Summary
פעילות מקרופאג phagocytic נגד תאים סרטניים, במיוחד 4T1 עכבר קרצינומה של החלב בתאי, היה בתמונה במחקר זה. מודל התרבות של התאים החיים הוקם ונצפה בשילוב של מיקרוסקופ פלורסנט והפרעות דיפרנציאליות. הערכה זו היתה תמונה באמצעות תוכנת דימות כדי לפתח וידאו לפקיעה מרובה נקודות.
Abstract
מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) זוהו כמרכיב חשוב לצמיחה הגידול, פלישה, גרורות, והתנגדות לטיפולים בסרטן. עם זאת, מקרופאגים הקשורים לגידול יכול להזיק לגידול בהתאם מיקרו הסביבה הגידול יכול להיות הפיך לשנות את מאפייני פנוטימית שלהם על ידי שינוי הפעילות הציטוטוקסיים של תאים חיסוניים או שיפור התגובה נגד הגידול. הפעולות המולקולריות של מקרופאגים והאינטראקציות שלהם עם תאי גידול (למשל, phagocytosis) לא נחקרו בהרחבה. לכן, את האינטראקציה בין התאים החיסוניים (M1/M2-תת-תחום טאם) ואת התאים הסרטניים מיקרוסביבה הגידול הוא כעת מוקד של מחקר חיסוני סרטן. במחקר הנוכחי, תא חי מודל התרבות של מקרופאגים המושרה M1 ו הפטמות העכבר 4T1 תאים קרצינומה פותחה כדי להעריך את הפעילות phagocytic של מקרופאגים באמצעות תכונת וידאו בזמן הקפיצה באמצעות שלב-ניגודיות, פלורסנט, ו הפרעות הפרעה ההפרש (DIC) מיקרוסקופ. השיטה הנוכחית יכולה להתבונן ולתעד הדמיה של תא חי רב-נקודות של phagocyציטוזה. פאיגוציטוזה של התאים 4T1 על-ידי מקרופאגים M1 ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט לפני צביעת התאים 4T1 עם carboxyפלואורומיתעין (CFSE). הפרסום הנוכחי מתאר כיצד להתאים מקרופאגים ותאי הגידול בצלחת הדמיה אחת, הקיטוב מקרופאגים M1, ולהקליט אירועים נקודתי של מקרופאגים בשחוד 4t1 תאים במהלך 13 h של התרבות הקובית.
Introduction
מקרופאגים הם השורה הראשונה של הגנה חיסונית לשחק תפקיד מנצח את התגובות החיסונית נגד פתוגנים וחומרים זרים, כולל תאים סרטניים. הם פגוציט מיוחדים ההורס ומקבל להיפטר חלקיקים לא רצויים בגוף. מקרופאגים לתרום פונקציות הגנתי כגון הסיווג של תאים אפוטוטיים ומיקרואורגניזמים וגיוס של תאים חיסוניים אחרים1. מקרופאגים יכולים להבדיל לשני סוגים שונים, M1 ו M2 מקרופאגים, בתגובה לאותות סביבתיים2. M1-מקרופאגים (כלומר, מקרופאגים המופעל באופן קלאסי) מופעלים על ידי ציטוקינים אינטרפרון-γ (ifn-γ) וליפופוליסכולידים (lps) והם מעורבים בתגובה דלקתית, מחלת הפתוגן, החיסון היעיל phagocyציטוזה, ו-tumoricidal חסינות3,4. מקרופאגים M2 הם קשורים הדוק מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) ויש להם אנטי דלקתיות ומאפיינים קידום הגידול4.
פאיגוציטוזה, נגזר מיוונית עתיקה (phaחיין), כלומר "לטרוף," (kytos), כלומר "תא" ו-osis, כלומר "תהליך"5. Phagocyציטוזה הוא תהליך קולטן בתיווך שבו phagocytes (כולל מקרופאגים, מונוציטים, ו נויטרופילים) להרוג ו בלוע הפולשים פתוגנים, לנקות חלקיקים זרים, ושרידים ברורים תאים האפוטוטיים. הגידול משויך מקרופאגים (tams) נמצאים הסטרומה בגידולים שונים, כולל סרטן השד, יש פונקציות pro-הגידול6,7, וכתוצאה מכך התנגדות phagocyציטוזה. המנגנון המפורט של תאי הגידול phagocyציטוזה על ידי מקרופאגים אינו מובן עדיין.
מחקר זה מציג שיטת שני שלבים: 1) 4T1 עכבר קרצינומה של הפטמות מקוטב M1 ומקרופאגים מקוטנים של מקרופאגים, ו 2) הפעילות phagocytic של המקרופאגים מוערך באמצעות מיקרוסקופ וידאו של תא חי. צבען פלורסנט CFSE שימש כדי להכתים את התאים 4T1 החלב קרצינומה של הפטמות. הכתם תוויות 4T1 תאים כדי להבדיל ביניהם מקרופאגים של M1 מתורבת בתוך צלחת הדמיה אחת. RAW 264.7 מקרופאגים הם מקוטב עם LPS ו IFN-γ לתוך הפנוטיפים M1. כדי להבטיח פולריזציה מלאה, הכתים עם נוגדן anti-iNOS מצותמים ל-FITC בוצעה. לאחר מכן, סדרה מרובת נקודות של תמונות מעידה בזמן נרכשה כדי להתבונן באירועים מרובים, כולל phagocyציטוזה, בתוך התרבות הקובית.
הבנה טובה יותר של האינטראקציות בין תאים סרטניים מקרופאגים עלול לגרום לטיפול חיסוני פוטנציאלי בסרטן. הדמיה של תא חי מציעה תצוגה מפורטת של דינמיקה סלולרית בהגדרה בזמן אמת, שימש לחקר הגירה של תאים, הקרנה פנוטימית, אפופטוזיס, ו-ציטורעילות8,9 ב מדעי המוח, ביולוגיה התפתחותית, וגילוי סמים. למרות הגידול המוצע במחקר זה הוא סרטן השד, השיטה יכולה גם להיות מוחל על מספר תאים היעד ואת התאים הנפרדים אפקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: סעיפים 1-6 לתאר את מודל התרבות של התאים 4T1 הפטמות החלב של העכבר ו RAW 264.7 עכבר מקרופאגים. סעיף 7 מתאר את הערכת הזמן לשגות של מקרופאגים של M1 phagocyted 4T1 תאים.
1. העכבר 4T1 החלב קרצינומה של תאים ומקרופאגים RAW 264.7 עכבר
- הפשרת מבחנה של 4T1 ו-RAW 264.7 מעבר 6 תאים בעצבנות עדינה באמבט מים ב-37 ° c או בטמפרטורת הצמיחה הרגילה לקווי התאים.
הערה: הפשרה צריכה להתבצע במהירות, בערך בתוך 2 דקות. כדי למנוע זיהום, להסיר את המבחנה מאמבט מים ולטהרים אותו על ידי ריסוס עם 70% אתנול. כדי להימנע מסחף גנטי, במיוחד עבור מקרופאגים, להשתמש מספר מעבר נמוך (כלומר, פחות מ 20). - לדלל את התאים המופשרים 10 מ ל של מדיום מלאה Dמאמ ב 15 מ"ל שפופרת חרוטי ו צנטריפוגה את התאים ב 600 x g עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.
הערה: השלם DMEM דיום בינונית בתוספת עם 10% (v/v) העובר סרום (FBS), 200 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, ו 2 מ"מ L-גלוטמין משמש לאורך כל הפרוטוקול. - בזהירות לחות התקשורת, להשעות מחדש את התאים 8 מ ל של בינוני מלא ולהעביר לתוך 25 ס מ2 התרבות רקמה טיפול בקבוקון. תרבות הן 4T1 ו-RAW 264.7 תאים ב-DMEM דיום מלא ב-37 ° צ' עם 5% CO2.
הערה: השהה מחדש את כדורי התא בעדינות להוסיף את ההשעיה התא לתוך הבקבוקון התרבות ירידה על ידי ירידה כדי למנוע הריגת התאים. - לאחר 1 שבוע של culturing כדי לאפשר הדבקות התא, לנטר את הבקבוקון מדי יום ולהוסיף 8 מ ל של מדיום DMEM מלאה בהתאם לצורך.
2. כתמים חיסוני של M1 מקוטב RAW 264.7 מקרופאגים
- כמו שליטה של RAW 264.7 תאים מגיע ל 70-80%, למחוק את מדיית התרבות ולשטוף בעדינות 2x עם לפחות 2 מ ל של PBS.
הערה: לפני זריעת RAW 264.7 תאים, ודא שאף תא לא התרחש (כלומר, דנדט כמו פניטיפים ו/או גודל תא מוגבר). אם שינויי מורפולוגיה של התא גלויים, מחק את התרבות והפשרת קו תא חדש ממבחנה מעבר קודם. - הכינו את מקרופאגים לאיסוף על ידי הפסקת לינה בעדינות את התאים החסיד באמצעות מגרד התא ולהעביר אותם לתוך שפופרת 5 מ ל חרוט.
- לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר ולהכין השעיית תא של 1 x 105 תאים/צלחת באמצעות מדיום dmem מלא.
