在这项研究中,对癌细胞,特别是4T1小鼠乳腺癌细胞的巨噬细胞噬菌体活性,被成像。利用荧光和差分干扰对比显微镜的组合,建立了活细胞共培养模型并观察了该模型。此评估使用成像软件进行成像,以开发多点延时视频。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)已被确定为肿瘤生长、入侵、转移和抗癌治疗的重要组成部分。然而,肿瘤相关巨噬细胞可能根据肿瘤微环境对肿瘤有害,可以通过对抗免疫细胞的细胞毒性活性或增强抗肿瘤反应来逆转其型型特征。巨噬细胞的分子作用及其与肿瘤细胞(如噬菌体)的相互作用尚未得到广泛研究。因此,肿瘤微环境中免疫细胞(M1/M2-亚型TAM)与癌细胞之间的相互作用是目前癌症免疫治疗研究的重点。在本研究中,利用相压、荧光和差分干扰对比(DIC)显微镜,利用延时视频功能,开发了诱导M1巨噬细胞和小鼠乳腺4T1癌细胞的活细胞共培养模型,以评估巨噬细胞的噬菌体噬菌体活性。本方法可观察和记录噬菌体多点活细胞成像。M1巨噬细胞对4T1细胞的噬菌体进行噬菌体化,在用碳化物氟乙酯(CFSE)染色之前,使用荧光显微镜观察4T1细胞。本期出版物介绍了如何在单个成像盘中共同培养巨噬细胞和肿瘤细胞,将M1巨噬细胞,并记录在13小时共增过程中吞噬4T1细胞的巨噬细胞的多点事件。
巨噬细胞是免疫防御的第一线,在协调对病原体和包括癌细胞在内的异物的免疫反应方面发挥作用。他们是一种专门的噬菌体,破坏和去除体内不需要的颗粒。巨噬细胞有助于防御功能,如清除凋亡细胞和微生物,以及招募其他免疫细胞1。巨噬细胞可以分化成两种不同的类型,M1和M2巨噬细胞,以响应环境信号2。M1极化巨噬细胞(即经典激活的巨噬细胞)由细胞因子干扰素β(IFN-α)和脂多糖(LPS)激活,并参与炎症反应、病原体清除、有效噬菌体和肿瘤杀菌免疫3,4。M2巨噬细胞与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)密切相关,具有抗炎和肿瘤促进作用4。
噬菌体,源自古希腊(噬菌体),意为”吞食”(kytos),意为”细胞”和-osis,意为”过程“5。方噬细胞化是一种受体介导的过程,其中吞噬细胞(包括巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞)杀死和吞噬入侵的病原体,清除异物颗粒,并清除凋亡细胞碎片。肿瘤相关巨噬细胞(TAm)存在于包括乳腺癌在内的不同肿瘤的频闪中,具有亲肿瘤功能6,7,导致对噬菌体产生抗药性。巨噬细胞肿瘤细胞噬菌体的详细机理尚未了解。
本研究提出了两步法:1)4T1小鼠乳腺癌细胞和M1极化巨噬细胞共培养,2)使用活细胞视频显微镜评估巨噬细胞的噬菌体活动。CFSE荧光染料用于染色4T1小鼠乳腺癌细胞。染色标记4T1细胞,以区分它们与一个成像盘中共培养的M1巨噬细胞。RAW 264.7 巨噬细胞与LPS和IFN-α一起极化为M1表型。为了确保完全极化,与FITC结合的抗iNOS抗体进行了免疫染色。随后,获取了多点延时图像,以观察联合文化中的多个事件,包括方噬菌体。
更好地了解肿瘤细胞和巨噬细胞之间的相互作用可能导致潜在的癌症免疫治疗。活细胞成像提供了实时环境中细胞动力学的详细视图,并用于研究细胞迁移、型型筛选、凋亡和细胞毒性8,神经科学、发育生物学和药物发现。虽然本研究中提出的肿瘤是乳腺癌,但该方法也可以应用于多个靶细胞和独特的效应细胞。
所述方案需要两个步骤:1) 4T1小鼠乳腺癌细胞和M1极化巨噬细胞的共培养,以及2)使用延时显微镜评估巨噬细胞噬菌体活性。活细胞共培养被广泛用于噬菌体测定和迁移测定。此处的活细胞共培养模型是一种简单、适应性强的体外程序(图2),它利用荧光染料CFSE,用于标记4T1靶向细胞。这用于在活细胞成像期间正确跟踪细胞类型。延时活细胞成像用于在13小时共增生前使?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作由马来西亚普特拉大学GeranPutraBerimpak(GBP)资助:9542800。我们要感谢农业生物技术研究所、马来西亚(ABI)实验室和显微镜成像设施。特别感谢莫赫德丹尼尔哈齐姆帮助编辑和记录这项工作的实验视频。
Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |