Murine Tendonunun Biyomekanik Testi
Summary
Protokol, özel uyumlu 3D baskılı armatürleri kullanarak rürinten tülonlar için etkili ve tekrarlanabilir gerilebilir biyomekanik test yöntemlerini tanımlar.
Abstract
Tendon bozuklukları yaygındır, her yaştan insanları etkiler ve genellikle zayıflatıcıdır. Anti-inflamatuar ilaçlar, rehabilitasyon ve cerrahi onarım gibi standart tedaviler genellikle başarısız olur. Tendon fonksiyonunu tanımlamak ve yeni tedavilerin etkinliğini göstermek için, hayvan modellerinden tendonların mekanik özellikleri doğru bir şekilde belirlenmelidir. Murine hayvan modelleri artık yaygın tendon bozuklukları çalışma ve tendinopatiiçin yeni tedavileri değerlendirmek için kullanılır; ancak fare tendonunun mekanik özelliklerini belirlemek zor olmuştur. Bu çalışmada, supraspinatus tendonu ve aşil tendonu mekanik olarak test etmek için humerus ve calcaneus atomlarına tam olarak uyan 3D baskılı armatürleri içeren tendon mekanik testleri için yeni bir sistem geliştirilmiştir. Bu armatürler yerli kemik anatomisi, katı modelleme ve katkı maddesi imalatı nın 3Boyutlu rekonstrüksiyonları kullanılarak geliştirilmiştir. Yeni yaklaşım, artifactual kavrama hatalarını (örneğin, tendon yerine büyüme plakası arızası) ortadan kaldırmıştır), genel test süresini azaltmıştır ve tekrarlanabilirliği artırmıştır. Ayrıca, bu yeni yöntem kolayca diğer hayvanların diğer murine tendonu ve tendonu test etmek için uyarlanabilir.
Introduction
Tendon bozuklukları yaygın ve son derece yaşlanma arasında yaygındır, atletik, ve aktif popülasyonlar1,2,3. Amerika Birleşik Devletleri’nde, 16.4 000.000 bağ dokusu yaralanmaları her yıl4 rapor ve tüm yaralanma ile ilgili hekim ofis ziyaretlerinin% 30 için hesap3,5,6,7, 8 . En sık etkilenen bölgeler rotator manşet, Aşil tendonu ve patellar tendon9’uiçerir. Anti-inflamatuar ilaçlar, rehabilitasyon ve cerrahi onarım da dahil olmak üzere çeşitli ameliyat dışı ve operatif tedaviler araştırılmış olmasına rağmen, sonuçlar kötü kalır, fonksiyon sınırlı dönüş ve başarısızlık yüksek oranlarıile 5, 6 . Bu kötü klinik sonuçlar, tendinopatiyi anlamaya ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmeye yönelik temel ve çevirisel çalışmaları motive edilmiştir.
Çekme biyomekanik özellikleri tendon fonksiyonunu tanımlayan birincil kantitatif sonuçlardır. Bu nedenle, tendinopati ve tedavi etkinliğinin laboratuvar karakterizasyonu tendon çekme özelliklerinin titiz bir test içermelidir. Çok sayıda çalışma sıçan, koyun, köpek ve tavşan10,11,12gibi hayvan modellerinden tendonları biyomekanik özelliklerini belirlemek için yöntemler tarif var. Ancak, birkaç çalışma, öncelikle çekme testi için küçük dokuların kavrama zorlukları nedeniyle, murine tendonun biyomekanik özelliklerini test ettik. Murine modelleri, genetik manipülasyon, kapsamlı reaktif seçenekleri ve düşük maliyetli, biyomekanik test murine dokuları için doğru ve verimli yöntemlerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere, tendinopati çalışma için mekanistik çalışma için çok sayıda avantajı vardır.
