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Neuroscience

使用路西法黄电磷学可视化星形形态

doi: 10.3791/60225 Published: September 14, 2019

Summary

星形细胞是形态复杂的细胞,其多重过程和茂密的区域就是例证。为了分析它们的精细形态,我们提出了一种可靠的方案,用于在轻度固定组织中执行细胞内路西法黄色淋病。

Abstract

星形细胞是神经回路的重要组成部分。它们将整个中枢神经系统 (CNS) 分片,并参与各种功能,包括神经递质清除、组子调节、突触调节、神经元代谢支持和血流调节。星形细胞是一个复杂的细胞,具有索马,几个主要分支,和许多精细的过程,接触神经皮内不同的细胞元素。为了评估星形细胞的形态,有必要有一个可靠和可重复的方法来可视化其结构。我们报告一种可靠的方案,在成年小鼠的轻度固定脑组织中使用荧光路西法黄色(LY)染料对星形细胞进行细胞内电泳。该方法具有几个特征,可用于表征星形细胞形态。它允许对单个星形细胞进行三维重建,这有利于对其结构的不同方面进行形态分析。免疫组织化学与LY电泳也可用于了解星形细胞与神经系统不同成分的相互作用,并评估标记的星形细胞中蛋白质的表达。该协议可以在各种中枢神经系统疾病小鼠模型中实现,用光显微镜严格检查星形细胞形态。LY风泳提供了一种评估星形细胞结构的实验方法,特别是在损伤或疾病的情况下,这些细胞被建议经历显著的形态变化。

Introduction

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星形细胞是中枢神经系统(CNS)中最丰富的胶质细胞。它们在ion平衡、血流调节、突触形成以及消除和神经递质接受1中发挥作用。星形细胞函数的范围广泛反映在其复杂的形态结构2,3。星形细胞包含几个初级和次要分支,它们分为数千个细枝和传单,直接与突触、树突、斧头、血管和其他胶质细胞相互作用。星形细胞形态因大脑区域而异,这可能暗示它们在神经元回路4中不同地执行其功能的能力。此外,星形细胞已知在发育期间、生理条件和多种疾病状态3、5、6期间改变其形态。

需要一种一致、可重复的方法来准确解决星形细胞形态的复杂性。传统上,免疫性细胞化学已经被用来可视化星形细胞与星形细胞特定或星形细胞富集蛋白质标记。然而,这些方法揭示了蛋白质表达的模式,而不是星形细胞的结构。常用的标记物,如胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和S100钙结合蛋白β(S100+),不表达在整个细胞体积中,因此不解决完整的形态7。在星形细胞中普遍存在的荧光蛋白(病毒注射或转基因小鼠报告线)的遗传方法可以识别更细的分支和整体区域。然而,很难区分单个星形细胞,并且分析可能偏向于特定启动子8所针对的星形细胞群。串行截面电子显微镜已被用来揭示星形细胞过程与突触相互作用的详细图片。由于数以千计的星形细胞过程接触突触,目前无法用这种技术9重建整个细胞,尽管随着使用机器学习方法进行数据分析,这种情况预计会发生变化。

在本报告中,我们重点介绍了使用细胞内风泳与Lucifer黄色(LY)染料来描述小鼠星形细胞的过程,以CA1层辐射为例。该方法是基于埃里克·布松和马克·埃利斯曼10、11的开创性过去工作。从轻固定脑切片的星形细胞由其独特的索马形状识别,并充满LY。然后,细胞通过共聚焦显微镜进行成像。我们演示了如何使用LY淋巴磷光来重建单个星形细胞,并对其过程和领地进行详细的形态分析。此外,该方法可与免疫组织化学结合使用,以识别星形细胞和神经元、其他胶质细胞和脑血管之间的空间关系和相互作用。我们认为LY电泳是一个非常合适的工具,用于分析不同大脑区域的形态和小鼠模型的健康或疾病状况7,12,13。

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Protocol

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这项研究中的动物实验是按照美国国家卫生指南,在实验室动物的护理和使用,并批准校长的动物研究委员会在洛杉矶加州大学。所有实验中都使用了混合性别的成年小鼠(6-8周大)。

