Biomekaniske testing av murine sener

Summary

Protokollen beskriver effektiv og reproduserbar strekk biomekaniske testmetoder for murine sener gjennom bruk av tilpasset-Fit 3D trykt inventar.

Abstract

Sene lidelser er vanlig, påvirker folk i alle aldre, og er ofte ødeleggende. Standard behandlinger, som anti-inflammatoriske legemidler, rehabilitering, og kirurgisk reparasjon, ofte mislykkes. For å definere sene funksjon og demonstrere effekten av nye behandlinger, de mekaniske egenskapene til sener fra dyremodeller må være nøyaktig bestemmes. Murine dyremodeller er nå mye brukt til å studere sene lidelser og evaluere romanen behandlinger for tendinopathies; men å bestemme de mekaniske egenskapene til mus sener har vært utfordrende. I denne studien, et nytt system ble utviklet for sene mekanisk testing som inkluderer 3D-trykt inventar som nøyaktig samsvarer med anatomi av humerus og calcaneus til mekanisk test supraspinatus sener og Achilles sener, henholdsvis. Disse inventar ble utviklet ved hjelp av 3D rekonstruksjoner av innfødte bein anatomi, solid modellering, og additiv produksjon. Den nye tilnærmingen eliminert artifactual gripende svikt (f. eks svikt ved vekst plate svikt snarere enn i senen), redusert total testing tid, og økt reproduserbarhet. Videre er denne nye metoden lett å tilpasse for å teste andre murine sener og sener fra andre dyr.

Introduction

Sene lidelser er vanlig og svært utbredt blant de aldrende, atletisk og aktive populasjoner^1,2,3. I USA, 16 400 000 bindevevs skader rapporteres hvert år⁴ og står for 30% av all skade-relaterte legekontor besøk^{3,5,6,7, 8}i den. De hyppigst rammede områdene inkluderer Rotator cuff, Achilles sene, og patellar sene⁹. Selv om en rekke ikke-operative og operative behandlinger har blitt utforsket, inkludert antiinflammatoriske legemidler, rehabilitering, og kirurgisk reparasjon, utfall forblir fattige, med begrenset avkastning til funksjon og høy forekomst av svikt^{5, 6}i den. Disse dårlige kliniske utfall har motivert grunnleggende og translational studier som søker å forstå tendinopati og å utvikle romanen behandling tilnærminger.

Strekk biomekaniske egenskaper er de primære kvantitative utfall definere sene funksjon. Derfor, laboratorie karakterisering av tendinopati og behandling effekt må inneholde en streng testing av sene strekk egenskaper. Tallrike studier har beskrevet metoder for å bestemme biomekaniske egenskaper av sener fra dyremodeller som rotter, sauer, hunder og kaniner^10,11,12. Imidlertid har få studier testet biomekaniske egenskapene til murine sener, hovedsakelig på grunn av vanskeligheter med å gripe den lille vev for strekk testing. Som murine modeller har en rekke fordeler for mechanistically studere tendinopati, inkludert genetisk manipulasjon, omfattende reagens alternativer, og lave kostnader, utvikling av nøyaktige og effektive metoder for å biomekanisk teste murine vev er nødvendig.

For å kunne teste de mekaniske egenskapene til sener, må vevet bli grepet effektivt, uten å skli eller artifactual rive i grepet grensesnittet eller oppsprekking av veksten plate. I mange tilfeller, spesielt for korte sener, benet er grepet på den ene enden og senen er grepet i den andre enden. Bein er vanligvis sikret ved å bygge dem inn i materialer som epoxy harpiks¹³ og polymetalmetakrylat^14,15. Sener er ofte plassert mellom to lag med sandpapir, limt med Cyanoacrylate, og sikret ved hjelp av kompresjon klemmer (hvis tverrsnitt er flat) eller i et frosset medium (hvis tverrsnitt er stor)^15,16,17 . Disse metodene har blitt brukt til biomekanisk test murine sener, men utfordringene oppstår på grunn av den lille størrelsen på prøvene og etterlevelse av veksten plate, som aldri ossifies¹⁸. For eksempel er diameteren på murine ledd hode bare noen få millimeter, og dermed gjør gripende av benet vanskelig. Nærmere bestemt, strekk testing av murine supraspinatus sene-til-bein prøver ofte resulterer i svikt i vekst plate i stedet for i senen eller ved sene enthesis. Tilsvarende er biomekaniske testing av Achilles sene utfordrende. Selv om Achilles sene er større enn andre murine sener, er calcaneus liten, noe som gjør gripende av dette benet vanskelig. Benet kan fjernes, etterfulgt av gripende de to sene endene; men dette utelukker testing av sene-til-bein vedlegg. Andre grupper rapport gripende calcaneus benet ved hjelp av skreddersydde inventar^19,20, forankring av klemmer²¹, festing i selv herding plast sement²² eller ved hjelp av en konisk form slot²², men disse tidligere metoder fortsatt begrenset av lav reproduserbarhet, høy gripe svikt priser, og kjedelige forberedelser krav.