- זרע 2 מ ל של מקרופאגים ההשעיה לתוך שתי מנות הדמיה. מודאת התאים 2 עד 3 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2 כדי לאפשר הדבקות תא.
- הכנת מדיה הפולני M1 על-ידי הוספת 100 ng/mL LPS ו 20 ng/mL IFN-γלתוך מדיום להשליםבינונית 10,11.
- להשליך את התרבות supernatant מן המקרופאגים ולשטוף בזהירות monolayers בצלחת 2x עם לפחות 1 מ ל של PBS.
- הוסף 2 מ ל של מדיית ה-m1 קיטוב לתוך אחת מנות הדמיה, לאפשר RAW 264.7 תאים כדי לגרום את M1 מקרופאג פניטיפים, ו דגירה 2 – 3 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
הערה: זרע RAW 264.7 מקרופאגים בצלחת הדמיה עם DMEM שיושלם עם 10% FBS כפקד על כתמים נוגדן anti-iNOS. תייג את מנות הדימות RAW (בקרה) ומקרופאגים M1 (lps ו-γ מקוטב), בהתאמה. - לפני מכתים החיסוני, לתקן את התאים RAW 264.7 ו-M1 מקרופאגים באמצעות 2 מ"ל של 4% פאראפורמלדהיד ו דגירה עבור 15 דקות ב 37 ° צ' (טמפרטורת החדר, RT).
- הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
- כיבוי עם 2 מ מ של 50 mM אמוניום כלוריד ב-PBS ו-דגירה עבור 15 דקות at RT.
- החדירות באמצעות 2 מ ל של 0.3% טריטון X-100 ב PBS עבור 15 דקות ב RT.
- הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
- בלוק באמצעות 2 מ ל של 10% FBS ב PBS עבור 30 דקות ב RT.
הערה: השלב החוסם בהכתמים הוא למזער את האיגוד הלא ספציפי של נוגדן בתוך התא. - הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
- דגירה עם 2 מ ל של anti-iNOS-FITC ב-PBS ו 1% FBS לילה ב 4 ° c.
הערה: סמן את התאים באמצעות דילול הנוגדנים המתאים בהתאם להמלצות היצרן. להגן על הכלים מפני אור על ידי כיסוי אותם עם רדיד אלומיניום מנקודה זו והלאה. - הסר את הסופרנטאנט ושטוף את מונאולייר התא עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x.
- מודטה 1 מ ל של 300 ננומטר 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) לתוך מנות הדמיה עבור 10 דקות ב 37 ° c, בחשכה על ידי כיסוי עם רדיד אלומיניום.
- שטוף תאים עם 1 מ ל של PBS לפחות 3 x ולהוסיף 1 מ ל של מדיום מלאה DMEM לתוך מנות ההדמיה.
הערה: התאים מוכנים כעת לדימות הקרינה הפלואורסצנטית. ההתקנה מיקרוסקופ יצטרך שלב הפוך מסנני עירור עבור כתמים נבחרים (במקרה זה, FITC ו-DAPI). - הפעל את המיקרוסקופ וטען את תוכנת הדימות. הר את הצלחת ההדמיה על המיקרוסקופ ולהתאים את המוקד כדי להתבונן RAW 264.7 ו-M1 מקרופאגים. מיטוב המראה של תמונות FITC ו-DAPI עם ניגודיות פאזה על-ידי התאמת זמני האור והחשיפה המשודרים.
הערה: התחל בהדמיה כאשר כל הנקודות מתמקדות והערוצים ממוטבים. - לכידת תמונות FITC ו-DAPI בניגוד לשלב (איור 1).
3. זריעת כדוריות החלב של העכבר 4T1
- ככל ששטף התאים 4T1 מגיע ל-70-80%, מחק את מדיית התרבות ושטוף בעדינות את 2x עם לפחות 2 מ ל של PBS. הוסף 1 מ ל של מקדם התחממות כלפי מעלה כדי לנתק את התאים ואת הדגירה עד 20 דקות ב 37 ° c.
הערה: שימו לב לתאים שמתחת למיקרוסקופ. תאים מנותקים יעוגלו. - ברגע שהתאים מתנתק, העבירו אותם לצינור של 15 מ"ל והוסיפו 2 מ ל של מדיום DMEM לאה מראש כדי להשבית את הטריפסין. לפזר בעדינות את המדיום על ידי ללטף את משטח שכבת התא כדי לשחזר את התאים. אז, צנטריפוגה ב 600 x g עבור 5 דקות כדי להשיג גלולה תא.
- הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של מדיום DMEM לאה.
- לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר וזרע 1 x 105 התאים 4t1 ב 2 מ ' של מדיום מלאה dmem בכל אחד מ-2 35 מ"מ זכוכית מנות הדמיה מטופלים עם תרבות רקמה. דגירה התאים לילה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
הערה: התרבות 4T1 תאים באחד הכלים הדמיה עם מדיה הפולני M1 והתווית 4t1-הסליל (שליטה). זה כדי להבטיח צמיחה נורמלית של תאים 4T1 כאשר נחשפים האינדורים.
4. מתייג החיים 4T1 החלב קרצינומה של תאים באמצעות מכתים CFSE
- תחילה, הסר את המדיה הקיימת מתוך מנות הדימות של התאים 4T1. שטוף את התא מונאולייר לפחות 2x עם 1 mL של PBS.
- הכינו 5 μM של פתרון מכתים CFSE על ידי דילול CFSE ב 1 mL של PBS. הוסף 1 מ ל של 5 μM CFSE מכתים פתרון לתוך כל צלחת הדמיה ו מודחת תאים עבור 20 דקות ב RT או 37 ° c, בחושך.
הערה: סמן את התאים באמצעות הריכוז המתאים CFSE עבודה על פי המלצות היצרן וניסויים ראשוניים כדי להשיג את הריכוז האופטימלי CFSE מכתים. יעילות התיוג יהיה גבוה יותר אם CFSE הוא מדולל ב-PBS. - להרוות את הצביעת על ידי הוספת נפח שווה של מדיום מלאה DMEM המכיל 10% FBS ו הצביעת פתרון לתאים ומודלטה עבור 5 דקות ב-RT בחושך.
- מחק את הפתרון המכיל את CFSE ושטוף את התאים 1x עם נפח שווה של מדיית תרבות.
הערה: כיום 4T1 תאים מסומנים בתווית. - החזר את התאים 4T1-CFSE לתנאי תרבות סטנדרטיים ב-RT עם 5% CO2.
5. זריעת RAW 264.7 העכבר מקרופאגים ו coculture עם 4T1
- כשטף של RAW 264.7 להגיע 70 אל 80%, למחוק את מדיית התרבות ולשטוף בעדינות 2x עם לפחות 2 מ ל של PBS.
- הכינו את מקרופאגים לאיסוף על ידי הפסקת לינה בעדינות את התאים החסיד באמצעות מגרד התא ולהעביר אותם לתוך שפופרת 5 מ ל חרוט.
- לספור את התאים באמצעות הומוציטוטומטר ולהכין השעיית תא של 1 x 105 תאים/mL על ידי דילול הפתרון הנותר עם מדיום dmem מלאה בהתאם לצפיפות הזריעה.
הערה: תאים שוטפת יותר מדי בתרבויות cocultures עלול להפחית באופן חמור את phagocyציטוזה. במחקר זה, את היחס הזריעה של מקרופאגים: תאים סרטניים הותאמו ליחס 1:1. היחס יכול להיות מותאם בהתאם לתוקפנות של תאי הגידול ואת מקורם של מקרופאגים. - לפני coculturing, למחוק את התרבות supernatant מן התאים 4T1 הנזרע יום לפני (שלב 4.5) ובזהירות לשטוף את monolayers 2x עם לפחות 1 מ ל של PBS.
- Seed 1 x 105 RAW 264.7 תאים לכל 2 מ ל של מדיום מלאה dmem לתוך אחת מנות 4T1 הדמיה. מודאת התאים 2 עד 3 h ב 37 ° צ' עם 5% CO2 כדי לאפשר הדבקות תא. תייג את צלחת ההדמיה 4T1-M1 coculture.
הערה: 4T1 (בקרת) תאים לא היו מתורבתים עם מקרופאגים.
6. M1 פולריזציה של RAW 264.7 מקרופאגים
- הכנת התקשורת M1 הפולני על ידי הוספת 100 ng/mL LPS ו 20 ng/mL IFN-γ לתוך בינוני DMEM מלאה בתוספת 10% (v/v) FBS10,11.
- להיפטר supernatant תרבות מן המקרופאגים לפני (שלב 5.5) ובזהירות לשטוף את monolayers בצלחת 2x עם לפחות 1 מ ל של PBS.
- לאחר מכן, להוסיף 2 מ ל של התקשורת M1 קיטוב לתוך צלחת ההדמיה ולאפשר RAW 264.7 תאים כדי לגרום לתוך M1 מקרופאג פניטיפ על ידי הדגירה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
הערה: התאים M1 מקרופאג יכול לקחת עד 2-3 h של דגירה כדי להשיג polarization מלאה. ניסויים ראשוניים צריך להיעשות כדי להבטיח את תקופת הדגירה המתאימה כדי לאפשר פולריזציה מלאה של מקרופאגים.
7. תא חי-מיקרוסקופ וידאו של phagocyציטוזה
הערה: גורמים רבים צריכים להיחשב בעת ביצוע הדמיה של תא חי כדי לקבל וידאו הניתנים להשגה, כולל אופטימיזציה של חשיפה לתמונה, מדידת זמן, תיקון מיקוד אוטומטי.
- לפני הניסוי, להגדיר את החממה תרבות התא על ידי הפעלת תרמוסטט ב 37 ° c ואספקת 5% CO2.
הערה: מערך המיקרוסקופ מחייב שלב הפוך, חממה למעלה במה, בקרת לחות (95%), ומערכת דגירה של גז. הגדרה זו חיונית לשמירה על התאים להערכת מיקרוסקופ וידאו בטווח הארוך של התא החי. - הפעל את המיקרוסקופ כולל השלב piezo וטען את תוכנת דימות המיקרוסקופ.
- מקמו את תאי התרבות השנזרע בצלחת הדמיה של 35 מ"מ מזכוכית במרכז הבמה ובעדינות על החדר העליון. השתמש במוט ההיגוי כדי להפעיל את השלב על-ידי בחירת המיקום לדימות.
- כדי להציג את הדוגמה, בחר את מסנן הניגודיות הפאזה בצריח. לאחר שהצגת בתחילה את המדגם, אתר את השדות המתאימים והבא את המדגם לפוקוס.
הערה: תוכנת הדמיה מאפשרת להשתמש בבחירה אובייקטיבית באופן מלא, מערכת המיקוד המושלם, סדרת פקיעה זמן, רכישת תמונה רב-ערוצית, ורכישת תמונה נקודתי. - כדי להגדיר את הקרינה הפלואורסצנטית עבור תיוג CFSE והתערבות דיפרנציאלית בניגוד להבדלים, פתח את תיבת הדו לרכישת תוכנת דימות ובחר בתיבת הסימון [למדא] (איור 2).
הערה: עבור הדמיה של 13 שעות בזמן, יש להשתמש בערוץ ניגודיות-שלב. - בחר [למדא] כרטיסיה | [תצורה אופטית] ובחר [10x DIC] עבור ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית ו [gfp-R] עבור תיבת הסימון של מסנן זריחה ירוק. מתחת ל [למדא] | העמודה [פוקוס] , בחר בתיבת הסימון [10x DIC] כדי להגדיר כהפניית המוקד.
- פתח את תיבת הדו רכישת תוכנת דימות ולחץ על לחצן [XYZ Time...] ובחר בכרטיסיה [XY] .
- מעבר לנקודת הרכישה של התמונה באמצעות ג'ויסטיק על הבמה המונעת בעת בדיקת התמונה החיה או בחר מיקום אחר דרך העיניים. לאחר מכן לחץ על תיבת הסימון תחת העמודה [שם נקודה] כדי להגדיר כל נקודה בכל מיקום עבור לכידת תמונה (ראה איור 3).
הערה: השלב האוטומטי מאפשר רכישת תמונה מרובת נקודות של קואורדינטות XY שונות כדי ללכוד שדות מרובים. - כוונן את המוקד עבור כל דוגמה המוצגת על המסך. השתמש בפקדים בתיקון מיקוד אוטומטי.
- השתמש בתוכנה כדי להגדיר לכידת תמונה בזמן הקפיצה. בתיבת הדו רכישת תוכנת דימות, בדוק את הכרטיסיה [שעה] (ראה איור 4).
- קבע את [מרווח] (ההשהיה בין תחילת נקודת זמן אחת לנקודת זמן אחרת) ו- [משך] (משך הזמן הכולל של הניסוי). יחידות זמן משתנות וניתן לבחור באלפיות שניה (אלפיות שנייה), בשניות, בדקות (m) או בשעות (h) מהתפריט הנפתח.
הערה: משך תקופת ההדמיה עבור הדמיה בזמן ההדמיה של הקרינה הפלואורסצנטית ו-DIC הזמן לרכישה רב-ערוצית עשוי להשתנות בהתאם לצבע הפלורסנט המשמש באותו מיקום. הלבנה עלולה להתרחש אם התאים המסומנים בתווית חשופים במשך זמן רב מדי. - בדוק את תיבת הסימון [שמור לקובץ] כדי לשמור תמונות שנרכשו. תחת הכרטיסייה [תזמון זמן] , לחץ על הלחצן [הפעל כעת] כדי לרכוש תמונות מסדרת זמן מרובה נקודות (ראה איור 5).
הערה: בתוכנת הדימות, תמונות נשמרות בתבנית קובץ nd2. כל השגות בנפרד יכולה להישמר באופן אינדיבידואלי בתבנית קובץ MP4 מאוחר יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזמן לשגות דו מימדי (2D) התמונות של מודל התרבית של העכבר 4T1 הפטמות קרצינומה של שורות התא להראות את התאים 4T1 להיות נבלע על ידי מקרופאגים M1 במהלך 13 h תקופה. חשוב להבטיח פולריזציה מלאה של מקרופאגים M1 על ידי ביצוע כתמים חיסוני. התוצאות (איור 1) להראות כי הריכוז של 100 Ng/ml ליפופוליסכולידים (lps) ו 20 Ng/ML ifn-γ מקוטב RAW 264.7 מקרופאגים למצב M1. מתייג את התאים המיועדים עם צבע פלורסנט ומשאיר את התאים שאינם מוכתמים בדיו מאפשר מודל חי של התרבות התאית (סרט 1). במהלך 13 h ו 15 דקות מרווח, הפעילות phagocytic של מקרופאגים M1 בתרבות coculture עם התאים 4T1 תועדו (סרט 2). ששת קטעי וידאו נקודתי (A -F בסרט 2) נרשמו כדי להעריך אירועים מרובים בתוך אחת 35 מ"מ זכוכית למטה הדמיה הצלחת. סרט 3 מראה את התאים 4T1 phagocytosed על ידי מקרופאגים M1. הסרט 4 נבחר כדוגמה וידאו מעמיק שצולם מן הניסוי הזה והסרט 5 מראה את ספיגת התאים 4t1 על ידי מקרופאגים M1.
איור 1: Immunofluorescence כתמים עם anti-iNOS-FITC בירוק, הגרעין סמן DAPI בכחול, וגרסאות משופרות של תמונות ממוזגות. פאנלים אלה מייצגים RAW 264.7 מקרופאגים (שליטה) ו מקרופאגים M1 (LPS ו-IFN-γ מגורה) חיסוני עם anti-iNOS-FITC (סמן M1) ירוק ומוכתם עם סמן גרעינים, DAPI בכחול. (א) dapiהכתםניתן להבחין הן RAW 264.7 ו מקרופאגים M1. (ב) Anti-iNOS-fitc (ירוק) רק זרוח לבד על מקרופאגים M1. (ג) תמונות ממוזגות של כתם dapi ו Anti-INOS-fitc. סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת רכישת תמונות של קרינה פלואורסצנטית ו-DIC בבקרת תיבת הדו של רכישת תוכנת דימות. [1] בחר את תיבת הסימון [למדא] , [2] בחר [תצורה אופטית] ובחר [10X DIC] ו [gfp-R] עבור תיבת הסימון של מסנן זריחה ירוקה, [3] בחר [10x dic] | [הגדר ערוץ זה כהפניית המוקד]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרת רכישת תמונות מרובת נקודות בבקרת הדיאלוג של רכישת תוכנת דימות. [4] בחר את הכרטיסייה [XY] והבאה [5] בחר את תיבת הסימון תחת העמודה [שם נקודה] כדי להגדיר כל נקודה עבור לכידת התמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הגדרת מרווחי זמן ומשך ללכידת תמונת מדידה של השעה. פקד תיבת הדו של רכישת תוכנת הדימות כדי להגדיר לכידת תמונה שמעידה על הזמן. כדי להגדיר את רכישת התמונות בזמן הקצוב [6] בדוק את הכרטיסיה [שעה] , [7] לקבוע את [מרווח ] (לפי שניה, דקות או שעה) ו [8] [משך] (בשניות, דקות או שעה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הגדרת לוחות סרט רב-שכבתי ללכידת תמונת מדידה בזמן הקפיצה. התצוגה המקדימה של שש לוחות סרטים נקודתי בשילוב לאחר השלמת 13 h של התרבות הcoculture אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
סרט 1: סרט מייצג של מקרופאגים בלתי מוכתמים M1 ו 4T1 CFSE מוכתם בתאי קרצינומה של הפטמות של החלב בתרבות coculture שנתפסו באמצעות רכישת רב-ערוצי של פלורסנט ו-DIC מיקרוסקופ. תוצאות ממציגים CFSE בקיר התא המסומן ירוק של 4T1 עכבר קרצינומה של הפטמות תאים עם מקרופאגים בלתי מוכתמים M1. תמונות הזמן שהושגו נרכשו לתקופה של 13 שעות התרבות עם 15 מרווחי זמן באמצעות רכישת רב-ערוצי (שלב 7.3, ראה איור 2). (א) הפרעה דיפרנציאלית ניגודיות, (העיגולהאדום) מראה קטן, מקרופאגים מסביב M1 הקפדה על תאים 4T1, אשר יש מורפולוגיה אפיתל. (ב) תמונה מיקרוסקופית הפלואורסצנטית של תאים 4T1 מוכתם cfse לפני phagocyציטוזה על ידי מקרופאגים. (ג) ממוזג ותמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של cfse מוכתם 4T1 תאים המובלע על ידי מקרופאגים בלתי מוכתמים M1. החצים כחולים להראות בלתי מוכתם M1 מקרופאגים בירוק כאשר הם מונסום CFSE מתויג תאים 4T1. סרגל בקנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
סרט 2: לחיות תא סרטים מיקרוסקופית וידאו מנקודות שלב מרובים בצלחת הדמיה אחת מראה phagocyציטוזה של תאים 4T1 עכבר קרצינומה של הפטמות על ידי המושרה מקרופאגים M1. התוצאות מייצגות שש נקודות שונות (סרט 2 א-ל) שהוגדרו ומתואמים באמצעות תוכנת דימות (שלב 7.4, ראה איור 3-איור 5). מקרופאגים M1 יש חריג, מורפולוגיה כמו פנקייק עם ציטופלסמה נקבובי, ואילו 4T1 החלב קרצינומה של העכבר יש מורפולוגיה אפיתל. מקרופאגים M1 ו 4T1 תאים היו מתורבתים עבור 13 h בתוך החממה בשלב ב 37 ° c עם 5% CO2 לפני שנצפו עבור מיקרוסקופ וידאו בתאים חיים. תמונות נתפסו 15 דקות במרווחי זמן עבור 13 h. סרגל סרגל = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
סרט 3: לחיות תא סרט מיקרוסקופ וידאו של נקודת קואורדינטות אחת (ראה סרט 2) נבחר להראות את phagocyציטוזה של העכבר 4t1 קרצינומות החלב על ידי המושרה מקרופאגים M1 בפירוט. החץ האדום מראה פאיגוציטוזה. העיגול הצהוב מראה כי מספר התאים 4T1 שהקיפו את הבהיקות של תאים 4T1. סרגל בקנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
סרט 4: וידאו מפורט כדי להמחיש עוד יותר את תהליך phagocyציטוזה של 4T1 תאים על ידי מקרופאגים M1. פאנל זה מציג לחיות M1 מקרופאג תאים עם ציטופלסמה נקבובי מושגים. סרגל בקנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
סרט 5: מקרופאגים נעים לכיוון תאים 4t1 כדי ליצור קשר תא אל התא, ואחריו ספיגת התאים 4t1 על ידי מקרופאגים M1 (ראה סרט 2a). הזמן המיקרוסקופיה בשלב הניגודיות וידאו היה התמונה בתוך 15 מרווחי זמן מינימום עבור 13 h של התרבות הקובית ב חממה השלב העליון ב 37 ° c עם 5% CO2. סרגל בקנה מידה = 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר דורש שני שלבים: 1) התרבות הcoculture של 4T1 תאים קרצינומה של החלב של העכבר ו-M1 מקוטב, ו 2) הערכה של פעילות מקרופאג phagocytic באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. התרבות התאית לחיות היא בשימוש נרחב phagocyציטוזה הגירה assays. מודל התרבות של התאים החיים כאן הוא פשוט, הליך מחוץ ליכולת הסתגלות (איור 2) העושה שימוש בצבע פלורסנט, cfse, המשמש לתווית התאים הייעודיים 4T1. הדבר משמש למעקב נאות של סוגי התאים במהלך הדמיה של תא חי. זמן-פקיעה הדמיה לחיות-cell שימש כדי להעריך את הפעילות phagocytic של M1 מקרופאגים באמצעות מרובת נקודות זמן הדמיה 2D לפני 13 h של התרבות הקוטית.
מודל התרבות התאית לחיות הוקם באמצעות מקרופאגים של העכבר בגובה 4T1 ו-M1. כדי להבדיל בין התאים אחד לשני, תאים 4T1 היו מוכתמים באמצעות צבע פלורסנט CFSE (ראה סעיף 4). CFSE מאפשר מעקב אחר התאים וניטור החטיבה התא. CFSE יכול פסיבי לפזר לתוך תאים, מה שהופך CFSE מכתים מעקב תאים מתאים כדי להמחיש phagocyציטוזה של תאים ייעודיים. כמו מקרופאגים phagocytic לעכל ומפרץ סרטן התאים, הם לוקחים את הצבע cfse ובסופו של דבר להפוך פלורסנט12,13. זה חיוני הזרע 4T1 תאים בצלחת הדמיה לפני מקרופאגים M1. זאת בשל הגדלים והצורות השונים של שני התאים. התאים 4T1 יש מורפולוגיה אפיתל ההתרבות באשכולות קטנים. גם, התאים 4T1 חייב להיות מוכתם CFSE לפני התרבות עם מקרופאגים בלתי מוכתמים M1. לפני מקרופאג קיטוב באמצעות lps ו ifn-γ, מקרופאגים RAW 264.7 הם עגולים, קטנים, ובדרך כלל לגדול כמו תאים בודדים. לאחר lps ו-ifn-γ polarization המושרה מקרופאגים M1 יש שיטוח יחסית, הצורה פנקייק, עם ציטופלסמה נקבובי14,15. כדי להבטיח את הקיטוב הנכון של RAW 264.7 לכיוון מדינת M1, 100 ng/mL LPS ו 20 ng/mL IFN-γ מקרופאגים היו מוכתמים חיסוני עם סמן M1, נוגדן anti-iNOS מצופני FITC (איור 1). פרוטוקול זה מבוצע לפני coculturing מקרופאגים ואת התאים ממוקד כדי להבטיח כי מקרופאגים הם מקוטב לחלוטין למצב M1.