1. 解决方案准备

  1. 人工脑脊液(ACSF)溶液
    1. 在每个实验前制备新鲜的 ACSF 溶液(135 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl 2、14.7 mM NaHCO3、11mM D-葡萄糖、1.25 mM Na2HPO4和 2 mM CaCl2)。在最后一步中添加 MgCl2和 CaCl2。将部件溶解在优质去离子水中。
    2. 在实验前,在水浴和泡用 95% O2/ 5% CO2孵育 ACSF 溶液 35°C 时至少 30 分钟。
    3. 加入2%的盐酸利多卡因,在ACSF(在100 mL中)达到0.02%的最终浓度。
  2. 固定解决方案
    1. 使用10%形式缓冲磷酸盐。
  3. LY 染料溶液
    1. 通过在 5 mM KCl. 涡流中彻底溶解 LY CH 二锂盐或 LY CH 二钾盐,制备 1.5% LY 染料溶液。1 mL 的体积足以进行多次实验。
    2. 在16,800 x g下离心10分钟。然后,用0.2μm注射器过滤器过滤上清液进入新管中。等分可保持4°C长达3个月。
      注:离心机和过滤染料溶液,以防止染料颗粒聚集,这可能会堵塞电极,这一点至关重要。

2. 小鼠转毛灌注和脑解剖

  1. 准备用于跨卡灌注的设备和鼠标
    注:
    可以使用任一性别的C57/BL6小鼠。经验观察,该方法要可靠工作,小鼠年龄不应超过3个月(6-8周大是理想的)。这一点很重要。灌注协议如下所述。有关详情14,则须提供另一份参考资料。
    1. 使用 ACSF 溶液清除灌注管,以去除管中任何气泡。按使用顺序设置手术工具(钳子、弯曲、钝剪刀、虹膜剪刀)。
    2. 在将2~3 mL的胶质胶添加到室后,将小鼠放入一个极性诱导室,对小鼠进行深度麻醉。等待1⁄2分钟,麻醉效果。确保呼吸不会停止。
    3. 测试脚趾捏反射。当鼠标对疼痛刺激无反应且反射不存在时,请继续操作。将动物固定在上侧位置,将头部置于呼吸锥中,氧气中提供 5% 的异二苯,四肢和尾部被贴在化学烟气罩内。
  2. 跨卡灌注
    1. 使用钳子,抬起肋骨笼下的皮肤。用弯曲的钝剪刀在皮肤上切开5⁄6厘米,露出腹腔。向上穿过腹壁,直到肝脏和隔膜可见。
    2. 轻轻地将肝脏移离图表。使用虹膜剪刀,在隔膜中做一个3⁄4厘米的横向切口。
    3. 沿着身体的两侧穿过肋骨笼,露出胸腔。小心不要损害心脏和避免肺部。抬起胸骨,露出心脏。
    4. 一旦心脏可见,将0.05 mL的肝素钠溶液(每mL1,000 USP)注射到左心室作为抗凝剂。然后,小心地将灌注针插入左心室。确保针头留在心室,并且不会刺穿其他心室。用虹膜剪刀在右中庭做一个小切口。
    5. 以大约 10 mL/min 的速度注入 ACSF 溶液,直到体内存在的液体清除血液(1⁄2 分钟)。
    6. 从 ACSF 解决方案切换到固定解决方案,而不会引入任何气泡。在10~20 mL/分钟时,用固定溶液注入10分钟。
      警告:小心,没有固定溶液从鼻子流出。这表明针头到达右心室,固定剂正传播到肺部,而不是通过全身回路到达身体的其余部分。
  3. 大脑解剖
    1. 用剪刀取出鼠标头,仔细解剖头骨上的老鼠大脑。在室温下放置固定溶液1.5小时,在固定后短时间。
      注:良好的灌注是成功LY充磷所必需的。大脑应该是白色,脑血管中没有血液。身体和四肢应该显得僵硬。

3. 切片制备

  1. 海马切片的制备
    1. 在室温下用0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗大脑5分钟。然后,用滤纸擦干大脑,用锋利的剃刀刀片去除嗅球和小脑。
    2. 使用氰丙烯酸酯胶水将大脑安装在振动托盘上,并在室温下将 PBS 填充托盘。切割海马日冕部分厚度为110微米。
      注:调整振动器的设置,以确保切片具有相同的厚度和均匀的表面。对于此实验,使用速度设置 4.5 和频率设置 8,这是仪器上的任意设置(材料表)。用户可能需要在其他设备上试用这些设置。
    3. 从托盘中收集部分,放在冰上的PBS盘中。

4. 电极制备

  1. 准备具有适当电阻的锋利电极。
    1. 使用带细丝(外径 1.0 mm、I.D. 0.58 mm)的硼硅酸盐玻璃单管电极。在微移液器拉拔器上拉电极(材料表)。在 5 mM KCl 中填充 1.5% LY 的理想电极在放入 PBS 槽时应具有 200 MΩ 的电阻。
      注:拉拔器设置因设备(所用机器类型和拉拔丝)而异。较高的热设置通常提供更长和更精细的提示。对于本实验中使用的微移液器拉拔器,设置为:热:317,拉拔:90,速度:70,延迟:70。使用了槽型灯丝。
    2. 将电极存放在封闭的容器中,以防止灰尘进入尖端。保持电极从盒子底部升高,以防止尖端断裂。
  2. 用LY染料溶液填充电极。
    1. 将电极置于垂直位置,尖端朝下。将1⁄2 μL的LY溶液移液到电极背面,等待5~10分钟,使溶液通过毛细管作用移动到尖端。
    2. 轻轻地将填充电极固定在连接到操纵器的电极支架中。
      注:电极支架的银线需要与电极内的 LY 接触。根据需要调整 LY 溶液的体积,具体取决于导线长度。

5. 用磷化填充星形细胞

  1. 测试电极。
    1. 在室温下,将脑切片轻轻放入装有0.1M PBS的玻璃底盘中。用尼龙串的铂金竖琴将切片放在原位。
    2. 确保电极连接到电压源,并将接地电极放入包含脑切片的槽中。
    3. 将目标移动到感兴趣的大脑区域。
    4. 将电极放入溶液中。在明亮的视野下,将其移到视场的中心,用 40x 水浸透镜仔细检查,以确保它看起来清晰且无碎屑或气泡。如果电极尖端有堵塞内容,请用新电极尖更换。
      注:堵塞是 200 MΩ 电极的一个关注点。每次实验前,染料溶液都会离心和过滤,这应该不会是一个常见的问题。然而,由于电极的尖端很小,组织有时可能会卡在开口中。作者还没有找到一种方法来防止这种情况,但只需使用新的电极即可轻松解决。
    5. 使用 488 nm 激光在共聚焦激光扫描显微镜下观察电极尖端。然后,在 12 V 处打开刺激器,测试染料弹出。如果在电压刺激时没有或很少的染料被喷射,请更换电极。
    6. 在明亮的场下,缓慢地将电极降低到表面正上方的切片处。
  2. 用风泳填充星形细胞。
    1. 使用红外差分干扰对比度 (IR-DIC) 识别切片表面以下 40~50 μm 的星形细胞。寻找直径约10微米的长方形椭圆形索马塔的细胞。选择星形细胞后,将其移动到视场的中心。
      注:一个好的细胞,用于异磷脂,有清晰的边界周围。不要选择离切片表面太近的单元格,因为它们不能完全填充。需要几天的练习才能正常地识别用于染料填充的星形细胞。根据用于实验的大脑区域,星形细胞的数量可能会有所不同。这可能会影响在填充前识别星形细胞所需的时间。
    2. 慢慢地将电极尖端降低到切片中,在组织中导航,直到它与细胞体位于同一平面上。
      注:缓慢移动电极,以避免损坏组织。
    3. 一旦星形细胞的细胞体清晰可见并轮廓,缓慢而轻轻地向前推进电极。移动电极,直到尖端刺穿细胞的索马。缓慢上下移动目标的焦点,以注意到电极是否位于索马内。
      注:电极尖端必须位于细胞体内,并且应观察索马上的小凹痕。请勿进一步移动电极,以免尖端穿过电池。
    4. 电极尖端位于电池内后,以 ±0.5+1 V 打开刺激器,并连续将电流喷射到细胞中。使用共聚焦显微镜观察细胞填充。增加数字变焦以查看电池的详细信息,并确保电极尖端在电池内可见。
      注:如果染料似乎从电池中泄漏或填充附近的其他电池,则降低电压。如果染料似乎仍在从细胞中泄漏,则缓慢地拉出电极并找到另一个细胞。重要的是,染料不会泄漏,在最终图像中具有高信号/背景比。
    5. 等待约 15 分钟,直到更精细的分支和过程出现定义,关闭电压,轻轻地从电池中取出电极尖端。
  3. 将填充的单元格图像。
    注:
    在填充或使用免疫罐化学染色后,可立即进行成像。数值孔径 (NA) 较高的目标可产生更好的分辨率。
    1. 等到细胞返回到原始形式,然后成像(15~20分钟)与40倍物镜。要对单元格进行成像,请调整共聚焦上的设置,以确保看起来更精细的分支和进程出现定义。
    2. 设置步长大小为 0.3 μm 的 z 堆栈。成像时,移动目标,直到没有来自细胞的信号,并将其设置为顶部。然后,向下移动目标(聚焦在单元格中),直到没有信号,将目标设置为底部。
    3. 成像完成后,检查电极是否喷出染料。如果出现大型染料云,则可用于下一个切片。否则,请用新电极更换。
      注:单个星形细胞的染料填充和成像大约需要 45 分钟到 1 小时。对于这个特定的实验,有可能获得每只小鼠大约3⁄6个细胞。如果需要,可以在同一切片上标记多个单元格。然而,要区分单个星形细胞,一定要在细胞之间保持约200μm的距离。

6. 与免疫组织化学染色(可选)

  1. 一旦成像完成,立即将切片放入10%的形式在冰上保存,用于免疫性化学。将脑切片保存在黑暗中,在4°C下储存过夜。
  2. 用0.5%非离子表面活性剂(即Triton X 100)清洗大脑部分3x,每次5分钟。然后在室温下用0.5%非离子表面活性剂和10%正常山羊血清(NGS)在0.1M PBS的阻断溶液中孵育1小时,温和搅拌。
  3. 在0.1M PBS中用0.5%非离子表面活性剂和5%NGS在4°C下2天,用搅拌剂在0.1M PBS中孵育部分。
    注:由于脑切片的厚度,初级抗体的潜伏期需要延长,以更好地渗透,抗体浓度可能增加。在本实验中,1:500稀释用于抗GFAP抗体,1:500稀释用于抗水孢素-4抗体。
  4. 用0.5%非离子表面活性剂将0.1M PBS中的3倍部分洗涤,每次10分钟,然后用稀释在0.1M PBS中的二级抗体在室温下用0.5%非离子表面活性剂和10%NGS孵育6小时。
    注:不要选择由 488 nm 激发的二级抗体,这是用于可视化 LY 染料的波长。在这个实验中,Alexa Fluor 546 山羊抗鸡 IgG (H+L) 和亚历克萨福乐 647 山羊抗兔子 IgG (H+L) 使用了 1:1,000 稀释剂。
  5. 在 0.1 M PBS 中冲洗 3x 部分,每次 10 分钟。然后,将部分安装在适合荧光的安装介质中的玻璃显微镜玻片上。密封幻灯片。步长大小为 0.3 μm 的图像单元。

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Representative Results

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这项研究中报告的数据来自每个实验中4只小鼠的7-12个细胞。在适当情况下,在图形面板中报告平均数据。

为了评估星形细胞形态,我们使用LY染料进行细胞内风泳,以填充CA1层辐射中的星形细胞,如图1总结。图2描绘了一个代表性的星形细胞及其精细的形态结构。使用 488 nm 激光线(步长 0.3 μm 和 3.0±3.5 倍数字变焦)在共聚焦激光扫描显微镜上使用 60 倍油浸透镜对电池进行定位后成像。对共聚焦显微镜的光倍增管(PMT)、偏移和增益功能进行了调整,在最终图像中形成高信号/背景比。在图 2A中,来自不同 z 步长的单光学平面图像(每 10 μm 显示一次,按 1⁄6 的顺序标记)揭示了中央索马和几个主要分支,它们分为密集的过程网络。通过生成最大强度投影(堆栈大小为 85 μm),我们观察到了星形细胞及其域结构的详细视图(图 2B)。星形细胞结构的主要组成部分也被注意到。图 2C显示一个主要分支、多个辅助分支(x4)的最大强度投影,以及周围分支和传单的分布。

使用Imaris分析软件(材料表)对星形细胞进行形态分析和重建,使用LY填充星形细胞的固定后图像(也可以使用其他软件,如ImageJ)。完成每个星形细胞的重建后,对星体、主要分支、过程和领土的体积进行了量化。首先创建 soma 时,表面平滑设置为 x-y 平面分辨率限制 (0.25 μm)。最小对象直径设置为 3.0 μm,以移除与细胞体无关的其他对象。要创建主要分支,由于其相对于细胞其余部分的亮度,因此被遮盖了索马的强度。主要分支的表面平滑和最小对象直径设置为 0.3 μm(z 平面步长大小)。为了创建流程,主要分支的强度也被屏蔽。表面平滑设置为 0.18 μm,最小对象直径设置为 0.3 μm。星形细胞的面积是使用较低的强度阈值和表面平滑设置为0.75 μm创建的。图3A显示了CA1星形细胞的原始图像。细胞体、主要分支、过程和星形细胞所封闭的区域体积在图3B-E中重建。细胞重建后,对细胞体积、整个细胞和领土进行量化,并计算主要分支的数量(表1)。来自地层的CA1星形细胞的平均索马体积为488.91μm3,平均为+7主要分支,平均细胞体积为5.58 x 103 μm3,平均区域体积为2.94 x 104 μm3。

特征良好的星形细胞标记,GFAP,是一种细胞骨骼蛋白,标记星形细胞8的中间丝。在星形细胞被染色后,我们为GFAP进行了免疫染色,以可视化单个星形细胞的表达(图4)。我们发现GFAP在细胞索马、主要分支和星形细胞的一些二级分支中表达,但在更精细的分支和过程中没有表达(图4A)。在GFAP标记的主要分支数量与LY可视化的分支数量(p = 0.1573;p = 0.1573;p = 0.1573;p = 0.1573;图 4B)GFAP 标记的星形细胞的细胞面积和体积明显小于使用 LY 可视化的面积和体积(p < 0.0001;图 4C,D.这表明 GFAP 是标记主要分支的可靠标记,但对于确定单元的总体面积或体积没有用处。

星形细胞的一个重要特征是它们的端脚,它接触血管,并被建议帮助调节血液流动在CNS。为了进一步理解星形细胞和脑血管之间的空间关系,我们在染料填充后对水孢素-4进行了抗体染色。Aquaporin-4是一种水通道蛋白,存在于星形细胞和脑细胞上,在心室和血管15附近区域高度表达。我们发现,水孢素-4在接近脑血管的星形细胞端脚上表示(图5A)。图像描绘了三个星形末位在不同位置接触血管(由白色箭头表示)。在CA1地层中,每个星体细胞的平均端脚数为+2(图5B)。有趣的是,使用主要分支重建(p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;p = 0.0038;图 5C.我们还测量了从索马中心到血管的含尾脚的分支的长度,并将其与到血管的最短、直接路径进行比较。分支到血管的实际长度明显大于最短路径(p = 0.0333;图 5D),这表明这些分支往往采取更长,曲折的路线到血管。电影1描绘了一部重建一个充满LY的星形细胞和水孢素-4染色的电影。星形细胞的不同结构组成部分(索马、主要分支、过程和领地)以三维表示。LY填充的星形细胞与水孢素-4染色描绘了环绕血管的星形细胞端脚。从主要分支和血管的重建,包含端脚的分支可以可视化从索马延伸到血管。

在前面的部分中,在报告 p 值时,我们使用了未配对的学生 t 测试,其显著性为 p < 0.05。

Figure 1
图1:LY焦虑症中的工作流程图。协议的架构表示,突出关键步骤。老鼠被注入固定剂后,大脑被解剖。在修复后短的固定期后,日冕部分被用振动器切割。电极回填1.5%LY染料。在光学显微镜上使用IR-DIC在CA1层辐射中识别了星形细胞。细胞的躯干被电极刺穿,染料通过应用0.5+1 V注入细胞,直到更精细的过程完全填充。使用40x水浸透镜对切片进行共聚焦显微镜成像,然后进行免疫性化学处理。进一步成像完成与60倍油浸透镜执行细胞重建和形态分析。图中所示是流程重建的示例。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:CA1地层放射性的LY填充星形。A) 星形细胞的单光学平面图像每 10 μm 显示一次(标记为 1⁄6)。(B) 星形细胞的最大投影,描绘细胞索马、几个主要分支和许多构成其茂密区域的过程。(C) 一个主要分支(从黄色部分)的最大投影(缩放 x4)、两个辅助分支、多个分支以及周围进程的组织。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:重构一个充满LY的星形细胞及其成分。A) CA1 星形细胞填充 LY.(B-E)索马(B)、索马和主要分支 (C)、过程 (D) 和领土 (E) 的三维重建在 0° 和 45° 方向.比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:在LY填充星细胞中的GFAP免疫染色。A) LY(绿色)和GFAP(洋红色)染色的代表性z投影。GFAP主要在星形细胞的主要分支和某些二级分支中表达,但在整个星形细胞区域内未发现。比例尺 = 10 μm (B) LY 和 GFAP 标记的主要分支数的图形。(C) 细胞面积由LY和GFAP染色表示。(D) 细胞体积表示LY和GFAP染色。开放圆圈是原始数据,其闭合方块表示平均值 = SEM.数据是从 4 个小鼠的 12 个单元中收集的。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:在LY填充的星形细胞中水孢素-4免疫染色。A) LY(绿色)和水孢素-4染色(洋红色)的代表z投影。Aquaporin-4主要表示在星形细胞的末端。白色箭头表示三个末端,因为它们接触附近的血管。刻度条 = 10 μm. (B) 每个星形细胞具有端脚的分支数。(C) 与星形细胞的其他主要分支相比,具有端脚的分支的厚度。(D) 与通往血管的最短路径相比,有端脚的分支长度。开放圆圈是原始数据,其闭合方块指示平均值 = SEM.数据是从 4 个小鼠的 7 个单元中收集的。请点击此处查看此图的较大版本。

Movie 1
电影1:重建一个LY填充的星形细胞和水孢素-4染色。CA1 星形细胞靠近血管的代表性电影。索马,主要分支,过程和领域被重建,以分析细胞的形态。主要分支的重建与水孢素-4一起描绘了两个直接接触血管的星形细胞端脚。请点击此处观看此视频。(右键单击下载。

形态特征 平均 = SEM
索马体积 (μm3 489 × 30
主要分支数 7.0 × 0.5
细胞体积 (μm3 5580 × 425
区域体积 (μm3 29391 × 8150
单元格数 14

