Summary
In questo studio è stata esaminata l'attività fagocitica dei macrofagi contro le cellule tumorali, in particolare le cellule carcinoma mammario dei topi da 4T1. Il modello di cocoltura a cellule vive è stato stabilito e osservato utilizzando una combinazione di microscopia a contrasto di interferenza fluorescente e differenziale. Questa valutazione è stata immaginata utilizzando un software di imaging per sviluppare video time-lapse multipunto.
Abstract
I macrofagi associati al tumore (TAM) sono stati identificati come una componente importante per la crescita del tumore, l'invasione, la metastasi e la resistenza alle terapie tumorali. Tuttavia, i macrofagi associati al tumore possono essere dannosi per il tumore a seconda del microambiente tumorale e possono alterare reversibilmente le loro caratteristiche fenotipiche antagonizzando l'attività citotossica delle cellule immunitarie o migliorando la risposta antitumorale. Le azioni molecolari dei macrofagi e le loro interazioni con le cellule tumorali (ad esempio, la fagocitosi) non sono state ampiamente studiate. Pertanto, l'interazione tra le cellule immunitarie (M1/M2-sottotipo TAM) e le cellule tumorali nel microambiente tumorale è ora al centro della ricerca sull'immunoterapia del cancro. Nel presente studio, è stato sviluppato un modello di cocultura di cellule vive di macrofagi M1 indotti e cellule carcinoma 4T1 mammaria indotta per valutare l'attività fagocitica dei macrofagi utilizzando una funzione video time-lapse utilizzando la microscopia di contrasto di fase, fluorescente e contrasto differenziale (DIC). Il metodo attuale può osservare e documentare l'imaging multipunto a cellule vive della fagocitosi. La fagocitosi di 4T1 cellule da macrofagi M1 può essere osservata utilizzando la microscopia fluorescente prima di colorare le cellule 4T1 con carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). La pubblicazione attuale descrive come co-cocoltura macrofagi e cellule tumorali in un unico piatto di imaging, polarizzare i macrofagi M1 e registrare eventi multipunto di macrofagi che inghiottiscono le cellule 4T1 durante 13 h di cocultura.
Introduction
I macrofagi sono la prima linea di difesa immunitaria e svolgono un ruolo nell'orchestrazione delle risposte immunitarie contro agenti patogeni e materiali estranei, comprese le cellule tumorali. Sono un fagocitato specializzato che distrugge e si sbarazza delle particelle indesiderate nel corpo. I macrofagi contribuiscono a funzioni difensive come lo sgombero di cellule e microrganismi apoptotici e il reclutamento di altre cellule immunitarie1. I macrofagi possono differenziarsi in due tipi diversi, i macrofagi M1 e M2, in risposta ai segnali ambientali2. I macrofagi polarizzati M1 (cioè i macrofagi attivati classicamente) vengono attivati dall'interferone-interferone-interferone-interferone-citochina (IFN-z) e dai lipopolisiari (LPS) e sono coinvolti nella risposta, nella clearance degli agenti patogeni, nell'efficiente fagocitosi infiammatoria e nell'immunità tumoricidala3,4. I macrofagi M2 sono strettamente correlati ai macrofagi associati al tumore (ARM) e hanno proprietà di promozione antiinfiammatorie e tumorale4.
Fagocitosi, derivata dall'antico greco (phagein), che significa "divorare", (kytos), che significa "cellula" e -osis, che significa "processo"5. La fagocitosi è un processo mediato dal recettore in cui i fagociti (compresi macrofagi, monociti e neutrofili) uccidono e inghiottiscono agenti patogeni invasori, ripuliscono le particelle estranee e ripuliscono i detriti cellulari apoptotici. I macrofagi associati al tumore (TAM) si trovano nello stroma in diversi tumori, tra cui il cancro al seno, e hanno funzioni pro-tumore6,7, con conseguente resistenza alla fagocitosi. Il meccanismo dettagliato della fagocitosi delle cellule tumorali da parte dei macrofagi non è ancora compreso.
Questo studio presenta un metodo in due fasi: 1) 4T1 cellule di carcinoma mammario e macrofagi polarizzati M1 sono costati, e 2) l'attività fagocistica dei macrofagi viene valutata utilizzando la microscopia video a cellule vive. Il coloranti fluorescente CFSE è stato utilizzato per macchiare le cellule carcinoma mammario del topo 4T1. La macchia etichetta le cellule 4T1 per distinguerle dai macrofagi M1 cocolto all'interno di un singolo piatto di imaging. I macrofagi RAW 264,7 sono polarizzati con LPS e IFN-z in un fenotipo M1. Per garantire una polarizzazione completa, è stata eseguita l'immunostaining con anticorpo anti-iNOS coniugato al FITC. Successivamente, è stata acquisita una serie multipunto di immagini time-lapse per osservare più eventi, tra cui la fagocitosi, all'interno della cocultura.
Una migliore comprensione delle interazioni tra cellule tumorali e macrofagi può portare a una potenziale immunoterapia del cancro. L'imaging a cellule vive offre una visione dettagliata della dinamica cellulare in un ambiente in tempo reale ed è stata utilizzata per studiare la migrazione cellulare, lo screening fenotipico, l'apoptosi e la citotossicità8,9 in neuroscienze, biologia dello sviluppo e scoperta di farmaci. Anche se il tumore proposto in questo studio è il cancro al seno, il metodo può essere applicato anche a più cellule bersaglio e cellule echeggiatrici distinte.
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Protocol
NOTA: Le sezioni 1-6 descrivono il modello di cocultura delle cellule carcinoma mammario 4T1 e dei macrofagi di topo RAW 264.7. La sezione 7 descrive la valutazione time-lapse delle cellule 4T1 fagicitarie M1.
1. Coltivare cellule carcinoma mammario 4T1 e macrofagi di topo RAW 264.7
- Scongelare una fiala di criogenicamente conservato 4T1 e RAW 264.7 passaggio 6 celle con agitazione delicata in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi o la temperatura di crescita normale per le linee cellulari.
NOTA: Lo scongelamento deve essere fatto rapidamente, approssimativamente entro 2 min. Per evitare la contaminazione, rimuovere la fiala dal bagno d'acqua e decontacerarla spruzzandola con il 70% di etanolo. Per evitare la deriva genetica, soprattutto per i macrofagi, utilizzare un numero di passaggio basso (cioè meno di 20). - Diluire le cellule scongelate in 10 mL di mezzo DMEM completo in un tubo conico da 15 mL e centrificare le cellule a 600 x g per 5 min per ottenere un pellet cellulare.
NOTA: il mezzo DMEM completo integrato con il 10% (v/v) del siero bovino fetale (FBS), 200 U/mL penicillina/streptomicina e 2 mM L-glutamine viene utilizzato in tutto il protocollo. - Aspirare con attenzione il supporto, risospendere le cellule in 8 mL di mezzo completo e trasferire in una coltura di tessuto 25 cm2 trattati. Coltura sia 4T1 e RAW 264.7 cellule in completo DMEM medio a 37 .C con 5% CO2.
NOTA: Risospendere delicatamente i pellet cellulari e aggiungere la sospensione cellulare nel flacone di coltura goccia a goccia per evitare di uccidere le cellule. - Dopo 1 settimana di coltura per consentire l'aderenza cellulare, monitorare il pallone ogni giorno e aggiungere 8 mL di mezzo DMEM completo secondo necessità.
2. Immunostaining di M1 polarizzato RAW 264.7 macrofagi
- Poiché la confluenza di cellule RAW 264,7 raggiunge il 70-80%, scartare i mezzi di coltura e risciacquare delicatamente 2x con almeno 2 mL di PBS.
NOTA: Prima di seminare cellule RAW 264.7, assicurarsi che non si sia verificata alcuna differenziazione cellulare (ad esempio, fenotipo dendrite e/o dimensioni delle cellule aumentate). Se i cambiamenti di morfologia cellulare sono visibili, eliminare la coltura e scongelare una nuova linea cellulare dal passaggio precedente fiala. - Preparare i macrofagi per la raccolta dislocando delicatamente le cellule aderenti utilizzando un raschietto cellulare e trasferirle in un tubo conico da 15 mL.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare una sospensione cellulare di 1 x 105 cellule / piatto utilizzando il mezzo DMEM completo.
- Seme 2 mL della sospensione dei macrofagi in due piatti di imaging. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per consentire l'aderenza alle cellule.
