עוד יותר מקרופאג פילוח וספיגת, או כדי למקד תאים חיסוניים שונים, כגון נויטרופילים. גישה מתקדמת זו ידרוש מחקרים נוספים כדי לחשוף תכונות משטח הייחודיים לתאי תא החיסונית שונים של המערכת, אשר כרגע מובנים בצורה גרועה. אזורים נוספים עבור שינוי פרוטוקול זה כוללים שילוב של בדיקה פלורסנט אחרים לתוך ליפוזומים כדי להרחיב את צדדיות שלהם (למשל, כאשר מוזרק לתוך שורות הכתב הטרנסגניים אחרים) ושינוי התכונות הפיזיות שלהם גודל כגון וטעינה42,43. זה יהיה גם חשוב לבדוק אם מסלולים שונים של ליפוכמה הממשל בשלבי זחל שונים יכולים להרחיב את צדדיות שלהם למקד אוכלוסיות מקרופאג נוספות, למשל תאים אפיתל המעי. בפרוטוקול המפורט כאן, כל הזריקות בוצעו על 2 הזחלים. במהלך היום השלישי של התפתחות הדגים התפתח לומן מתמשך אחד מהפה לצורות הרקטום, בעקבות פתיחת הפה44. ביום החופשי פי הטבעת נפתח וכתוצאה מכך צינור פתוח לחלוטין הסתיים מרופדת עם אפיתל מקוטב44. זה יהיה מעניין לראות אם טבילה של זחלים מבוגרים בליפוזומים יכול להקל על המיקוד של תרופות כדוריות לתאי אפיתל המעי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי לא קיימים אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שהוענקו C.J.H. (בריאות המועצה של ניו זילנד וקרן מרסדן, החברה המלכותית של ניו זילנד) ו Z.W. (קרן הפקולטה לפיתוח מחקר מאוניברסיטת אוקלנד). המחברים מודים alhad מהפך מהאגקאר עבור ניהול מומחה של מתקן דג זברה, יחידת הדמיה ביו-רפואית, בית הספר למדעי הרפואה, אוניברסיטת אוקלנד לסיוע עם הדמיה קונפוקלית וקד ו גרהם lieschke עבור gifting של Tg (mpeg1: egfp) כתב קו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE) Avanti Polar Lipids, Inc. 850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes GE Healthcare Life Sciences 110610
25 mL round-bottom flask Sigma-Aldrich Z278262
35 mm culture dish Thermo Scientific 150460
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector Agilent Technologies G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump Agilent Technologies G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat Agilent Technologies G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc. Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles Warner Instruments 203-776-0664
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901-100G
cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Dumont No.5 fine tip forceps Fine Science Tools 11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip Eppendorf 5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels Eppendorf 4053-6038
eyelash manipulator Ted Pella Inc. 113
hemocytometer Hawksley BS.748
HEPES BDH Chemicals 441474J
HPLC system Agilent Technologies 1260 series HPLC system
KCl Sigma-Aldrich P9541-1KG
low melting point agarose Invitrogen 16520-100
LysoTracker Deep Red Invitrogen L12492 1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red Thermo Scientific L12492
magnetic stand Narishige GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE) Invitrogen M12652 Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol Sigma-Aldrich 34860
methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387-500G
methylene blue Alfa Aesar 42771
MgSO4 Sigma-Aldrich 230391-500G
micromanipulator Narishige M-152
mineral oil Sigma-Aldrich M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator Thermo Scientific M36008
MitoTEMPO Sigma-Aldrich SML0737 Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G Take care when handling, toxic.
NaCl BDH Chemicals 27810.295
PBS (pH 7.4) Gibco 10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm) Corning Inc. 430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column Phenomenex 00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Thermo Scientific P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate Invitrogen P35361 Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette Medi'Ray RL200C
poloxamer 188 BASF Corporation
pressure injector Applied Scientific Instruments MPPI-2
rotary evaporator Büchi, Flawil, Switzerland Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope Olympus Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge Thermo Scientific 75000090
stereomicroscope Leica MZ12
Tricaine Sigma-Aldrich A5040-25G Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Ultrasonic bath Thermo Scientific FB-11205
Volocity Image Analysis Software PerkinElmer version 6.3
water bath
Zetasizer Nano Malvern Instruments Ltd Zetasizer Nano ZS ZEN 3600

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  2. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  3. Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
  4. Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
  5. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
  6. Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  9. Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
  10. Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
  11. Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
  14. Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  15. Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
  16. Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
  17. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  18. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  19. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
  20. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
  21. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  22. Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
  23. Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
  24. Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
  25. Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
  26. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
  27. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
  28. Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
  29. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  30. Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
  31. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  32. Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
  33. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  34. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  35. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
  36. Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
  37. Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
  38. Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
  39. Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
  40. Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
  41. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
  42. Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
  43. Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
  44. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 156 zebrafish מקרופאגים ליפוזומים משלוח סמים חסינות מולדת הדמיה חיה
הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. … More

Linnerz, T., Kanamala, M., Astin, J. W., Dalbeth, N., Wu, Z., Hall, C. J. Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes. J. Vis. Exp. (156), e60198, doi:10.3791/60198 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter