Summary
Macrofaag fagocytische activiteit tegen kankercellen, in het bijzonder 4T1 muis borstklier carcinoom cellen, werd afgebeeld in deze studie. Het cocultuurmodel van de levende cellen werd vastgesteld en waargenomen met behulp van een combinatie van fluorescerende en differentiële interferentie contrast microscopie. Deze beoordeling is gemaakt met behulp van imaging software om multipoint time-lapse-video te ontwikkelen.
Abstract
Tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) zijn geïdentificeerd als een belangrijk onderdeel voor tumorgroei, invasie, metastase, en resistentie tegen kankertherapieën. Echter, tumor-geassocieerde macrofagen kunnen schadelijk zijn voor de tumor afhankelijk van de tumor micro omgeving en kunnen reversibel veranderen hun fenotypische kenmerken door ofwel van de cytotoxische activiteit van immune cellen of verbetering van de anti-tumor reactie. De moleculaire acties van macrofagen en hun interacties met tumorcellen (bijv. fagocytose) zijn niet uitvoerig bestudeerd. Daarom is de interactie tussen immune cellen (M1/M2-subtype TAM) en kankercellen in de tumor micro omgeving nu een focus van kanker immunotherapie onderzoek. In de huidige studie werd een levend celcocultuurmodel van geïnduceerde M1 macrofagen en muizen borst 4t1 carcinoom ontwikkeld om de fagocytische activiteit van macrofagen te beoordelen met behulp van een time-lapse video-functie met behulp van phase-contrast, fluorescerende en differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie. De huidige methode kan multipoint Live-celbeeldvorming van phagocytose observeren en documenteren. Fagocytose van 4T1 cellen door M1 macrofagen kan worden waargenomen met behulp van fluorescerende microscopie voordat kleuring 4T1 cellen met carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). De huidige publicatie beschrijft hoe macrofagen en tumorcellen samen te brengen in een enkele beeldvormings schotel, polariseren M1 macrofagen, en opnemen multi punt gebeurtenissen van macrofagen engulfing 4T1 cellen tijdens 13 h van coculture.
Introduction
Macrofagen zijn de eerste regel van immuun verdediging en spelen een rol bij het indelen van immuunresponsen tegen pathogenen en vreemde materialen, met inbegrip van kankercellen. Ze zijn een gespecialiseerde fagocyte die vernietigt en verlost van ongewenste deeltjes in het lichaam. Macrofagen dragen defensieve functies zoals de klaring van apoptotische cellen en micro-organismen en de werving van andere immuuncellen1. Macrofagen kunnen zich onderscheiden in twee verschillende types, M1 en m2 macrofagen, als reactie op omgevings signalen2. M1-gepolariseerde macrofagen (d.w.z. klassiek geactiveerde macrofagen) worden geactiveerd door de cytokine interferon-γ (IFN-γ) en lipopolysacchariden (LPS) en zijn betrokken bij de ontstekingsreactie, pathogeen klaring, efficiënte fagocytose en tumoricide immuniteit3,4. De m2 macrofagen zijn nauw verwant aan tumor-geassocieerde macrofagen (TAMs) en hebben anti-inflammatoire en tumor promotie-eigenschappen4.
Phagocytose, afgeleid van het Oudgrieks (phagein), wat "tot verser" betekent (kyto's), wat betekent "cel", en-ose, wat betekent "proces"5. Fagocytose is een receptor-gemedieerde proces waarbij fagocyten (waaronder macrofagen, monocyten en neutrofielen) doden en overspoelen van ziekteverwekkers, opruimen van vreemde deeltjes, en duidelijke apoptotic celpuin. Tumor-geassocieerde macrofagen (TAMS) zijn te vinden in de stroma in verschillende tumoren, met inbegrip van borstkanker, en hebben Pro-tumor functies6,7, resulterend in resistentie tegen fagocytose. Het gedetailleerde mechanisme van tumor cel fagocytose door macrofagen is nog niet begrepen.