- Preparare il supporto di polarizzazione M1 aggiungendo 100 lPS ng/mL e 20 ng/mL IFN-z nel mezzo DMEM completo10,11.
- Eliminare il supernatante di coltura dai macrofagi e lavare con cura i monostrati nel piatto 2x con almeno 1 mL di PBS.
- Aggiungere 2 mL di supporti di polarizzazione M1 in uno dei piatti di imaging, consentire alle cellule RAW 264.7 di indurre il fenotipo del macrofago M1 e incubare 2-3 h a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
NOTA: Seme RAW 264.7 macrofaages in una teglia di imaging con DMEM integrato con 10% FBS come controllo per la colorazione anti-iNOS. Etichettare i piatti di imaging RAW (controllo) e M1 macrofagi (LPS e IFN-polarizzati), rispettivamente. - Prima dell'immunostaining, fissare le cellule RAW 264.7 e M1 utilizzando 2 mL di paraformaldeide del 4% e incubare per 15 min a 37 gradi centigradi (temperatura ambiente, RT).
- Rimuovere il supernatante e lavare il monostrato cellulare con 1 mL di PBS almeno 3x.
- Quench con 2 mL di cloruro di ammonio da 50 mm in PBS e incubazione per 15 min a RT.
- Permeabilitare utilizzando 2 mL di 0,3% Triton X-100 in PBS per 15 min a RT.
- Rimuovere il supernatante e lavare il monostrato cellulare con 1 mL di PBS almeno 3x.
- Bloccare l'utilizzo di 2 mL di 10% FBS in PBS per 30 min a RT.
NOTA: La fase di blocco nell'immunostaining consiste nel ridurre al minimo il legame non specifico dell'anticorpo all'interno della cellula. - Rimuovere il supernatante e lavare il monostrato cellulare con 1 mL di PBS almeno 3x.
- Incubare con 2 mL di anti-iNOS-FITC in PBS e 1% FBS durante la notte a 4 gradi centigradi.
NOTA: Etichettare le cellule utilizzando la diluizione dell'anticorpo appropriato in base alle raccomandazioni del produttore. Proteggere i piatti dalla luce coprendoli con un foglio di alluminio da questo punto in elogno. - Rimuovere il supernatante e lavare il monostrato cellulare con 1 mL di PBS almeno 3x.
- Incubare 1 mL di 300 nM 6-diamidino-2-fenilondole (DAPI) in piatti di imaging per 10 min in 37 gradi c, al buio coprendo con un foglio di alluminio.
- Lavare le celle con 1 mL di PBS almeno 3x e aggiungere 1 mL di mezzo DMEM completo nei piatti di imaging.
NOTA: le cellule sono ora pronte per l'imaging a fluorescenza. La configurazione del microscopio avrà bisogno di uno stadio invertito e filtri di eccitazione per le macchie scelte (in questo caso, FITC e DAPI). - Accendere il microscopio e caricare il software di imaging. Montare il pofonio di imaging al microscopio e regolare la messa a fuoco per osservare i macrofagi RAW 264.7 e M1. Ottimizzare l'aspetto delle immagini FITC e DAPI a contrasto di fase regolando i tempi di luce e di esposizione trasmessi.
NOTA: Iniziare l'imaging quando tutti i punti sono a fuoco e i canali sono ottimizzati. - Acquisire immagini FITC e DAPI a contrasto di fase(Figura 1).
3. Semina 4T1 cellule carcinoma mammario
- Poiché la confluenza delle cellule 4T1 raggiunge il 70-80%, scartare i mezzi di coltura e risciacquare delicatamente 2x con almeno 2 mL di PBS. Aggiungere 1 mL di prova preriscaldata per dissociare le cellule e incubare fino a 20 min a 37 gradi centigradi.
NOTA: Osservare le cellule al microscopio. Le celle scollegate verranno arrotondate. - Una volta staccate le cellule, trasferirle in un tubo conico da 15 mL e aggiungere 2 mL di mezzo DMEM completo preriscaldato per inattivare la trypsin. Disperdere delicatamente il mezzo convogliando la superficie dello strato cellulare per recuperare le cellule. Quindi, centrifugare a 600 x g per 5 min per ottenere un pellet cellulare.
- Rimuovere il supernatante e rispendere il pellet in 10 mL di preriscaldato mezzo DMEM completo.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e semi 1 x 105 4T1 cellule in 2 mL di mezzo DMEM completo in ciascuno dei due piatti di imaging in vetro-fondo da 35 mm trattati con coltura tissutale. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
NOTA: Coltura 4T1 cellule in uno dei piatti di imaging con supporto di polarizzazione M1 e etichetta 4T1-Inducer (controllo). Questo per garantire la normale crescita delle cellule 4T1 quando esposte agli induttori.
4. Etichettatura vivente 4T1 cellule carcinoma mammario utilizzando la colorazione CFSE
- In primo luogo, rimuovere il supporto esistente dai piatti di imaging delle cellule 4T1. Lavare il monostrato cellulare almeno 2x con 1 mL di PBS.
- Preparare 5 M di soluzione di colorazione CFSE diluindo CFSE in 1 mL di PBS. Aggiungete 1 mL di 5 mSoluzione di colorazione CFSE in ogni piatto di imaging e incubate le cellule per 20 min a RT o 37 gradi centigradi, al buio.
NOTA: Etichettare le cellule utilizzando un'adeguata concentrazione di lavoro CFSE in base alle raccomandazioni del produttore e agli esperimenti preliminari per ottenere la concentrazione di colorazione CFSE ottimale. L'efficienza di etichettatura sarà maggiore se CFSE viene diluito in PBS. - Quench la colorazione con l'aggiunta di un volume uguale di supporto DMEM completo contenente 10% FBS e soluzione di colorazione alle cellule e incubare per 5 minuti a RT al buio.
- Eliminare la soluzione contenente CFSE e lavare le cellule 1x con un volume uguale di supporti di coltura.
NOTA: 4T1 cellule sono ora etichettate in modo fluorescente. - Riportare le celle 4T1-CFSE alle condizioni di coltura standard a RT con 5% CO2.
5. Seeding RAW 264.7 macrofagi murini e coculture con 4T1
- Poiché la confluenza di RAW 264,7 raggiunge il 70-80%, scartare i mezzi di coltura e risciacquare delicatamente 2x con almeno 2 mL di PBS.
- Preparare i macrofagi per la raccolta dislocando delicatamente le cellule aderenti utilizzando un raschietto cellulare e trasferirle in un tubo conico da 15 mL.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro e preparare una sospensione cellulare di 1 x 105 cellule / mL diluindo la soluzione rimanente con un supporto DMEM completo in base alla densità di semina.
NOTA: Le cellule eccessivamente confluenti nelle coculture possono ridurre gravemente la fagocitosi. In questo studio, il rapporto di semina dei macrofagi: le cellule tumorali sono state regolate in un rapporto 1:1. Il rapporto può essere regolato a seconda dell'aggressività delle cellule tumorali e dell'origine dei macrofagi. - Prima di cocultura, scartare il supernatante di coltura dalle cellule 4T1 seminate un giorno prima (passaggio 4.5) e lavare attentamente i monostrati 2x con almeno 1 mL di PBS.
- Seme 1 x 105 RAW 264,7 celle per 2 mL di media DMEM completa in uno dei piatti di imaging 4T1. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 per consentire l'aderenza alle cellule. Etichettare la cocultura 4T1-M1 del piatto di imaging.
NOTA: le celle 4T1 (controllo) non erano costati con i macrofagi.
6. M1 polarizzazione di RAW 264.7 macrofagi
- Preparare i supporti di polarizzazione M1 aggiungendo 100 ng/mL LPS e 20 ng/mL IFN-z nel mezzo DMEM completo integrato con 10% (v/v) FBS10,11.
- Eliminare il supernatante di coltura dai macrofagi incubati prima (passaggio 5.5) e lavare con cura i monostrati nel piatto 2x con almeno 1 mL di PBS.
- Quindi, aggiungere 2 mL di supporti di polarizzazione M1 nella parabola di imaging e consentire alle cellule RAW 264.7 di indurre nel fenotipo del macrofago M1 incubando a 37 gradi centigradi con 5% di CO2.
NOTA: Le cellule di macrofalo M1 possono occupare 2/3 h di incubazione per ottenere una polarizzazione completa. Gli esperimenti preliminari devono essere fatti per garantire il periodo di incubazione adeguato per consentire la completa polarizzazione dei macrofagi.
7. Microscopia video a cellule vive della fagocitosi
NOTA: molti fattori devono essere considerati quando si esegue l'imaging a celle vive per ottenere un video producibile, tra cui l'ottimizzazione dell'esposizione dell'immagine, la misurazione del tempo e la correzione automatica della messa a fuoco.
- Prima dell'esperimento, impostare l'incubatrice a coltura cellulare accendendo il termostato a 37 gradi centigradi e fornendo il 5% di CO2.
NOTA: la configurazione del microscopio richiede uno stadio invertito, un'incubatrice superiore dello stadio, un controllo dell'umidità (95%) e un sistema di incubazione del gas. Questa configurazione è fondamentale per mantenere le cellule per la valutazione della microscopia video a cellule vive a lungo termine. - Accendere il microscopio, compreso lo stadio di piezo e caricare il software di imaging del microscopio.
- Posizionare le cellule di cocultura dei semi in un piatto di imaging con fondo di vetro da 35 mm al centro dello stage e avvitare delicatamente sulla camera superiore. Utilizzare il joystick per motorizzare lo stage selezionando la posizione da immagine.
- Per visualizzare il campione, selezionare il filtro a contrasto di fase sulla torretta. Dopo aver visualizzato inizialmente l'esempio, individuare i campi appropriati e mettere a fuoco l'esempio.
NOTA: il software di imaging consente l'utilizzo di una selezione obiettivo completamente automatizzata, di Perfect Focus System, di serie time-lapse, di acquisizione di immagini multicanale e di acquisizione di immagini multipunto. - Per impostare la fluorescenza multicanale per l'etichettatura CFSE e l'acquisizione del contrasto delle interferenze differenziali, aprire la finestra di dialogo di acquisizione del software di imaging e selezionare la casella di controllo della scheda [Lambda] (Figura 2).
NOTA: per un'imaging time-lapse di 13 h, deve essere utilizzato un canale di contrasto di fase. - Selezionare la scheda [Lambda] [Configurazione ottica] e selezionare [10X DIC] per il contrasto delle interferenze differenziali e [GFP-R] per la casella di controllo del filtro a fluorescenza verde. Sotto il [Lambda] Colonna [Focus], selezionare la casella di controllo [10X DIC] per impostare come riferimento dello stato attivo.
- Aprire la finestra di dialogo di acquisizione del software di imaging e fare clic sul pulsante [XY-Time ...] e selezionare la scheda [XY].
- Passare al punto di acquisizione dell'immagine utilizzando il joystick sullo stage motorizzato mentre si controlla l'immagine dal vivo o selezionare una posizione diversa attraverso gli oculari. Quindi fare clic sulla casella di controllo nella colonna [Nome punto] per impostare ogni punto in ogni posizione per l'acquisizione di immagini (vedere Figura 3).
NOTA: la fase automatica consente l'acquisizione di immagini multipunto di diverse coordinate XY per acquisire più campi. - Ottimizzare lo stato attivo per ogni campione visualizzato sullo schermo. Utilizzare i controlli della correzione automatica dello stato attivo.
- Utilizzare il software per impostare l'acquisizione di immagini time-lapse. Nella finestra di dialogo di acquisizione del software di imaging, selezionare la scheda [Ora] (vedere la Figura 4).
- Determinare [Intervallo] (il ritardo tra l'inizio di un punto temporale a un altro punto temporale) e [Durata] (la durata totale dell'esperimento). Le unità di tempo variano e possono essere selezionate in millisecondi (ms), secondi (s), minuti (m) o ore (h) dal menu a discesa.
NOTA: la durata del periodo di imaging per l'imaging time-lapse di fluorescenza e acquisizione multicanale DIC time-lapse può variare a seconda del coloranti fluorescente utilizzato in questo saggio. Il fotobleaching può verificarsi se le cellule etichettate sono esposte per troppo tempo. - Selezionare la casella di controllo [Salva su file] per salvare le immagini acquisite. Nella scheda [Pianificazione ora] fare clic sul pulsante [Esegui ora] per acquisire immagini di serie temporali multipunto (vedere Figura 5).
NOTA: nel software di imaging, le immagini vengono salvate in formato file nd2. Ogni time-lapse può essere salvato singolarmente in un formato di file MP4 in un secondo momento.
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Representative Results
Le immagini bidimensionali (2D) del modello di cocultura 4T1 del carcinoma mammario del topo mostrano che le cellule 4T1 sono inghiottite dai macrofagi M1 durante un periodo di 13 h. È importante garantire una completa polarizzazione dei macrofagi M1 eseguendo l'immunostaining. I risultati (Figura 1) mostrano che la concentrazione di 100 lipopolysaccharides (LPS) e 20 ng/mL IFN -b-polarizzato RAW 264.7 nello stato M1. L'etichettatura delle cellule mirate con un colorante fluorescente e l'abbandono delle cellule efqualive consente un modello di cocultura a cellule vive (Film 1). Per tutto l'intervallo di 13 h e 15 minuti, è stata documentata l'attività fagocitica dei macrofagi M1 in cocultura con le cellule 4T1 (Film 2). Sono stati registrati i sei video multipunto (A-F nel film 2) per valutare più eventi all'interno di una singola parabola di imaging con fondo di vetro da 35 mm. Il film 3 mostra le cellule 4T1 fagocitosed da macrofagi M1. Il film 4 è stato scelto come esempio di un video approfondito girato da questo esperimento e Movie 5 mostra l'assorbimento delle cellule 4T1 da parte dei macrofagi M1.
Figura 1: Colorazione immunofluorescenza con anti-iNOS-FITC in verde, marcatore nuclei DAPI in blu, e versioni migliorate delle immagini fuse. Questi pannelli rappresentano i macrofagi RAW 264.7 (controllo) e M1 (LPS e stimolati IFN- z) immunostained con marcatore anti-iNOS-FITC (M1) in verde e contromacchiato con marcatore nuclei, DAPI in blu. (A) La macchia DAPI può essere osservata sia nei macrofagi RAW 264.7 che M1. (B) Anti-iNOS-FITC (verde) fluoresce solo sui macrofagi M1. (C) Immagini unite di macchie DAPI e anti-iNOS-FITC. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Impostazione della fluorescenza e dell'acquisizione di immagini DIC nel controllo della finestra di dialogo di acquisizione del software di imaging. [1] selezionare la casella di controllo della scheda [Lambda], selezionare [Configurazione ottica] e selezionare [10X DIC] e [GFP-R] per la casella di controllo del filtro di fluorescenza verde, [3] selezionare [10X DIC] . [Imposta questo canale come riferimento per la messa a fuoco]. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Impostazione dell'acquisizione di immagini multipunto nel controllo della finestra di dialogo di acquisizione del software di imaging. [4] Selezionare la scheda [XY] e successivamente [5] selezionare la casella di controllo nella colonna [Nome punto] per impostare ogni punto per l'acquisizione dell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Impostazione degli intervalli e della durata dell'acquisizione dell'immagine di misurazione time-lapse. Controllo della finestra di dialogo di acquisizione del software di imaging per impostare l'acquisizione di immagini time-lapse. Per impostare il controllo dell'acquisizione dell'immagine time-lapse [6] nella scheda [Ora], [7] determinare l'[Intervallo] (per sec, min o ora) e [8] [Durata] (per sec, min o ora). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Impostazione di pannelli di filmato multipunto per l'acquisizione di immagini di misurazione time-lapse. L'anteprima di sei pannelli di film multipunto combinati dopo il completamento di 13 h di cocultura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1: Un film rappresentativo di macrofagi M1 non macchiati e cellule carcinoma mammario del topo color CFSE 4T1 in cocultura catturati utilizzando l'acquisizione multicanale di microscopia fluorescente e DIC. Risultati che mostrano CFSE nella parete cellulare con etichetta verde di cellule carcinomimammali da 4T1 costati con macrofagi M1 instainati. Le immagini time-lapse sono state acquisite per un periodo di coculture di 13 h con intervalli di tempo di 15 minuti utilizzando l'acquisizione multicanale (passaggio 7.3, vedere la figura 2). (A) Il contrasto differenziale delle interferenze, (cerchio rosso) mostra piccoli macrofagi M1 rotondi aderenti alle cellule 4T1, che hanno una morfologia epiteliale. (B) Immagine di microscopia a fluorescenza di 4T1 cellule macchiate con CFSE prima della fagocitosi dai macrofagi. (C) Immagini di microscopia DIC e a fluorescenza unite di cellule 4T1 macchiate di CFSE che vengono inghiottite da macrofagi M1 incontaminati. Le frecce blu mostrano i macrofagi M1 incontaminati che fluorezzano di verde mentre inghiottiscono le cellule 4T1 etichettate con CFSE. Barra di scala - 50 m. Clicca qui per scaricare questo video.
