Pruebas biomecánicas de tendones murinos
Summary
El protocolo describe métodos de ensayo biomecánicos de tracción eficientes y reproducibles para tendones murinos mediante el uso de accesorios impresos en 3D de ajuste personalizado.
Abstract
Los trastornos del tendón son comunes, afectan a personas de todas las edades y a menudo son debilitantes. Los tratamientos estándar, como los antiinflamatorios, la rehabilitación y la reparación quirúrgica, a menudo fallan. Con el fin de definir la función del tendón y demostrar la eficacia de los nuevos tratamientos, las propiedades mecánicas de los tendones de los modelos animales deben determinarse con precisión. Los modelos animales murinos ahora se utilizan ampliamente para estudiar trastornos tendinosos y evaluar nuevos tratamientos para las tendinopatías; sin embargo, determinar las propiedades mecánicas de los tendones del ratón ha sido un reto. En este estudio, se desarrolló un nuevo sistema para pruebas mecánicas de tendones que incluye accesorios impresos en 3D que coinciden exactamente con las anatomías del húmero y el calcáneo para probar mecánicamente los tendones supraespinatus y los tendones de Aquiles, respectivamente. Estos accesorios fueron desarrollados utilizando reconstrucciones 3D de anatomía ósea nativa, modelado sólido y fabricación aditiva. El nuevo enfoque eliminó las fallas de agarre artifreales (por ejemplo, fallas en la falla de la placa de crecimiento en lugar de en el tendón), disminuyó el tiempo total de prueba y aumentó la reproducibilidad. Además, este nuevo método es fácilmente adaptable para probar otros tendones y tendones murinos de otros animales.
Introduction
Los trastornos del tendón son comunes y muy frecuentes entre las poblaciones de envejecimiento, atletismo y activa1,2,3. En los Estados Unidos, 16,4 millones de lesiones por tejido conectivo se reportan cada año4 y representan el 30% de todas las visitas al consultorio médico relacionadas con lesiones3,5,6,7, 8. Los sitios más comúnmente afectados incluyen el manguito rotador, tendón de Aquiles, y tendón rotuliano9. Aunque se han explorado una variedad de tratamientos no quirúrgicos y operativos, incluyendo medicamentos antiinflamatorios, rehabilitación y reparación quirúrgica, los resultados siguen siendo pobres, con un retorno limitado a la función y altas tasas de falla5, 6. Estos malos resultados clínicos han motivado los estudios básicos y traslacionales que buscan comprender la tendinopatía y desarrollar nuevos enfoques de tratamiento.
Las propiedades biomecánicas de tracción son los principales resultados cuantitativos que definen la función del tendón. Por lo tanto, la caracterización de laboratorio de la tendinopatía y la eficacia del tratamiento deben incluir una prueba rigurosa de las propiedades de la tensión del tendón. Numerosos estudios han descrito métodos para determinar las propiedades biomecánicas de los tendones a partir de modelos animales como ratas, ovejas, perros y conejos10,11,12. Sin embargo, pocos estudios han probado las propiedades biomecánicas de los tendones murinos, principalmente debido a las dificultades para agarrar los tejidos pequeños para las pruebas de tracción. Como los modelos murinos tienen numerosas ventajas para el estudio mecanicistamente tendinopatía, incluyendo la manipulación genética, amplias opciones de reactivos y bajo costo, se necesita el desarrollo de métodos precisos y eficientes para probar biomecánicamente los tejidos murinos.
Con el fin de probar adecuadamente las propiedades mecánicas de los tendones, el tejido debe ser agarrado eficazmente, sin resbalones o desgarros artifes reales en la interfaz de agarre o fractura de la placa de crecimiento. En muchos casos, particularmente para tendones cortos, el hueso se agarra en un extremo y el tendón se agarra en el otro extremo. Los huesos se fijan típicamente incrustándolos en materiales como resina epoxi13 y polimetilmetacrilato14,15. Los tendones a menudo se colocan entre dos capas de papel de lija, pegados con cianoacrilato, y asegurados mediante abrazaderas de compresión (si la sección transversal es plana) o en un medio congelado (si la sección transversal es grande)15,16,17 . Estos métodos se han aplicado a tendones murinas de ensayo biomecánicos, pero surgen desafíos debido al pequeño tamaño de los especímenes y al cumplimiento de la placa de crecimiento, que nunca osifie18. Por ejemplo, el diámetro de la cabeza hueral murina es de sólo unos pocos milímetros, lo que dificulta el agarre del hueso. Específicamente, las pruebas de tracción de muestras de tendón-hueso de supraespinato murino a menudo resultan en falla en la placa de crecimiento en lugar de en el tendón o en la entesis del tendón. Del mismo modo, las pruebas biomecánicas del tendón de Aquiles son desafiantes. Aunque el tendón de Aquiles es más grande que otros tendones murinos, el calcáneo es pequeño, lo que dificulta el agarre de este hueso. El hueso se puede extraer, seguido de agarrar los dos extremos del tendón; sin embargo, esto impide la prueba de la unión de tendón a hueso. Otros grupos informan de agarrar el hueso de calcáneo utilizando accesorios hechos a medida19,20, anclaje por abrazaderas21, fijación en cemento plástico autocurado22 o utilizando una ranura de forma cónica22, sin embargo, estos métodos anteriores siguen estando limitados por la baja reproducibilidad, las altas tasas de fallas de agarre y los requisitos tediosos de preparación.
El objetivo del estudio actual fue desarrollar un método preciso y eficiente para las pruebas biomecánicas de tracción de los tendones murinos, centrándose en los tendones supraespinato y Aquiles como ejemplos. Utilizando una combinación de reconstrucciones 3D de la anatomía ósea nativa, modelado sólido y fabricación aditiva, se desarrolló un método novedoso para agarrar los huesos. Estos accesorios aseguraron eficazmente los huesos, evitaron fallas en la placa de crecimiento, disminuyeron el tiempo de preparación de la muestra y aumentaron la reproducibilidad de las pruebas. El nuevo método es fácilmente adaptable para probar otros tendones murinos, así como tendones en ratas y otros animales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los modelos animales murinos se utilizan comúnmente para estudiar trastornos del tendón, pero la caracterización de sus propiedades mecánicas es desafiante y poco común en la literatura. El propósito de este protocolo es describir un método eficiente en el tiempo y reproducible para las pruebas de tracción de los tendones murinos. Los nuevos métodos redujeron el tiempo necesario para probar una muestra de horas a minutos y eliminaron un artefacto de agarre importante que era un problema común en métodos anteri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado por los NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
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