Deze studie presenteert een tweestapsmethode: 1) 4T1 muis borstkanker cellen en M1-gepolariseerde macrofagen worden gecoculeerd, en 2) de fagocytische activiteit van de macrofagen wordt beoordeeld met behulp van Live-cel video microscopie. CFSE fluorescerende kleurstof werd gebruikt om de 4T1 muis borstkanker cellen vlekken. De vlek etiketten 4T1 cellen om ze te onderscheiden van de gecocultiveerde M1 macrofagen binnen een enkele beeldvormings schaal. RAW 264,7 macrofagen zijn gepolariseerd met LPS en IFN-γ in een M1 fenotype. Om een volledige polarisatie te waarborgen, werd immunokleuring met anti-iNOS antilichaam geconjugeerd aan FITC uitgevoerd. Vervolgens werd een multipoint-reeks timelapse-beelden verworven om meerdere gebeurtenissen te observeren, waaronder fagocytose, binnen de cocultuur.
Een beter begrip van de interacties tussen tumorcellen en macrofagen kan leiden tot mogelijke kanker immunotherapie. Live-Cell Imaging biedt een gedetailleerd beeld van cellulaire dynamiek in een real-time setting en is gebruikt voor het bestuderen van Celmigratie, fenotypische screening, apoptosis en cytotoxiciteit8,9 in neurowetenschappen, ontwikkelingsbiologie en geneesmiddelen ontdekking. Hoewel de voorgestelde tumor in deze studie borstkanker is, kan de methode ook worden toegepast op meerdere doelcellen en afzonderlijke Effector cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: secties 1 − 6 beschrijven het cocultuurmodel van 4T1 muis-borstkanker cellen en RAW 264,7 muis macrofagen. Sectie 7 beschrijft de time-lapse-beoordeling van M1 macrofagen phagocyted 4T1 cellen.
1. culturing 4T1 muis borstkanker cellen en RAW 264,7 muis macrofagen
- Ontdooien een flacon met cryogene conserven 4T1 en RAW 264,7 passage 6 cellen door zachte opwinding in een waterbad bij 37 °C of de normale groei temperatuur voor de cellijnen.
Opmerking: ontdooien moet snel worden gedaan, ongeveer binnen 2 min. Om verontreiniging te voorkomen, verwijdert u de injectieflacon uit het waterbad en ontsmet u deze door te spuiten met 70% ethanol. Om genetische drift te voorkomen, met name voor de macrofagen, gebruikt u een laag passage getal (d.w.z. minder dan 20). - Verdun de ontdooide cellen in 10 mL volledig DMEM-medium in een conische buis van 15 mL en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 600 x g om een celpellet te verkrijgen.
Opmerking: volledig DMEM-medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 200 U/mL penicillair/streptomycine, en 2 mM L-glutamine wordt gebruikt in het hele protocol. - Zuig de media voorzichtig op, hervat de cellen in 8 mL volledig medium en breng deze over in een behandelde kolf van 25 cm2 weefselcultuur. Cultuur zowel 4T1 als RAW 264,7 cellen in volledig DMEM medium bij 37 °C met 5% CO2.
Opmerking: hervat de celpellets zachtjes en voeg de celsuspensie in de kweek kolf druppel voor druppel toe om te voorkomen dat de cellen worden gedood. - Na 1 week van het kweken om de celhechting toe te staan, controleert u de kolf dagelijks en voegt u indien nodig 8 mL volledig DMEM-medium toe.
2. immunokleuring van M1 gepolariseerde RAW 264,7 macrofagen
- Aangezien de confluentie van RAW 264,7-cellen 70 − 80% bereikt, gooi de kweekmedia weg en spoel 2x met ten minste 2 mL PBS voorzichtig af.
Opmerking: voordat u ruwe 264,7 cellen zaaien, zorg ervoor dat er geen celdifferentiatie heeft plaatsgevonden (dat wil zeggen, dendriet-achtige fenotype en/of verhoogde celgrootte). Als celmorfologie veranderingen zichtbaar zijn, gooi dan de cultuur weg en ontdooi een nieuwe cellijn uit de eerdere passage flacon. - Bereid de macrofagen voor om te verzamelen door de aanhandige cellen zachtjes af te zetten met behulp van een celscraper en breng ze over in een conische buis van 15 mL.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bereid een celsuspensie van 1 x 105 cellen/schotel met behulp van volledige DMEM medium.
- Zaad 2 mL van de macrofagen suspensie in twee beeldvormings gerechten. Inbroed de cellen 2 − 3 uur bij 37 °C met 5% CO2 om celhechting mogelijk te maken.
