Summary
Protokollen beskriver effektive og reproducerbare træk biomekaniske testmetoder til murine sener gennem brug af Custom-Fit 3D trykt inventar.
Abstract
Sene lidelser er almindeligt, påvirker mennesker i alle aldre, og er ofte invaliderende. Standard behandlinger, såsom anti-inflammatoriske lægemidler, rehabilitering, og kirurgisk reparation, ofte mislykkes. For at definere senen funktion og demonstrere effekten af nye behandlinger, skal de mekaniske egenskaber af sener fra dyremodeller bestemmes nøjagtigt. Murine dyremodeller er nu almindeligt anvendt til at studere sene lidelser og evaluere nye behandlinger for tendinopathies; Men, bestemme de mekaniske egenskaber af mus sener har været udfordrende. I denne undersøgelse, et nyt system blev udviklet til senon mekaniske test, der omfatter 3D-trykte inventar, der svarer nøjagtigt til anatomier af humerus og calcaneus til mekanisk test supraspinatus sener og Achilles sener, hhv. Disse armaturer blev udviklet ved hjælp af 3D rekonstruktioner af indfødte knogle anatomi, solid modellering, og additiv produktion. Den nye metode eliminerede kunstige gribe fejl (f. eks. fejl ved vækst pladens fiasko i stedet for i senen), reducerede den samlede testtid og øgede reproducerbarhed. Endvidere, denne nye metode er let at tilpasse til afprøvning andre murine sener og sener fra andre dyr.
Introduction
Sene lidelser er almindelige og meget udbredt blandt de aldrende, atletiske, og aktive populationer1,2,3. I USA, 16.400.000 bindevævs skader indberettes hvert år4 og tegner sig for 30% af alle skades-relaterede læge kontor besøg3,5,6,7, 8. De mest almindeligt berørte steder omfatter rotator cuff, achilles senen, og laterale senen9. Selv om en række af ikke-operative og operative behandlinger er blevet udforsket, herunder anti-inflammatoriske lægemidler, rehabilitering, og kirurgisk reparation, resultater forbliver fattige, med begrænset tilbagevenden til funktion og høje grader af fiasko5, 6. Disse dårlige kliniske resultater har motiveret grundlæggende og translationelle undersøgelser, som søger at forstå tendinopati og udvikle nye behandlingsmetoder.
Træk biomekaniske egenskaber er de primære kvantitative resultater, der definerer senen funktion. Derfor, laboratorie karakterisering af tendinopati og behandling effektivitet skal omfatte en streng afprøvning af sene trækkende egenskaber. Talrige undersøgelser har beskrevet metoder til at bestemme de biomekaniske egenskaber af sener fra dyremodeller såsom rotter, får, hunde, og kaniner10,11,12. Men, få undersøgelser har testet biomekaniske egenskaber af murine sener, primært på grund af vanskelighederne med at gribe de små væv til trækprøvning. Som murine modeller har talrige fordele for mekanisk studere tendinopati, herunder genetisk manipulation, omfattende reagens muligheder, og lave omkostninger, udvikling af nøjagtige og effektive metoder til biomekatisk test murine væv er nødvendig.
For korrekt at teste de mekaniske egenskaber af sener, skal vævet være grebet effektivt, uden glider eller artifaktuel rive på grebet interface eller frakturering af vækstpladen. I mange tilfælde, især for korte sener, er knoglen grebet i den ene ende og senen er grebet på den anden ende. Knogler er typisk sikret ved at indlejre dem i materialer som epoxyharpiks13 og polymethylmethacrylat14,15. Sener er ofte placeret mellem to lag af sandpapir, limet med cyanoacrylat, og sikret ved hjælp af kompressions klemmer (hvis tværsnit er fladt) eller i et frosset medium (hvis tværsnit er stor)15,16,17 . Disse metoder er blevet anvendt til biomekatisk test murine sener, men udfordringer opstår på grund af den lille størrelse af prøverne og overholdelse af vækstpladen, som aldrig ossificerer18. For eksempel, diameteren af murine humerus hovedet er kun et par millimeter, hvilket gør gribende af knoglen vanskeligt. Specifikt, trækprøvning af murine supraspinatus sene-til-knogle prøver ofte resulterer i fiasko på vækstpladen snarere end i senen eller på senen afhandling. På samme måde er Biomekanisk testning af achillessene udfordrende. Selvom achillessene er større end andre murine sener, er calcaneus lille, hvilket gør gribende af denne knogle vanskelig. Knoglen kan fjernes, efterfulgt af at gribe de to sene ender; Dette udelukker dog afprøvning af den sene-til-Bone fastgørelse. Andre grupper rapporterer gribe den calcaneus knogle ved hjælp af specialfremstillede inventar19,20, forankring af klemmer21, fastsættelse i selvhærdende plastik cement22 eller ved hjælp af en konisk form slot22, men disse tidligere metoder forbliver begrænset af lav reproducerbarhed, høj gribende fejlprocenter, og kedelig forberedelse krav.
Formålet med den nuværende undersøgelse var at udvikle en præcis og effektiv metode til træk Biomekanisk testning af murine sener, med fokus på supraspinatus og Achilles sener som eksempler. Ved hjælp af en kombination af 3D rekonstruktioner fra indfødte knogle anatomi, solid modellering, og additiv produktion, en ny metode blev udviklet til at gribe knoglerne. Disse armaturer effektivt sikrede knoglerne, forhindrede vækst plade fiasko, nedsat præparat forberedelsestid, og øget testning reproducerbarhed. Den nye metode er let at tilpasse til at teste andre murine sener samt sener i rotter og andre dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine dyremodeller er almindeligt anvendt til at studere sener lidelser, men karakterisering af deres mekaniske egenskaber er udfordrende og ualmindelige i litteraturen. Formålet med denne protokol er at beskrive en tidseffektiv og reproducerbar metode til trækprøvning af murine sener. De nye metoder reducerede den tid, der kræves for at teste en prøve fra timer til minutter og elimineret en stor gribende artefakt, der var et almindeligt problem i tidligere metoder.
Flere trin, der er be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af NIH/NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
References
- Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
- Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
- Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
- Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
- Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
- Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
- Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
- Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
- Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
- Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
- West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
- Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
- Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
- Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
- Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
- Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
- Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
- Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
- Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
- Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
- Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
- Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
- Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
- Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
- Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
- Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
- Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
- Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
- Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
- Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
- Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
- Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
- Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
- Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
- Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
- Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
- Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
- Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
- Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy – Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
- Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
- Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).