Tendonların mekanik özelliklerini doğru bir şekilde test edebilmek için, doku kavrama arabiriminde kayma veya eklemyırtı veya büyüme plakasının kırılması olmadan etkili bir şekilde kavranmalıdır. Birçok durumda, özellikle kısa tendonların için, kemik bir ucunda kavradı ve tendon diğer ucunda kavradı. Kemikler genellikle epoksi reçine13 ve polimetilmetakrilat14,15gibi malzemelere yerleştirilerek sabitlenir. Tendonlar genellikle iki kat zımpara kağıdı arasına yerleştirilir, siyanoakrilat ile yapıştırılır ve sıkıştırma kelepçeleri kullanılarak (kesit düzse) veya donmuş bir ortamda (kesit büyükse)15,16,17 . Bu yöntemler biyomekanik test murine tendonu için uygulanmıştır, ancak zorlukları örneklerin küçük boyutu ve18kemiker asla büyüme plaka, uyum uşur nedeniyle ortaya çıkar. Örneğin, murine humeral başının çapı sadece birkaç milimetre, böylece kemik kavrama zor hale. Özellikle, murin supraspinatus tendon-kemik örneklerinin gerilme testi genellikle tendon veya tendon entezi yerine büyüme plakasında başarısızlıkla sonuçlanır. Benzer şekilde, Aşil tendonunun biyomekanik testi zordur. Aşil tendonu diğer murine tendonlara göre daha büyük olmasına rağmen, calcaneus küçüktür, bu kemik kavrama zor hale. Kemik çıkarılabilir, ardından iki tendon ucu tutularak; ancak bu, tendon-kemik eki testini engellemez. Diğer gruplar özel yapım armatürleri kullanarak calcaneus kemik kavrama rapor19,20, kelepçeler ile demirleme21, kendi kendine kür plastik çimento22 sabitleme veya konik şekil yuvasıkullanarak 22, henüz bu önceki yöntemler düşük tekrarlanabilirlik, yüksek kavrama başarısızlık oranları ve sıkıcı hazırlık gereksinimleri ile sınırlı kalır.
Bu çalışmanın amacı, örnek olarak supraspinatus ve Aşil tendonuna odaklanarak, mürin tendonunun gerilme biyomekanik testi için doğru ve verimli bir yöntem geliştirmektir. Yerli kemik anatomisi, katı modelleme ve katkı maddesi üretiminden elde edilen 3Boyutlu rekonstrüksiyonların bir kombinasyonu kullanılarak kemikleri kavramak için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu armatürler kemikleri etkin bir şekilde emniyete aldı, büyüme plakası arızasını önledi, numune hazırlama süresini azalttı ve test tekrarlanabilirliğini artırdı. Yeni yöntem kolayca diğer murine tendonu yanı sıra sıçan ve diğer hayvanlarda tendonu test etmek için uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine hayvan modelleri yaygın tendon bozuklukları çalışma için kullanılır, ancak mekanik özelliklerinin karakterizasyonu zor ve literatürde nadirdir. Bu protokolün amacı, mürin tendonlarının gerilme testi için zaman etkin ve tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlamaktır. Yeni yöntemler, bir örneği saat dakikasına test etmek için gereken süreyi azalttı ve önceki yöntemlerde yaygın bir sorun olan büyük bir tutucu yapıyı ortadan kaldırdı.
Bu protokolde açıklanan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose |
| Bruker microCT | Bruker BioSpin Corp | Skyscan 1272 | Used by authors |
| ElectroForce | TA Instruments | 3200 | Testing platform |
| Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | A4094 | Dilute to 70% and use as suggested in protocol |
| Fixture to attach grips | Custom made | Used by authors | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | S-8115 | As suggested in protocol |
| MicroCT CT-Analyser (Ctan) | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| MilliQ water (Ultrapure water) | Millipore Sigma | QGARD00R1 (or related purifier) | 100 ml |
| Meshmixer | Autodesk | http://www.meshmixer.com/ | Free engineering software used by authors to refine mesh |
| Objet EDEN 260VS | Stratasys LTD | Precision Prototyping | |
| Objet Studio | Stratasys LTD | Used by authors with 3D printer | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010031 | 2.5 L of 10% PBS |
| S&T Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | Used by authors |
| Scalpel Blade – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | Used by authors |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | Used by authors |
| SkyScan 1272 | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| Skyscan CT-Vox | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SkyScan NRecon | Bruker BioSpin Corp | Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans | |
| SolidWorks CAD | Dassault Systèmes | SolidWorks Research Subsription | Solid modeling computer-aided design used by authors |
| SuperGlue | Loctite | 234790 | As suggested in protocol |
| Testing bath | Custom made | Used by authors | |
| Thin film grips | Custom made | Used by authors | |
| VeroWhitePlus | Stratasys LTD | NA | 3D printing material used by authors |
| WinTest | WinTest Software | Used by authors to collect data |
References
- Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
- Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
- Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
- Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
- Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
- Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
- Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
- Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
- Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
- Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
- West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
- Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
- Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
- Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
- Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
- Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
- Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
- Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
- Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
- Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
- Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
- Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
- Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
- Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
- Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
- Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
- Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
- Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
- Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
- Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
- Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
- Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
- Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
- Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
- Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
- Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
- Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
- Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
- Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
- Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy – Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
- Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
- Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).