- Bereid M1-polarisatie media door 100 ng/mL LPS en 20 ng/mL IFN-γ toe te voegen in volledige DMEM-medium10,11.
- Gooi de cultuur supernatant weg van de macrofagen en was de monolagen voorzichtig in de schaal 2x met ten minste 1 ml PBS.
- Voeg 2 mL M1-polarisatie media toe aan een van de beeldvormings schalen, laat de ruwe 264,7-cellen het M1 macrofaag fenotype induceren en bebroed 2 – 3 uur bij 37 °C met 5% CO2.
Opmerking: zaad RAW 264,7 macrofagen in een beeldvormings schaal met DMEM aangevuld met 10% FBS als controle voor de anti-iNOS antilichaam kleuring. Label de beeldvormings schalen RAW (Control) en M1 macrofagen (LPS en IFN-γ gepolariseerd), respectievelijk. - Vóór de immunokleuring, Fixeer de ruwe 264,7 en M1 macrofagen cellen met 2 mL 4% Paraformaldehyde en incuberen gedurende 15 minuten bij 37 °C (kamertemperatuur, RT).
- Verwijder de supernatant en was de celmonolaag met 1 mL PBS ten minste 3x.
- Quench met 2 mL 50 mM ammoniumchloride in PBS en inincuberen gedurende 15 minuten bij RT.
- Permeabilize met 2 mL 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten bij RT.
- Verwijder de supernatant en was de celmonolaag met 1 mL PBS ten minste 3x.
- Blokkeren met 2 mL 10% FBS in PBS gedurende 30 min bij RT.
Opmerking: de blokkerende stap in de immunokleuring is om de niet-specifieke binding van antilichamen in de cel te minimaliseren. - Verwijder de supernatant en was de celmonolaag met 1 mL PBS ten minste 3x.
- Inincuberen met 2 mL anti-iNOS-FITC in PBS en 1% FBS 's nachts bij 4 °C.
Opmerking: label de cellen met behulp van de juiste antilichaam verdunning volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bescherm de gerechten tegen licht door ze vanaf dit punt met aluminiumfolie te bedekken. - Verwijder de supernatant en was de celmonolaag met 1 mL PBS ten minste 3x.
- Inincuberen 1 mL 300 nM 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) in beeldvormings gerechten gedurende 10 minuten bij 37 °C, in het donker door bekleding met aluminiumfolie.
- Spoel cellen met 1 mL PBS ten minste 3x en voeg 1 mL compleet DMEM medium toe aan de beeldvormings schalen.
Opmerking: de cellen zijn nu klaar voor fluorescentie Imaging. De Microscoop-Setup heeft een omgekeerde fase en excitatie filters nodig voor de gekozen vlekken (in dit geval FITC en DAPI). - Schakel de Microscoop in en laad de beeldvormings software. Monteer de beeldvormings schaal op de Microscoop en pas de focus aan om ruwe 264,7 en M1 macrofagen te observeren. Optimaliseer het uiterlijk van fase-contrast FITC-en DAPI-afbeeldingen door het verzonden licht en de belichtingstijden aan te passen.
Opmerking: begin met Imaging wanneer alle punten scherp zijn en de kanalen zijn geoptimaliseerd. - Capture phase-contrast FITC-en DAPI-afbeeldingen (afbeelding 1).
3. seeding 4T1 muis borstkanker cellen
- Aangezien de confluentie van 4T1-cellen 70 − 80% bereikt, gooi de kweekmedia weg en spoel 2x met ten minste 2 mL PBS voorzichtig af. Voeg 1 mL voorverwarmde trypsine toe om de cellen te ontkoppelen en tot 20 minuten te ingraven bij 37 °C.
Opmerking: observeer de cellen onder een microscoop. Losgekoppelde cellen worden afgerond. - Nadat de cellen zijn losgekoppeld, breng ze over naar een conische buis van 15 mL en voeg 2 mL voorverwarmde complete DMEM-medium toe om de trypsine te deactiveren. Dispergeer het medium zachtjes door het oppervlak van de cellaag te pipetteren om de cellen te herstellen. Centrifugeer vervolgens op 600 x g gedurende 5 minuten om een celpellet te verkrijgen.
- Verwijder de supernatant en rebreng de pellet in 10 mL voorverwarmde complete DMEM medium.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en zaad 1 x 105 4t1 cellen in 2 ml volledig DMEM medium in elk van 2 35 mm glazen bodem beeldvormings gerechten behandeld met weefselcultuur. Incuberen de cellen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2.
Opmerking: Cultuur 4T1 cellen in een van de beeldvormings gerechten met M1 polarisatie media en label 4t1-Inducer (Control). Dit is om te zorgen voor een normale groei van 4T1 cellen bij blootstelling aan de inductoren.
4. labeling levende 4T1 muis borstkanker cellen met behulp van CFSE kleuring
- Verwijder eerst de bestaande media uit de 4T1 cellen Imaging gerechten. Was de celmonolayer minimaal 2x met 1 mL PBS.
- Bereid 5 μM CFSE-kleurings oplossing voor door CFSE in 1 mL PBS te verdunen. Voeg 1 mL CFSE-kleurings oplossing van 5 μM toe aan elke beeldvormings schaal en inincuberen de cellen gedurende 20 minuten bij RT of 37 °C, in het donker.
Opmerking: label de cellen met behulp van geschikte CFSE werkconcentratie volgens de aanbevelingen van de fabrikant en voorbereidende experimenten om de optimale CFSE-kleurings concentratie te verkrijgen. Etiketteer efficiëntie zal hoger zijn als CFSE wordt verdund in PBS. - Quencheer de kleuring door een gelijk volume volledig DMEM-medium met 10% FBS en kleurings oplossing aan de cellen toe te voegen en gedurende 5 minuten bij RT in het donker te inbroed.
- Gooi de CFSE-bevattende oplossing weg en was de cellen 1x met een gelijk volume aan cultuur media.
Opmerking: 4T1-cellen zijn nu fluorescentend gelabeld. - Retourneer de 4T1-CFSE-cellen aan de standaardcultuur condities bij RT met 5% CO2.
5. seeding RAW 264,7 muis macrofagen en coculture met 4T1
- Als de confluentie van RAW 264,7 70 − 80% bereikt, gooi je de kweekmedia weg en spoel je 2x met minstens 2 mL PBS voorzichtig af.
- Bereid de macrofagen voor om te verzamelen door de aanhandige cellen zachtjes af te zetten met behulp van een celscraper en breng ze over in een conische buis van 15 mL.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en bereid een celsuspensie van 1 x 105 cellen/ml voor door de resterende oplossing te verdunen met een volledig DMEM-medium volgens de zaaien dichtheid.
Opmerking: te confluente cellen in coculturen kunnen de fagocytose ernstig verminderen. In deze studie, de zaaien ratio van macrofagen: kankercellen werd aangepast aan een 1:1 ratio. De verhouding kan worden aangepast afhankelijk van de agressiviteit van de tumorcellen en de oorsprong van de macrofagen. - Gooi vóór het coculeren de kweek supernatant uit de 4t1-cellen die een dag eerder zijn geseerd (stap 4,5) en spoel de monolagen voorzichtig 2x met ten minste 1 ml PBS.
- Zaad 1 x 105 rauwe 264,7 cellen per 2 ml volledig DMEM medium in een van de 4T1 Imaging gerechten. Inbroed de cellen 2 − 3 uur bij 37 °C met 5% CO2 om celhechting mogelijk te maken. Label het beeld gerecht 4T1-M1 coculture.
Opmerking: de 4T1 (Control) cellen werden niet gecocultureerd met macrofagen.
6. M1 polarisatie van RAW 264,7 macrofagen
- Bereid M1-polarisatie media door 100 ng/mL LPS en 20 ng/mL IFN-γ toe te voegen aan het volledige DMEM-medium, aangevuld met 10% (v/v) FBS10,11.
- Gooi de cultuur supernatant weg uit de macrofagen die eerder zijn geïncubeerd (stap 5,5) en was de monolagen voorzichtig in de schaal 2x met ten minste 1 ml PBS.
- Voeg vervolgens 2 mL M1-polarisatie media toe aan de beeldvormings schaal en laat de ruwe 264,7-cellen in het M1 macrofaag fenotype induceren door bij 37 °C te broed met 5% CO2.
Opmerking: M1 macrofaag cellen kunnen 2 − 3 uur incubatie innemen om volledige polarisatie te bereiken. Voorbereidende experimenten moeten worden uitgevoerd om de geschikte incubatietijd te garanderen, zodat de volledige polarisatie van macrofagen mogelijk is.
7. Live-Cell Video microscopie van fagocytose
Opmerking: veel factoren moeten worden overwogen bij het uitvoeren van Live-celbeeldvorming om een overgelegd bare video te verkrijgen, inclusief optimalisatie van beeldbelichting, tijdsmeting en automatische focus correctie.
- Voor het experiment, zet de cel cultuur incubator door het inschakelen van thermostaat op 37 ° c en het leveren van 5% CO2.
Opmerking: de Microscoop-installatie vereist een omgekeerde fase, een fase topincubator, vochtigheidscontrole (95%) en een gasincubatie systeem. Deze instelling is van cruciaal belang voor het onderhouden van de cellen voor lange termijn Live-Cell Video microscopie beoordeling. - Schakel de Microscoop in, inclusief de piëzo-fase, en laad de Microscoop beeldvormings software.
- Plaats de geseede cocultuurcellen in een 35 mm glasbodem beeldvormings schaal in het midden van het podium en schroef de bovenste kamer voorzichtig op. Gebruik de joystick om het podium te motoriseren door de positie te selecteren die moet worden gefotografeerd.
- Als u het voorbeeld wilt weergeven, selecteert u het filter voor fase-contrast op de revolver. Nadat u het voorbeeld in eerste instantie hebt bekeken, zoekt u de juiste velden en brengt u het monster scherp.
Opmerking: imaging software maakt gebruik van volledig geautomatiseerde objectieve selectie, perfect focus systeem, time-lapse Series, multichannel Image Acquisition en multipoint Image Acquisition. - Als u meerkanaals fluorescentie wilt instellen voor CFSE-labeling en differentiële interferentie-contrast verwerving, opent u het dialoogvenster Imaging Software Acquisition en selecteert u het selectievakje [lambda] (afbeelding 2).
Opmerking: voor een time-lapse-beeldweergave van 13 uur moet een fase-contrast kanaal worden gebruikt. - Selecteer het tabblad [lambda] | [Optische configuratie] en selecteer [10x dic] voor differentieel interferentie contrast en [GFP-R] voor het groene fluorescentie filter aankruisvak. Onder de [lambda] | [Focus] kolom, selecteer de [10x dic] checkbox om in te stellen als de focus verwijzing.
- Open het dialoogvenster Imaging Software Acquisition en klik op de knop [xyz time...] en selecteer het tabblad [XY] .
- Ga naar het beeld verwervings punt met behulp van de joystick op het gemotoriseerde podium tijdens het controleren van het live-beeld of selecteer een andere positie via de oepieces. Klik vervolgens op het selectievakje onder de kolom [punt naam] om elk punt op elke locatie in te stellen voor het vastleggen van afbeeldingen (Zie afbeelding 3).
Opmerking: de geautomatiseerde fase maakt multipoint-beeld verwerving van verschillende XY-coördinaten mogelijk om meerdere velden vast te leggen. - Stel de focus nauwkeurig af voor elk beeld dat op het scherm wordt bekeken. Gebruik de besturingselementen voor auto focus correctie.
- Gebruik de software om het vastleggen van timelapse-beelden in te stellen. Controleer in het dialoogvenster Imaging Software Acquisition het tabblad [tijd] (Zie afbeelding 4).
- Bepaal het [interval] (de vertraging tussen het begin van een tijdpunt naar een ander tijdstip) en [duur] (de totale tijdsduur van het experiment). Tijdseenheden variëren en kunnen worden geselecteerd in milliseconden (MS), seconden (s), minuten (m) of uren (h) in het vervolgkeuzemenu.
Opmerking: de lengte van de beeldvormings periode voor timelapse-beeldvorming van fluorescentie en DIC time-lapse meerkanaals acquisitie kan variëren, afhankelijk van de fluorescerende kleurstof die in deze test wordt gebruikt. Fotobleaching kan optreden als de gelabelde cellen te lang worden blootgesteld. - Vink het selectievakje [opslaan naar bestand] aan om verworven afbeeldingen op te slaan. Klik onder het tabblad [tijdschema] op de knop [nu uitvoeren] om multipoint time series-afbeeldingen te verkrijgen (Zie afbeelding 5).