Filmato 2: filmati di microscopia video a celle vive da più punti fase in un'unica parabola di imaging che mostra la fagocitosi delle cellule carcinomiche mammarie 4T1 da macrofagi M1 indotti. I risultati rappresentano sei punti diversi(Film 2A-F) impostati e coordinati mediante il software di imaging (passaggio 7.4, vedere la Figura 3- Figura5). I macrofagi M1 hanno una morfologia irregolare, simile a una frittella con un citoplasma poroso, mentre i carcinomi mammari dei topi 4T1 hanno una morfologia epiteliale. I macrofagi M1 e le cellule 4T1 sono stati costati per 13 h all'interno dell'incubatrice a 37 gradi centigradi con il 5% diCO2 prima di essere osservati per la microscopia video a cellule vive. Le immagini sono state catturate a intervalli di tempo di 15 min per 13 h. Barra della scala - 50 m. Fare clic qui per scaricare questo video.
Filmato 3: Film a cellule live di un singolo punto di coordinate(vedere Film 2) scelto per mostrare in dettaglio la fagocitosi dei carcinomi mammari a topi 4T1 dai macrofagi M1 indotti. La freccia rossa mostra la fagocitosi. Il cerchio giallo mostra che il numero di 4T1 celle che hanno spento l'inghiottimento di cellule 4T1. Barra della scala : 10 m. Fare clic qui per scaricare questo video.
Filmato 4: Un video dettagliato per visualizzare ulteriormente il processo di fagocitosi delle cellule 4T1 da macrofagi M1. Questo pannello mostra le cellule live M1 con un fenotipo del citoplasma poroso. Barra della scala : 10 m. Fare clic qui per scaricare questo video.
Filmato 5: Macrofagi in movimento verso le celle 4T1 per stabilire il contatto tra celle, seguite dall'assorbimento di celle 4T1 da parte dei macrofagi M1 (vedere Film 2A). Il video time-lapse a microscopia a contrasto di fase è stato immaginato in intervalli di tempo di 15 minuti per 13 h di cocultura all'interno di un'incubatrice superiore dello stadio a 37 gradi centigradi con 5% diCO2. Barra della scala : 10 m. Fare clic qui per scaricare questo video.
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Discussion
Il protocollo descritto richiede due passaggi: 1) cocultura di 4T1 cellule carcinoma mammario e macrofagi polarizzati M1, e 2) valutazione dell'attività fagocitica del macrofago utilizzando la microscopia time-lapse. La cocultura delle cellule vive è ampiamente utilizzata nella fagocitosi e nei saggi di migrazione. Il modello di cocoltura a cellule vive qui è un semplice, procedura in vitro adattabile (Figura 2) che utilizza un colore fluorescente, CFSE, che viene utilizzato per etichettare le cellule mirate 4T1. Questo viene utilizzato per il corretto monitoraggio dei tipi di cellule durante l'imaging delle cellule vive. L'imaging a celle vive time-lapse è stato utilizzato per valutare l'attività fagocistica dei macrofagi M1 utilizzando l'imaging 2D time-lapse multipunto prima dei 13 h della cocultura.