Målet med den nåværende studien var å utvikle en nøyaktig og effektiv metode for strekk biomekaniske testing av murine sener, med fokus på supraspinatus og Achilles sener som eksempler. Ved hjelp av en kombinasjon av 3D-rekonstruksjoner fra opprinnelig bein anatomi, solid modellering og additiv produksjon, ble en ny metode utviklet for å gripe inn i beina. Disse inventar effektivt sikret bein, hindret vekst plate svikt, redusert prøveforberedelse tid, og økt testing reproduserbarhet. Den nye metoden er lett å tilpasse for å teste andre murine sener samt sener i rotter og andre dyr.

Protocol

Dyrestudier ble godkjent av Columbia University institusjonelle Animal Care og use Committee. Mus som brukes i denne studien var av en C57BL/6J bakgrunn og ble kjøpt fra The Jackson Laboratory (bar Harbor, ME, USA). De ble plassert i patogen-fri barriere forhold og ble gitt mat og vann ad lib. 1. utvikling av tilpasset-Fit 3D trykte inventar for gripende bein Bone image oppkjøp og 3D-bein modell konstruksjonAnalysere bein av interesse i forberedelsene til 3D modell opprette…

Representative Results

3D-trykte inventar ble brukt til å teste 8-ukers gamle murine supraspinatus og Achilles sener. Alle mekaniske prøver mislyktes på enthesis, som kjennetegnes ved microCT-skanninger, visuell inspeksjon og video analyse etter strekk prøver. En en-til-en sammenligning av tidligere og nåværende metoder for supraspinatus sene testing i vårt laboratorium er vist i Figur 3. I forrige metode28,29,30, …

Discussion

Murine dyremodeller er ofte brukt til å studere sene lidelser, men karakterisering av deres mekaniske egenskaper er utfordrende og uvanlig i litteraturen. Formålet med denne protokollen er å beskrive en tid effektiv og reproduserbar metode for strekk testing av murine sener. Den nye metoder reduserte tiden det tar å teste en prøve fra timer til minutter og eliminert en stor gripende gjenstand som var et vanlig problem i tidligere metoder.

Flere trinn beskrevet i denne protokollen er avgj?…

Materials

Agarose	Fisher Scientific	BP160-100	Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose
Bruker microCT	Bruker BioSpin Corp	Skyscan 1272	Used by authors
ElectroForce	TA Instruments	3200	Testing platform
Ethanol 200 Proof	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips	Custom made		Used by authors
Kimwipes	Kimberly-Clark	S-8115	As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan)	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
MilliQ water (Ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	100 ml
Meshmixer	Autodesk	http://www.meshmixer.com/	Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS	Stratasys LTD		Precision Prototyping
Objet Studio	Stratasys LTD		Used by authors with 3D printer
PBS – Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	10010031	2.5 L of 10% PBS
S&T Forceps	Fine Science Tools	00108-11	Used by authors
Scalpel Blade – #11	Fine Science Tools	10011-00	Used by authors
Scalpel Handle – #3	Fine Science Tools	10003-12	Used by authors
SkyScan 1272	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
Skyscan CT-Vox	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SkyScan NRecon	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SolidWorks CAD	Dassault Systèmes	SolidWorks Research Subsription	Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue	Loctite	234790	As suggested in protocol
Testing bath	Custom made		Used by authors
Thin film grips	Custom made		Used by authors
VeroWhitePlus	Stratasys LTD	NA	3D printing material used by authors
WinTest	WinTest Software		Used by authors to collect data