Opmerking: in de imaging software worden afbeeldingen opgeslagen in ND2 bestandsformaat. Elke time-lapse kan later afzonderlijk worden opgeslagen in een MP4-bestandsindeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De time-lapse tweedimensionale (2D) beelden van het cocultuurmodel van 4T1 muis borstkanker cellijnen tonen de 4T1 cellen die worden overspoeld door M1 macrofagen gedurende een periode van 13 uur. Het is belangrijk om te zorgen voor een volledige polarisatie van de M1 macrofagen door het uitvoeren van immunokleuring. De resultaten (Figuur 1) tonen aan dat de concentratie van 100 ng/ml lipopolysacchariden (LPS) en 20 ng/ml IFN-γ gepolariseerde RAW 264,7 macrofagen in de M1 staat. Het labelen van de beoogde cellen met een fluorescerende kleurstof en het verlaten van de Effector cellen onbevlekt zorgt voor een live-cel coculture model (film 1). Gedurende het interval van 13 uur en 15 minuten werd de fagocytische activiteit van de M1 macrofagen in cocultuur met de 4T1-cellen gedocumenteerd (film 2). De zes multipoint Video's (A − F in film 2) werden opgenomen om meerdere events te beoordelen binnen een enkele 35 mm glasbodem Imaging Dish. Film 3 toont de 4T1 cellen phagocytosed door M1 macrofagen. Film 4 werd gekozen als een voorbeeld van een diepgaande video gefilmd uit dit experiment en film 5 toont de opname van 4t1 cellen door M1 macrofagen.
Figuur 1: immunofluorescentie kleuring met anti-Inos-FITC in het groen, kernen marker DAPI in het blauw, en verbeterde versies van samengevoegde afbeeldingen. Deze panelen vertegenwoordigen RAW 264,7 macrofagen (controle) en M1 macrofagen (LPS en IFN-γ gestimuleerd) immunogekleurd met anti-Inos-FITC (M1 marker) in het groen en contra gekleurd met kernen marker, DAPI in blauw. A) DAPI-vlek kan zowel RAW 264,7 als M1 macrofagen worden waargenomen. B) anti-INOS-FITC (groen) alleen fluoresceren op M1 macrofagen. C) samengevoegde afbeeldingen van DAPI-vlek en anti-INOS-FITC. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 2: fluorescentie-en dic-beeld verwerving instellen in het dialoogvenster voor het verkrijgen van imaging-software. [1] Selecteer het tabblad [lambda] , [2] Selecteer [optische configuratie] en selecteer [10x dic] en [GFP-R] voor het groene fluorescentie filter checkbox, [3] Selecteer [10x dic] | [Stel dit kanaal in als de focus verwijzing]. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 3: multipoint-installatiekopie verwerving instellen in het dialoogvenster Imaging Software Acquisition. [4] Selecteer het tabblad [XY] en volgende [5] Schakel het selectievakje onder de kolom [punt naam] in om elk punt voor de opname van de afbeelding in te stellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: instellen van intervallen en duur voor het vastleggen van de timelapse-meting. Het dialoogvenster Imaging Software Acquisition om het vastleggen van timelapse-afbeeldingen in te stellen. Voor het instellen van de time-lapse-beeld verwerving [6] Controleer op het tabblad [tijd] , [7] Bepaal de [interval] (door SEC, min of uur) en [8] de [duur] (door SEC, min, of uur). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 5: multipoint-film panelen instellen voor het vastleggen van timelapse-metingen. De preview van zes multipoint movies-panelen gecombineerd na voltooiing van 13 h van de cocultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Film 1: een representatieve film van niet-bevlekt M1 macrofagen en 4T1 CFSE-gekleurd muis borstkanker cellen in cocultuur gevangen met behulp van multichannel overname van fluorescerende en dic microscopie. Resultaten presenteren CFSE in de groen-gelabelde celwand van 4T1 muis borstkanker cellen gecoculeled met onbevlekt M1 macrofagen. De timelapse-beelden werden verworven voor een cocultuurperiode van 13 uur met 15 minuten tijdsintervallen met behulp van meerkanaals acquisitie (stap 7,3, Zie Figuur 2). A) differentieel interferentie contrast (rode cirkel) toont kleine, ronde M1 macrofagen die aan de 4T1-cellen, die een epitheel morfologie hebben, vasthouden. B) een beeld van fluorescentiemicroscopie van 4T1-cellen, gekleurd met CFSE vóór fagocytose door macrofagen. C) samengevoegde dic-en fluorescentiemicroscopie beelden van met CFSE bevlekte 4T1-cellen die worden overspoeld door onbevlekte M1 macrofagen. De blauwe pijlen tonen Onbevlekte M1 macrofagen