表1:星形细胞结构形态分析。显示了星形细胞索马体积、每个星形细胞的主要分支数、星形细胞体积以及星形细胞区域所封闭的体积。从7只小鼠的14个细胞中收集数据。

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Discussion

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本文概述的方法描述了一种在轻度固定脑切片中使用LY染料细胞内电磷化来可视化星形细胞形态的方法。该协议中强调了几个关键因素,有助于成功的LY淋巴磷酸和细胞的形态重建。一个因素是图像的质量和可重复性,这主要取决于小鼠的年龄和灌注的结果。在这项研究中,我们使用6~8周大的C57/BL6N小鼠。成功的灌注(高度依赖于渗透针的正确放置,并注意到由白色的大脑和脑血管中没有血液)是必要的最详细和清晰填充的细胞。被电极浸渍后,细胞膜应保持电极尖端周围的紧密密封,防止染料泄漏。尽管尽了最大努力,但偶尔细胞外的其他结构也会被填充,因为移液器通过脑组织被推进:我们从分析中排除了这些细胞。电极的电阻是一个额外的关键因素。高电阻只允许在电压刺激时从电极尖端稳定地喷出染料。更从技术上讲,当用电极刺穿细胞的体体时,保持温和、缓慢的运动是很重要的。电极穿透电池会导致染料从索马泄漏。成功进行压浸后,电压应用应导致几乎立即染料填充细胞体和过程(即在几秒钟内)。完全填满星形细胞所需的时间与它所包含的领土有关;但是,等待以确保更精细的流程完全填充(至少 15 分钟)。

我们发现这个协议是详细研究星形细胞形态的最忠实的方法,然而,该方法也有其局限性。识别单元格可能非常耗时,而且容易出错。在 IR-DIC 下,应识别标记特定细胞类型(soma 形状和大小)的独特特征。或者,红荧光报告器在星形细胞中,通过病毒注射或转基因小鼠报告线表达,在填充之前更容易识别这些细胞。此外,LY作为细胞染料是有限的,因为它不能用于标记星形细胞膜,与标记与膜束的GFP,如Lck-GFP16。Lck-GFP将给出整个领土区域的更准确的表示,因为LY风光酸揭示了星形细胞的内部体积。然而,根据实验设计,LY风泳更适合解决整个星形细胞内部体积,开发三维重建,并量化构成星形细胞结构的解剖成分6.最后,与各种形式的共聚焦显微镜一样,空间分辨率受到衍射的限制,被作为显微镜光学17的点扩散功能所注意。改变成像系统的组件,如减小针孔直径,将有助于改善图像,但真正的分辨率是由光的波长和物镜的数值光圈决定的。在我们的例子中,我们估计可能的最佳分辨率可能在 300 nm 左右,这在 z 轴中可能更糟。

LY淋巴磷比其它常用的标记星形细胞的方法具有若干优点。该协议可应用于任何已建立的小鼠模型、细胞群或大脑区域18、19、20,因为它不受星形细胞特定启动子或转基因小鼠线的限制。通过病毒注射或转基因小鼠报告线(即td-Tomato)在星形细胞中普遍表达荧光蛋白的遗传方法需要使用星形细胞启动子,在某些地区,可以表达其他细胞类型或不包括所有的星形细胞21。LY风泳也是具有成本效益的,因为荧光蛋白的病毒注射需要手术和时间来表达特定的病毒,而转基因小鼠线需要繁殖。最后,LY念磷是区分单个细胞的有用方法,而其他策略也需要与稀疏标记方法相结合,以可视化单个星形细胞22、23领地。 24.然而,没有一种方法是万能药,使用的方法的选择需要根据正在处理的具体问题进行定制。

未来的研究可以采用特定的实验操作,并检查星形细胞结构的不同组成部分(索马、分支、过程、区域等)来回答形态问题。这可以为星形细胞形态及其功能影响提供见解和方向,可以通过超分辨率光显微镜或电子显微镜4进一步分析。例如,LY风泳提供了一种可视化精细星形细胞过程的方法,这些过程与数千个突触接触并参与突触功能。研究这些过程的结构如何在不同的病理条件下变化,有助于阐明星形细胞在健康和疾病中的作用。LY风泳是一种重要的技术,用于可视化详细的细胞形态和表征星形细胞特性,以更好地了解其在中枢神经系统中的功能。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢索托女士、余博士和Octeau博士对文本的指导以及评论。NS060677 支持此工作。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

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References

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使用路西法黄电磷学可视化星形形态
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Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

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