Summary
在这项研究中，对癌细胞，特别是4T1小鼠乳腺癌细胞的巨噬细胞噬菌体活性，被成像。利用荧光和差分干扰对比显微镜的组合，建立了活细胞共培养模型并观察了该模型。此评估使用成像软件进行成像，以开发多点延时视频。
Abstract
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）已被确定为肿瘤生长、入侵、转移和抗癌治疗的重要组成部分。然而，肿瘤相关巨噬细胞可能根据肿瘤微环境对肿瘤有害，可以通过对抗免疫细胞的细胞毒性活性或增强抗肿瘤反应来逆转其型型特征。巨噬细胞的分子作用及其与肿瘤细胞（如噬菌体）的相互作用尚未得到广泛研究。因此，肿瘤微环境中免疫细胞（M1/M2-亚型TAM）与癌细胞之间的相互作用是目前癌症免疫治疗研究的重点。在本研究中，利用相压、荧光和差分干扰对比（DIC）显微镜，利用延时视频功能，开发了诱导M1巨噬细胞和小鼠乳腺4T1癌细胞的活细胞共培养模型，以评估巨噬细胞的噬菌体噬菌体活性。本方法可观察和记录噬菌体多点活细胞成像。M1巨噬细胞对4T1细胞的噬菌体进行噬菌体化，在用碳化物氟乙酯（CFSE）染色之前，使用荧光显微镜观察4T1细胞。本期出版物介绍了如何在单个成像盘中共同培养巨噬细胞和肿瘤细胞，将M1巨噬细胞，并记录在13小时共增过程中吞噬4T1细胞的巨噬细胞的多点事件。
Introduction
巨噬细胞是免疫防御的第一线，在协调对病原体和包括癌细胞在内的异物的免疫反应方面发挥作用。他们是一种专门的噬菌体，破坏和去除体内不需要的颗粒。巨噬细胞有助于防御功能，如清除凋亡细胞和微生物，以及招募其他免疫细胞1。巨噬细胞可以分化成两种不同的类型，M1和M2巨噬细胞，以响应环境信号2。M1极化巨噬细胞（即经典激活的巨噬细胞）由细胞因子干扰素β（IFN-α）和脂多糖（LPS）激活，并参与炎症反应、病原体清除、有效噬菌体和肿瘤杀菌免疫3，4。M2巨噬细胞与肿瘤相关巨噬细胞（TAM）密切相关，具有抗炎和肿瘤促进作用4。
噬菌体，源自古希腊（噬菌体），意为"吞食"（kytos），意为"细胞"和-osis，意为"过程"5。方噬细胞化是一种受体介导的过程，其中吞噬细胞（包括巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞）杀死和吞噬入侵的病原体，清除异物颗粒，并清除凋亡细胞碎片。肿瘤相关巨噬细胞（TAm）存在于包括乳腺癌在内的不同肿瘤的频闪中，具有亲肿瘤功能6，7，导致对噬菌体产生抗药性。巨噬细胞肿瘤细胞噬菌体的详细机理尚未了解。
本研究提出了两步法：1）4T1小鼠乳腺癌细胞和M1极化巨噬细胞共培养，2）使用活细胞视频显微镜评估巨噬细胞的噬菌体活动。CFSE荧光染料用于染色4T1小鼠乳腺癌细胞。染色标记4T1细胞，以区分它们与一个成像盘中共培养的M1巨噬细胞。RAW 264.7 巨噬细胞与LPS和IFN-α一起极化为M1表型。为了确保完全极化，与FITC结合的抗iNOS抗体进行了免疫染色。随后，获取了多点延时图像，以观察联合文化中的多个事件，包括方噬菌体。
更好地了解肿瘤细胞和巨噬细胞之间的相互作用可能导致潜在的癌症免疫治疗。活细胞成像提供了实时环境中细胞动力学的详细视图，并用于研究细胞迁移、型型筛选、凋亡和细胞毒性8，神经科学、发育生物学和药物发现。虽然本研究中提出的肿瘤是乳腺癌，但该方法也可以应用于多个靶细胞和独特的效应细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：第 1-6 节描述了 4T1 小鼠乳腺癌细胞和 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞的共培养模型。第7节描述了M1巨噬细胞噬菌体4T1细胞的延时评估。
1. 培养4T1小鼠乳腺癌细胞和RAW 264.7小鼠巨噬细胞
- 在37°C或细胞系的正常生长温度下，在水浴中通过温和搅拌，解冻一小瓶低温保存的4T1和RAW 264.7通道6细胞。
注：解冻应快速完成，大约在 2 分钟内完成。为避免污染，请从水浴中取出小瓶，然后用 70% 乙醇喷洒，使其净化。为了避免遗传漂移，特别是对于巨噬细胞，请使用低通道数（即小于20）。 - 在15 mL锥形管中稀释10 mL完整DMEM培养基中的解冻细胞，并在600 x g下离心5分钟，以获得细胞颗粒。
注： 完整的DMEM介质，辅以10%（v/v）胎儿牛血清（FBS），200U/mL青霉素/链霉素，和2mM L-谷氨酰胺在整个协议中使用。 - 小心吸出介质，将细胞重新悬浮在8 mL的完整介质中，并转移到25cm2组织培养处理瓶中。在37°C下，在37°C下培养完整的DMEM介质中的4T1和RAW264.7细胞，CO2为5%。
注：轻轻重新悬浮细胞颗粒，并将细胞悬浮液一滴滴地加入培养瓶中，以避免杀死细胞。 - 经过1周的培养，允许细胞粘附，每天监测烧瓶，并根据需要添加8 mL的完整DMEM介质。
2. M1极化RAW 264.7巨噬细胞的免疫染色
- 当 RAW 264.7 细胞的汇合达到 70–80% 时，请丢弃培养物，用至少 2 mL 的 PBS 轻轻冲洗 2x。
注： 在播种 RAW 264.7 细胞之前，请确保未发生细胞分化（即树突状表型和/或增加的细胞大小）。如果细胞形态变化可见，则丢弃培养物，从较早的通道小瓶中解冻新的细胞系。 - 使用细胞刮刀轻轻移开粘附细胞并将其转移到15 mL锥形管中，准备收集巨噬细胞。
- 使用血细胞计对细胞计数，并使用完整的 DMEM 培养基培养基制备 1 x 105细胞/片的细胞悬浮液。
- 种子2 mL的巨噬细胞悬浮成两个成像盘。在37°C下用5%的CO2孵育细胞2⁄3小时，使细胞粘附。
- 通过将 100 纳克/mL LPS 和 20 纳克/mL IFN-- 到完整的 DMEM 介质10、11中来准备 M1 极化介质。
- 从巨噬细胞中丢弃培养上清液，用至少 1 mL 的 PBS 仔细清洗盘中的单层 2x。
- 将2mL的M1极化介质加入其中一个成像培养皿中，让RAW 264.7细胞诱导M1巨噬细胞表型，并在37°C下孵育2~3小时，CO2为5%。
注： 种子 RAW 264.7 巨噬细胞在成像盘中与 DMEM 补充 10% FBS 作为防 iNOS 抗体染色的控制。分别标记成像皿RAW（控制）和M1 巨噬细胞（LPS 和 IFN-极化）。 - 在免疫染色之前，使用2 mL的4%甲醛修复RAW 264.7和M1巨噬细胞，并在37°C（室温，RT）孵育15分钟。
- 取下上清液，用1mL的PBS清洗细胞单层至少3倍。
- 在PBS中用2 mL的50mM氯化铵进行淬火，在RT孵育15分钟。
- 在 PBS 中使用 2 mL 的 0.3% Triton X-100 在 RT 上渗透 15 分钟。
- 取下上清液，用1mL的PBS清洗细胞单层至少3倍。
- 在 PBS 中使用 2 mL 的 10% FBS 在 RT 上 30 分钟进行块。
注：免疫染色的阻断步骤是尽量减少细胞内抗体的非特异性结合。 - 取下上清液，用1mL的PBS清洗细胞单层至少3倍。
- 在PBS中孵育2mL的抗iNOS-FITC，在4°C下孵育1%的FBS。
注：根据制造商的建议，使用适当的抗体稀释标记细胞。从这时起用铝箔覆盖，保护盘子免受光线照射。 - 取下上清液，用1mL的PBS清洗细胞单层至少3倍。
- 在37°C中，在黑暗中用铝箔覆盖，将1mL的300 nM 6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）孵育到成像皿中10分钟。
- 用1mL的PBS清洗细胞至少3倍，并在成像皿中加入1mL的完整DMEM培养基。
注：细胞现已准备好进行荧光成像。显微镜设置将需要为所选污渍（本例中为 FITC 和 DAPI）设置的倒位和激励过滤器。 - 打开显微镜并加载成像软件。将成像盘安装在显微镜上并调整对焦以观察 RAW 264.7 和 M1 巨噬细胞。通过调整透射光和曝光时间，优化相位对比度 FITC 和 DAPI 图像的外观。
注：当所有点都聚焦且通道已优化时，开始成像。 - 捕获相对比度 FITC 和 DAPI 图像 （图 1）。
3. 播种4T1小鼠乳腺癌细胞
- 当 4T1 细胞的汇合达到 70–80% 时，请丢弃培养物，用至少 2 mL 的 PBS 轻轻冲洗 2x。加入1 mL的预预热胰蛋白酶，使细胞分离，并在37°C下孵育长达20分钟。
注：在显微镜下观察细胞。分离的单元格将被四舍五入。 - 一旦细胞分离，将它们转移到15 mL锥形管，并添加2 mL的预加热完整的DMEM介质，以灭活胰蛋白酶。通过移液细胞层表面轻轻分散介质以恢复细胞。然后，在600 x g下离心5分钟，获得细胞颗粒。
- 取出上清液，在预热的完整 DMEM 介质的 10 mL 中重新悬浮颗粒。
- 使用血细胞计和种子 1 x 105 4T1 细胞在 2 mL 的完整 DMEM 培养基中，在两个 35 mm 玻璃底成像培养皿中分别计数细胞。用5%的CO2在37°C下孵育细胞过夜。
注：使用 M1 极化介质和标签4T1 诱导器（控制）在其中一个成像培养皿中培养 4T1 细胞。这是为了确保4T1细胞在暴露于诱导剂时的正常生长。
4. 使用 CFSE 染色标记活 4T1 小鼠乳腺癌细胞
- 首先，从 4T1 细胞成像培养皿中取出现有介质。用1mL的PBS清洗细胞单层至少2倍。
- 通过在1 mL的PBS中稀释CFSE，制备5μM的CFSE染色溶液。将1 mL的5μM CFSE染色溶液加入每个成像盘中，在黑暗中在RT或37°C孵育细胞20分钟。
注：根据制造商的建议和初步实验，使用适当的CFSE工作浓度标记细胞，以获得最佳CFSE染色浓度。如果在 PBS 中稀释 CFSE，标签效率会更高。 - 通过添加含有 10% FBS 和染色溶液的完整 DMEM 介质的同等体积，在暗箱中孵育 5 分钟，从而对染色进行淬火。
- 丢弃含有CFSE的溶液，用同等量的培养培养物清洗细胞1倍。
注：4T1细胞现在被荧光标记。 - 将 4T1-CFSE 电池返回到 5% CO 2 的 RT 标准培养条件。
5. 播种 RAW 264.7 小鼠巨噬细胞和 4T1 共育
- 当 RAW 264.7 的汇合达到 70–80% 时，请丢弃培养介质，用至少 2 mL 的 PBS 轻轻冲洗 2 倍。
- 使用细胞刮刀轻轻移开粘附细胞并将其转移到15 mL锥形管中，准备收集巨噬细胞。
- 使用血细胞计对细胞进行计数，并根据播种密度稀释剩余的溶液，使用完整的DMEM培养基，制备1 x 105细胞/mL的细胞悬浮液。
注：在共培养中过度融合的细胞可能严重减少噬菌体。在这项研究中，巨噬细胞的种子比例：癌细胞被调整为1：1的比例。比例可以根据肿瘤细胞的侵略性和巨噬细胞的来源进行调整。 - 在育菌之前，从前一天（步骤 4.5）播种的 4T1 细胞中丢弃培养上清液，并仔细用至少 1 mL 的 PBS 清洗单层 2x。
- 种子 1 x 105 RAW 264.7 细胞每 2 mL 的完整 DMEM 培养基进入 4T1 成像培养皿之一。在37°C下用5%的CO2孵育细胞2⁄3小时，使细胞粘附。标记成像盘4T1-M1共栽。
注：4T1（对照）细胞未与巨噬细胞共培养。
6. RAW 264.7巨噬细胞的M1极化
- 通过将 100 纳克/mL LPS 和 20 纳克/mL IFN-* 添加到完整的 DMEM 介质中，并辅以 10% （v/v） FBS10、11。
- 从孵育之前（步骤5.5）中丢弃培养上观，用至少1mL的PBS仔细清洗盘中的单层2x。
- 然后，将2mL的M1极化介质加入成像盘中，让RAW 264.7细胞在37°C下孵育5%CO2，诱导进入M1巨噬细胞表型。
注：M1巨噬细胞可能占用2~3小时的孵育，实现完全极化。需要进行初步实验，以确保适当的潜伏期，使巨噬细胞完全极化。
7. 方噬细胞的真细胞视频显微镜
注：执行实时细胞成像以获得可生产视频时需要考虑许多因素，包括优化图像曝光、时间测量和自动对焦校正。
- 实验前，通过在37°C打开恒温器，提供5%的CO2，建立细胞培养箱。
注：显微镜设置需要倒置舞台、舞台顶部孵化器、湿度控制（95%）和气体孵化系统。此设置对于维护细胞进行长期活细胞视频显微镜评估至关重要。 - 打开显微镜（包括压电级）并加载显微镜成像软件。
- 将种子共育细胞放置在35毫米玻璃底成像盘中，然后轻轻拧在顶室上。使用操纵杆通过选择要成像的位置来使舞台电动化。
- 要查看示例，请选择炮塔上的相位对比度过滤器。最初查看示例后，找到相应的字段，使示例成为焦点。
注：成像软件允许使用全自动目标选择、完美对焦系统、延时系列、多通道图像采集和多点图像采集。 - 要设置 CFSE 标记和差分干扰对比度采集的多通道荧光，请打开成像软件采集对话框并选择[Lambda]选项卡复选框（图 2）。
注：对于 13 小时延时成像，应使用相位对比通道。 - 选择[兰姆达]选项卡 |[光学配置]并选择[10X DIC]用于差分干扰对比度，[GFP-R]用于绿色荧光滤波器复选框。在[兰姆达]下 |[焦点]列，选择[10X DIC]复选框以设置为焦点参考。
- 打开成像软件采集对话框，然后单击[XYZ 时间 ...]按钮，然后选择[XY]选项卡。
- 在检查实时图像或通过目镜选择其他位置时，使用电动舞台上的操纵杆移动到图像采集点。然后单击[点名称]列下的复选框，以设置每个位置中用于图像捕获的每个点（参见图 3）。
注： 自动级允许不同 XY 坐标的多点图像采集，以捕获多个字段。 - 微调屏幕上查看的每个示例的焦点。使用"自动对焦"校正的控件。
- 使用该软件设置延时图像捕获。在成像软件采集对话框中，选中[时间]选项卡（参见图 4）。
- 确定[间隔]（一个时间点开始到另一个时间点之间的延迟）和[持续时间] （实验的总时间长度）。时间单位各不相同，可以从下拉菜单中选择以毫秒（毫秒）、秒 （s）、分钟 （m） 或小时 （h） 为单位。
注：荧光和DIC延时多通道采集的延时成像周期长度可能因此测定中使用的荧光染料而异。如果标记的细胞暴露时间过长，则可能发生光漂白。 - 选中[保存到文件]复选框以保存获取的图像。在[时间计划]选项卡下单击[立即运行]按钮以获取多点时间序列图像（参见图 5）。
注： 在映像软件中，图像以 nd2 文件格式保存。以后可以单独以 MP4 文件格式保存每个延时时间。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
4T1小鼠乳腺癌细胞系共培养模型的延时二维（2D）图像显示，4T1细胞在13小时期间被M1巨噬细胞吞没。通过执行免疫染色，确保M1巨噬细胞完全极化非常重要。结果表明（图1）表明，100纳克/mL脂多糖（LPS）和20纳克/mL IFN-α的浓度将RAW264.7巨噬细胞浓度至M1状态。用荧光染料标记目标细胞，使效应细胞不沾染，可以进行活细胞共培养模型（电影1）。在13小时和15分钟间隔内，M1巨噬细胞与4T1细胞共培养的噬菌体活动被记录（电影2）。六个多点视频（电影 2中的A+F）被录制，以评估单个 35 mm 玻璃底成像盘中的多个事件。电影 3显示了由 M1 巨噬细胞的噬菌体所噬菌的 4T1 细胞。电影 4被选为从本实验中拍摄的深入视频的示例，电影 5显示了 M1 巨噬细胞对 4T1 细胞的吸收。
图1：绿色抗iNOS-FITC免疫荧光染色，蓝色核标记DAPI，合并图像增强版。这些面板代表 RAW 264.7 巨噬细胞（控制）和 M1 巨噬细胞 （LPS 和 IFN-β 刺激） 免疫与抗 iNOS-FITC （M1 标记） 在绿色和反染色核标记，DAPI 蓝色。（A） DAPI 染色可同时观察到 RAW 264.7 和 M1 巨噬细胞.（B） 在M1巨噬细胞上，只有氟光，只有抗iNOS-FITC（绿色）。（C） DAPI 染色和防 iNOS-FITC 的合并图像。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：在成像软件采集对话框控制中设置荧光和DIC图像采集。[1]选择[Lambda]选项卡复选框，[2]选择[光学配置]并选择[10X DIC]和[GFP-R]为绿色荧光滤波器复选框，[3]选择[10X DIC] |[将此通道设置为焦点参考]。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：在成像软件采集对话框控制中设置多点图像采集。[4]选择[XY] 选项卡，然后[5]选中[点名称] 列下的复选框以设置图像捕获的每个点。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：设置延时测量图像捕获的间隔和持续时间。成像软件采集对话框控制，设置延时图像捕获。要在[时间]选项卡上设置延时图像采集[6]检查，[7]确定[间隔]（按秒、分钟或小时）和[8] [持续时间]（按秒、分钟或小时）。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5：设置多点电影面板以进行延时测量图像捕获。完成 13 小时共文化后，六个多点电影面板的预览组合。请点击此处查看此图的较大版本。
电影1：使用荧光和DIC显微镜的多通道采集捕获的未染色M1巨噬细胞和4T1CFSE染色小鼠乳腺癌细胞的代表性电影。结果显示CFSE在4T1小鼠乳腺癌细胞的绿色标记细胞壁与未染色的M1巨噬细胞共同培养。使用多通道采集（步骤 7.3，参见图 2），在 13 h 共培养期间获取延时图像，间隔为 15 分钟。（A） 差分干涉对比度，（红圈）显示小，圆形M1巨噬细胞附着在4T1细胞，具有上皮形态。（B） 在巨噬细胞噬菌体噬菌体前，4T1细胞沾染CFSE的荧光显微镜图像。（C） CFSE 染色的 4T1 细胞被未染色的 M1 巨噬细胞吞没的合并 DIC 和荧光显微镜图像。蓝色箭头显示未染色的M1巨噬细胞在吞噬CFSE标记的4T1细胞时变绿。比例尺 = 50 μm.请点击此处下载此视频。
电影2：来自单个成像盘中多个阶段点的真细胞视频显微镜电影，显示4T1小鼠乳腺癌细胞的噬菌体通过诱导的M1巨噬细胞的噬菌体。结果表示使用成像软件设置和协调的六个不同点（Movie 2A+F）（步骤 7.4，参见图 3=图 5）。M1巨噬细胞具有不规则的煎饼状形态，具有多孔细胞质，而4T1小鼠乳腺癌具有上皮形态。M1巨噬细胞和4T1细胞在37°C的阶段培养箱内共培养13小时，CO2为5%，然后进行活细胞视频显微镜观察。图像以15分钟的时间间隔拍摄，时间间隔为13小时。比例尺= 50 μm。请点击此处下载此视频。
电影3：单坐标点的真细胞视频显微镜电影（见电影2），选择详细显示4T1小鼠乳腺癌的噬菌体。红色箭头显示噬菌体。黄色圆圈显示4T1细胞的数量，淬火4T1细胞的吞没。比例尺 = 10 μm.请点击此处下载此视频。
电影4：一个详细的视频，以进一步可视化4T1细胞的噬菌体4T1细胞的噬菌体过程。此面板显示具有多孔细胞质表型的活 M1 巨噬细胞细胞。比例尺 = 10 μm.请点击此处下载此视频。
电影5：巨噬细胞向4T1细胞移动以建立细胞与细胞的接触，然后由M1巨噬细胞摄取4T1细胞（参见电影2A）。相对比显微镜延时视频以15分钟的时间间隔成像，在37°C的阶段顶部孵化器内，在37°C和5%CO2中，13小时共栽培。比例尺 = 10 μm.请点击此处下载此视频。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
所述方案需要两个步骤：1） 4T1小鼠乳腺癌细胞和M1极化巨噬细胞的共培养，以及2）使用延时显微镜评估巨噬细胞噬菌体活性。活细胞共培养被广泛用于噬菌体测定和迁移测定。此处的活细胞共培养模型是一种简单、适应性强的体外程序（图2），它利用荧光染料CFSE，用于标记4T1靶向细胞。这用于在活细胞成像期间正确跟踪细胞类型。延时活细胞成像用于在13小时共增生前使用多点延时2D成像评估M1巨噬细胞的噬菌体活动。
利用4T1小鼠乳腺癌细胞和M1小鼠巨噬细胞建立了活细胞共培养模型。为了区分细胞彼此，4T1细胞使用CFSE荧光染料染色（见第4节）。CFSE 允许跟踪细胞和监测细胞分裂。CFSE可以被动地扩散到细胞中，使CFSE染色成为合适的细胞跟踪器，以可视化靶向细胞的噬菌体。当吞噬性巨噬细胞消化和吞噬癌细胞时，它们吸收CFSE染料，最终成为荧光12，13。在M1巨噬细胞之前，在成像盘中播种4T1细胞至关重要。这是因为两个单元格的大小和形状不同。4T1细胞具有在小簇中增殖的上皮形态。此外，4T1细胞在与未染色的M1巨噬细胞共培养之前，必须沾染CFSE。在使用LPS和IFN-*进行巨噬细胞极化之前，鼠巨噬细胞RAW 264.7是圆形的，体积小，通常作为单个细胞生长。在LPS和IFN-+极化后，诱导的M1巨噬细胞具有相对扁平的煎饼状形状，具有多孔细胞质14、15。为确保RAW 264.7与M1状态的正确极化，100纳克/mL LPS和20纳克/mL IFN--刺激巨噬细胞用M1标记物免疫染色，抗iNOS抗体与FITC结合（图1）。该协议是在对巨噬细胞和目标细胞进行共培之前执行的，以确保巨噬细胞完全极化为M1状态。
本研究描述了一种荧光显微镜方法，用于可视化活巨噬细胞的噬菌体的噬菌体活性。为了尽量减少光漂白和提供更好的荧光成像，荧光显微镜可以与其他对荧铬无损的成像技术相结合，类似于DIC。本协议描述了LPS和IFN-+刺激巨噬细胞使用荧光和DIC延时显微镜评估小鼠乳腺癌细胞的噬菌体所需的材料和方法。然而，与相对比延时成像相比，荧光显微镜研究在研究活细胞成像时有局限性。在荧光活细胞成像过程中，长时间暴露在高射能光下可引起严重的细胞损伤16。光漂白会导致活细胞成像中的严重问题。活细胞成像中使用的高强度照明会降低CFSE染料的荧光能力。然而，在研究的第二部分，使用相对比延时2D成像（电影2-5）进行了13小时噬菌体评估。
延时显微镜具有一些优点，例如，在所需的持续时间内，从单个实验的任何时间点生成数据，并且显著地，可以捕获单个成像盘中的多个阶段点进行单个实验。这允许在单个实验中观察各种位置。该协议也可用于使用培养板中的多个孔（例如，6、24、96 孔板）。成功进行活细胞成像实验的最关键的技术挑战包括使用舞台顶部培养箱提供37°C、95%的湿度和5%的CO2稳定温度，从而保持细胞处于健康状态。因为实验花了13小时，确保显微镜在整个过程中正常工作至关重要。
在这项研究中，在13小时的持续过程中，在成像盘中捕获了6个不同的点，每点间隔15分钟（电影2）。点可以根据被调查的单元格的事件进行调整。考虑到在整个实验中要捕获多个阶段点，在进行实时单元视频录制之前确保每个点具有稳定的焦点非常重要。必须优化调查的时间间隔。缩短的时间间隔将具有可以成像的更详细的点;但是，文件大小将非常大。增加时间间隔将导致视频冗长，并使影片失去连续性。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由马来西亚普特拉大学GeranPutraBerimpak（GBP）资助：9542800。我们要感谢农业生物技术研究所、马来西亚（ABI）实验室和显微镜成像设施。特别感谢莫赫德丹尼尔哈齐姆帮助编辑和记录这项工作的实验视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