fluorescerende groen als ze CFSE-gelabelde 4T1 cellen overspoelen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Film 2: Live-Cell Video microscopie films van meerdere podium punten in een enkele Imaging schotel met fagocytose van 4T1 muis borstkanker cellen door geïnduceerde M1 macrofagen. De resultaten vertegenwoordigen zes verschillende punten (film 2a − F) die zijn ingesteld en gecoördineerd met behulp van imaging software (stap 7,4, Zie Figuur 3−Figuur 5). M1 macrofagen hebben een onregelmatige, pannenkoek-achtige morfologie met een poreus cytoplasma, terwijl 4T1 muis borst carcinomen een epitheel morfologie hebben. M1 macrofagen en 4T1 cellen werden gedurende 13 uur in de stage incubator bij 37 ° c samen met 5% CO2 voordat ze werden geobserveerd voor Live-Cell Video microscopie. Beelden werden vastgelegd op 15 min tijdsintervallen voor 13 h. schaalbalk = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Film 3: Live-Cell Video microscopie film van een enkel coördinaat punt (Zie film 2) gekozen om de fagocytose van 4t1 muis borst carcinomen weer te geven door geïnduceerde M1 macrofagen in detail. De rode pijl toont phagocytose. De gele cirkel toont dat het aantal 4t1 cellen dat de engulfment van 4t1 cellen afgeschrikt. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Film 4: een gedetailleerde video om het fagocytose proces van 4T1 cellen verder te visualiseren door M1 macrofagen. Dit panel toont levende M1 macrofaag cellen met een poreus cytoplasma fenotype. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Film 5: macrofagen in de richting van 4t1 cellen om cel-naar-celcontact tot stand te brengen, gevolgd door de opname van 4T1 cellen door M1 macrofagen (Zie film 2a). De phase-contrast microscopie time-lapse video werd in 15 min tijdsintervallen afgebeeld voor 13 uur cocultuur binnen een podium topincubator bij 37 °C met 5% CO2. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het beschreven protocol vereist twee stappen: 1) cocultuur van 4T1 muizen-borstkanker cellen en M1-gepolariseerde macrofagen, en 2) beoordeling van de macrofaag fagocytische activiteit met behulp van timelapse-microscopie. Live Cell coculture wordt veel gebruikt in fagocytose en Migratietesten. Het Live Cell coculture model hier is een eenvoudige, aanpasbare in vitro procedure (Figuur 2) die gebruik maakt van een fluorescerende kleurstof, CFSE, die wordt gebruikt om de 4T1-doelcellen te labelen. Dit wordt gebruikt voor het correct volgen van de celtypen tijdens Live-celbeeldvorming. Time-lapse Live-Cell Imaging werd gebruikt om de fagocytische activiteit van M1 macrofagen te beoordelen met behulp van multipoint time-lapse 2D-beeldvorming vóór de 13 uur van de cocultuur.
Het cocultuurmodel van de levende cellen werd opgericht met behulp van 4T1 muis borstkanker cellen en M1 muis macrofagen. Om de cellen van elkaar te onderscheiden, werden 4T1 cellen bevlekt met behulp van een CFSE fluorescerende kleurstof (zie rubriek 4). CFSE maakt het bijhouden van de cellen en monitoring celdeling. CFSE kan passief diffuus in cellen, waardoor CFSE kleuring een geschikte cel tracker om fagocytose van gerichte cellen te visualiseren. Als fagocytische macrofagen verteren en verzwelgen kankercellen, ze nemen de CFSE kleurstof en uiteindelijk worden fluorescerende12,13. Het is essentieel om 4T1 cellen in de beeldvormings schaal voor de M1 macrofagen te laten zaad. Dit is te wijten aan de verschillende maten en vormen van beide cellen. De 4T1-cellen hebben een epitheel morfologie die in kleine clusters woert. Ook moeten de 4T1 cellen worden gekleurd met CFSE voordat cocultuur met de Onbevlekte M1 macrofagen. Voordat macrofaag polarisatie met behulp van LPS en IFN-γ, de Murine macrofagen RAW 264,7 zijn rond, klein, en meestal groeien als enkelvoudige cellen. Na LPS en IFN-γ-polarisatie hebben geïnduceerde M1-macrofagen een relatief afgevlakte, pannenkoek-achtige vorm, met een poreus cytoplasma14,15. Om een goede polarisatie van de ruwe 264,7 naar de M1-toestand te garanderen, werden 100 ng/mL LPS en 20 ng/mL IFN-γ gestimuleerd macrofagen immunogekleurd met een M1 marker, anti-iNOS antilichaam geconjugeerd aan FITC (Figuur 1). Dit protocol wordt uitgevoerd voor het coculeren van de macrofagen en de beoogde cellen om ervoor te zorgen dat de macrofagen volledig gepolariseerd zijn in de M1-toestand.