מחקר זה מתאר שיטה עבור מיקרוסקופ פלורסנט להמחיש את הפעילות phagocytic של מקרופאגים חיים. כדי למזער את הלבנת הצבע ולספק הדמיה פלואורסצנטית טובה יותר, מיקרוסקופ פלורסנט יכול להיות משולב עם טכניקות דימות אחרות, כי הם גמישה ל fluorochrome, דומה ל-DIC. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את החומרים ואת השיטות הדרושות להערכת phagocyציטוזה של תאים קרצינומה של הפטמות של העכבר על ידי LPS ו-IFN-γ גירוי מקרופאגים באמצעות פלורסנט ו-DIC מיקרוסקופ זמן לשגות. עם זאת, לימודי פלורסנט המיקרוסקופיה יש מגבלות כאשר לימוד הדמיה של תא חי לעומת הדמיה של זמן ניגודיות פאזה. במהלך הדמיה של הניאון בשידור חי, חשיפה ממושכת לכמות גבוהה של אור עירור יכול לגרום נזק תא רציני16. Photobleaching לבנה יכולה לגרום לבעיות משמעותיות בהדמיית תא חי. התאורה בעוצמה גבוהה בשימוש הדמיה תא חי יכול להפחית את היכולת של הצבע CFSE לפלואורואור. עם זאת, הערכה 13 h phagocyציטוזה הושגה בחלק השני של מחקר זה באמצעות הדמיה דו-ממדית בשלב הזמן-חדות (סרטים 2 – 5).
מיקרוסקופיה בזמן הקפיצה מציעה יתרונות כגון יצירת נתונים מניסוי בודד בכל נקודת זמן במהלך תקופת המשך הרצויה ובאופן משמעותי, נקודות שלב מרובות בתוך צלחת הדמיה אחת ניתן ללכוד לניסוי אחד. הדבר מאפשר התבוננות בתנוחות שונות בניסוי אחד. ניתן להשתמש בפרוטוקול גם באמצעות מספר בארות מלוחות התרבות (למשל, 6, 24, 96 צלחות). בין האתגרים הטכניים הקריטיים ביותר לביצוע ניסוי הדמיה מוצלח של תא חי כולל שמירה על התאים במצב בריא על-ידי שימוש בחממה ברמה העליונה כדי לספק טמפרטורה יציבה של 37 ° c, 95% של לחות, ו 5% CO2. בגלל הניסוי לקח 13 h, להבטיח כי המיקרוסקופ פונקציות בדרך כלל ברחבי היה קריטי.
במהלך מחקר זה, שישה נקודות שונות בצלחת ההדמיה נתפסו לאורך 13 h משך עבור 15 דקות מרווחי לנקודה (סרט 2). ניתן לכוונן את הנקודות בהתאם למקרה של תא בחקירה. בהתחשב בכך יש נקודות מרובות הבמה להילכד במהלך הניסוי הזה, משמעותי כדי לוודא כי בכל נקודה יש מוקד יציב לפני ביצוע הקלטת וידאו בשידור חי. יש למטב את מרווח הזמן עבור החקירה. למרווח זמן מופחת יהיו נקודות מפורטות יותר שניתן לדימות; עם זאת, גודל הקובץ יהיה גדול מאוד. הגדלת מרווח הזמן תגרום וידאו ארוך יהפוך את הסרט לאבד המשכיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו הייתה ממומנת כלכלית על ידי Geran Putra Berimpak (GBP), אוניברסיטי פוטרה מלזיה: 9542800. אנחנו רוצים להודות למעבדות אגרו-ביוטכנולוגיה, מלזיה (ABI) מעבדות, ומתקן הדמיה מיקרוסקופית. תודות מיוחדות לוהד דניאל עזים לקבלת עזרה בעריכה והקלטה של הסרטון הניסיוני לעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