Il modello di cocoltura delle cellule vive è stato creato utilizzando cellule carcinomiche a topi 4T1 e macrofagi murini M1. Per distinguere le cellule l'una dall'altra, le cellule 4T1 sono state macchiate utilizzando un coloranti fluorescente CFSE (cfr. sezione 4). CFSE permette di monitorare le cellule e monitorare la divisione cellulare. CFSE può diffondersi passivamente nelle cellule, rendendo CFSE colorazione un tracker cellulare adatto per visualizzare la fagocitosi di cellule mirate. Come fagocitore macrofagi digeriscono e inghiottiscono le cellule tumorali, prendono il tincolo CFSE e alla fine diventano fluorescenti12,13. È essenziale seedare cellule 4T1 nel piatto di imaging prima dei macrofagi M1. Ciò è dovuto alle diverse dimensioni e forme di entrambe le celle. Le cellule 4T1 hanno una morfologia epiteliale che prolifera in piccoli cluster. Inoltre, le cellule 4T1 devono essere macchiate con CFSE prima della cocultura con i macrofagi M1 non macchiati. Prima della polarizzazione dei macrofagi con LPS e IFN-z, i macrofagi murini RAW 264,7 sono rotondi, piccoli e di solito crescono come singole cellule. Dopo la polarizzazione LPS e IFN-z, i macrofagi M1 indotti hanno una forma relativamente appiattita, simile a un pancake, con un citoplasma poroso14,15. Per garantire una corretta polarizzazione dell'RAW 264,7 verso lo stato M1, 100 lPS ng/mL e 20 macrofagi stimolati ng/mL-z sono stati immunostainvi con un marcatore M1, anticorpo anti-iNOS coniugato al FITC(Figura 1). Questo protocollo viene eseguito prima di cocultura i macrofagi e le cellule mirate per garantire che i macrofagi siano completamente polarizzati nello stato M1.
Questo studio descrive un metodo per la microscopia fluorescente per visualizzare l'attività fagocitica dei macrofagi viventi. Per ridurre al minimo il fotobleaching e fornire una migliore imaging a fluorescenza, la microscopia fluorescente può essere combinata con altre tecniche di imaging non distruttive per il fluorocro, simili a DIC. Il presente protocollo descrive i materiali e i metodi necessari per la valutazione della fagocitosi delle cellule carcinoma mammarie dei topi da parte di LPS e ifN-z stimolati macrofagi utilizzando la microscopia fluorescente e DIC time-lapse. Tuttavia, gli studi di microscopia fluorescente hanno limitazioni quando si studia l'imaging a celle vive rispetto all'imaging time-lapse a contrasto di fase. Durante l'imaging fluorescente delle cellule vive, l'esposizione prolungata a una quantità elevata di luce di eccitazione può indurre gravi danni alle cellule16. Il fotosbiancamento può causare problemi significativi nell'imaging delle cellule vive. L'illuminazione ad alta intensità utilizzata nell'imaging a cellule vive può ridurre la capacità di colorare CFSE di fluorescenza. Tuttavia, nella seconda parte di questo studio è stata ottenuta una valutazione di fagocitosi di 13 h utilizzando l'imaging 2D a contrasto di fase(Film 2–5).
La microscopia time-lapse offre vantaggi come la generazione di dati da un singolo esperimento in qualsiasi momento durante il periodo di durata desiderato e, in modo significativo, è possibile acquisire più punti fase all'interno di un singolo piatto di imaging per un singolo esperimento. Ciò consente l'osservazione di varie posizioni in un singolo esperimento. Il protocollo può essere utilizzato anche utilizzando più pozzi da piastre di coltura (ad esempio, 6, 24, 96 piastre). Tra le sfide tecniche più critiche per eseguire un esperimento di imaging a cellule vive di successo include il mantenimento delle cellule in condizioni di salute utilizzando un'incubatrice superiore di fase per fornire una temperatura stabile di 37 gradi centigradi, il 95% dell'umidità e il 5% di CO2. Poiché l'esperimento ha richiesto 13 h, assicurando che il microscopio funzioni normalmente in tutto era cruciale.
Durante questo studio, sei diversi punti del piatto di imaging sono stati catturati per una durata di 13 h per intervalli di 15 minuti per punto (Film 2). I punti possono essere regolati a seconda dell'evento della cella in esame. Considerando che ci sono più punti fase da catturare durante questo esperimento, è significativo assicurarsi che ogni punto abbia uno stato attivo stabile prima di eseguire la registrazione video a celle live. L'intervallo di tempo per l'indagine deve essere ottimizzato. Un intervallo di tempo ridotto avrà punti più dettagliati che possono essere immagine; tuttavia, la dimensione del file sarà molto grande. L'aumento dell'intervallo di tempo comporterà un lungo video e farà perdere la continuità del filmato.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato finanziariamente da Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Ringraziamo i laboratori Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) e la struttura di microscopia. Un ringraziamento speciale a Mohd Daniel Hazim per l'aiuto nell'editing e nella registrazione del video sperimentale per questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
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