Deze studie beschrijft een methode voor fluorescerende microscopie om de fagocytische activiteit van levende macrofagen te visualiseren. Om foto bleken te minimaliseren en om een betere fluorescentie-beeldvorming te bieden, kan fluorescerende microscopie worden gecombineerd met andere beeldvormingstechnieken die niet-destructief zijn voor het fluorochrome, vergelijkbaar met DIC. Dit protocol beschrijft de materialen en methoden die nodig zijn voor de beoordeling van de fagocytose van muizen-borstkanker cellen door LPS en IFN-γ gestimuleerd macrofagen met behulp van fluorescerende en DIC time-lapse microscopie. Niettemin, fluorescerende microscopie studies hebben beperkingen bij het bestuderen van Live-cel beeldvorming in vergelijking met fase-contrast time-lapse Imaging. Tijdens fluorescerende Live-celbeeldvorming kan langdurige blootstelling aan een grote hoeveelheid excitatie licht ernstige celbeschadiging veroorzaken16. Photobleaching kan leiden tot significante problemen bij beeldvorming in levende cellen. De verlichting met hoge intensiteit die wordt gebruikt voor Live-celbeeldvorming kan het vermogen van CFSE-kleurstof tot fluoresce verminderen. Niettemin werd in het tweede deel van deze studie een 13 h fagocytose-beoordeling bereikt met behulp van phase-contrast time-lapse 2D-beeldvorming (films 2 – 5).
Time-lapse microscopie biedt voordelen zoals het genereren van gegevens uit een enkel experiment op elk gewenst moment gedurende de gewenste periode en aanzienlijk, meerdere fase punten binnen een enkele Imaging Dish kan worden vastgelegd voor een enkel experiment. Dit maakt observatie van verschillende posities in een enkel experiment mogelijk. Het protocol kan ook worden gebruikt met behulp van meerdere putjes van kweek platen (bijv. 6, 24, 96 putplaten). Een van de meest kritieke technische uitdagingen om succesvol Live-Cell Imaging experiment uit te voeren omvat het handhaven van de cellen in een gezonde conditie door gebruik te maken van een stage top incubator om een stabiele temperatuur te bieden van 37 °C, 95% van de luchtvochtigheid en 5% CO2. Omdat het experiment 13 uur duurde, was het cruciaal om ervoor te zorgen dat de Microscoop normaalgesproken overal functioneert.
Tijdens deze studie werden zes verschillende punten in de beeldvormings schaal vastgelegd gedurende een duur van 13 uur gedurende 15 min-intervallen per punt (film 2). De punten kunnen worden aangepast afhankelijk van het geval van de onderzochte cel. Aangezien er meerdere fase punten moeten worden vastgelegd tijdens dit experiment, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat elk punt een stabiele focus heeft voordat de Live-cel video-opname wordt uitgevoerd. Het tijdsinterval voor onderzoek moet worden geoptimaliseerd. Een verlaagd tijdsinterval zal meer gedetailleerde punten hebben die kunnen worden afgebeeld; de bestandsgrootte is echter zeer groot. Toenemende tijdsinterval zal resulteren in een lange video en zal de film continuïteit te verliezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel gefinancierd door Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. We willen graag het agro-biotechnologie Instituut, Maleisië (ABI) laboratoria en microscopie Imaging Facility bedanken. Speciale dank aan Mohd Daniel Hazim voor hulp bij het bewerken en opnemen van de experimentele video voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
