Summary
الضامة النشاط البالع ضد الخلايا السرطانية, علي وجه التحديد 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا, كانت في هذه الدراسة. تم تاسيس نموذج الاستزراع الخلوي الحي وملاحظته باستخدام مزيج من المجهر الفلوري وتباين التداخل التفاضلي. وكان هذا التقييم باستخدام برامج التصوير لتطوير الفيديو الفاصلة الزمنيه متعددة.
Abstract
وقد تم تحديد الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) كعنصر هام لنمو الورم ، والغزو ، الانبثاث ، والمقاومة لعلاجات السرطان. ومع ذلك ، الضامة المرتبطة بالورم يمكن ان تكون ضاره للورم اعتمادا علي البيئة المجهرية الورم ويمكن ان يغير بشكل عكسي خصائصها الظاهرية عن طريق اما معاداه النشاط السام للخلايا من الخلايا المناعية أو تعزيز الاستجابة المضادة للورم. الإجراءات الجزيئية من الضامة وتفاعلاتها مع الخلايا السرطانية (علي سبيل المثال ، كثرة الكريات) لم تدرس علي نطاق واسع. ولذلك ، فان التفاعل بين الخلايا المناعية (M1/M2-النوع الفرعي تام) والخلايا السرطانية في البيئة المجهرية الورم هو الآن بؤره البحوث العلاج المناعي للسرطان. في الدراسة الحالية ، تم تطوير نموذج الخلية الحية لزراعه الخلايا من الضامة M1 المستحثة والفئران الثديية الماوس 4T1 خليه سرطان لتقييم النشاط الضامة للبلمه باستخدام ميزه الفيديو الفاصل الزمني باستخدام التباين التدريجي ، الفلورسنت ، وتباين التداخل التفاضلي (DIC). يمكن للأسلوب الحالي مراقبه وتوثيق التصوير الخلوي الحي متعدد الخلايا لكثرة الكريات. ويمكن ملاحظه كثرة الخلايا 4T1 من قبل الضامة M1 باستخدام المجهر الفلورسنت قبل تلطيخ الخلايا 4T1 مع استر كاربوكسيفلوريسسين سكاليديديل (CFSE). يصف المنشور الحالي كيفيه زراعه الضامة والخلايا السرطانية في صحن تصوير واحد ، واستقطاب الضامة M1 ، وتسجيل الاحداث متعددة النقاط من الضامة تجتاح خلايا 4T1 خلال 13 ح من الزراعة.
Introduction
الضامة هي الخط الأول من الدفاع المناعي وتلعب دورا في الاستجابات المناعية تدبير ضد مسببات الامراض والمواد الاجنبيه ، بما في ذلك الخلايا السرطانية. فهي البويضات المتخصصة التي تدمر ويتخلص من الجزيئات غير المرغوب فيها في الجسم. الضامة تسهم وظائف دفاعيه مثل أزاله الخلايا الميتة والكائنات المجهرية وتجنيد الخلايا المناعية الأخرى1. الضامة يمكن التفريق إلى نوعين مختلفين ، M1 و M2 الضامة ، استجابه للإشارات البيئية2. يتم تنشيط M1-الضامة المستقطبة (اي ، الضامة المنشطة بشكل كلاسيكي) من قبل γ (ifn-γ) و lipopolysاكتشاريدس (lps) وتشارك في الاستجابة التهابيه ، وأزاله الممرض ، وندره المحببات الفعالة ، والمناعة المضادة للجراثيم3،4. الضامة M2 ترتبط ارتباطا وثيقا الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) ولها خصائص المضادة للالتهابات والورم تعزيز4.
الفندره ، المستمدة من اليونانية القديمة (phagocytosis) ، وهذا يعني "للتهام ،" (kytos) ، وهذا يعني "الخلية" ، و-osis ، وهذا يعني "عمليه"5. الفندره هي عمليه بوساطة مستقبلات حيث البالعات (بما في ذلك الضامة ، والخلايا الاحاديه ، والعدلات) قتل وابتلاع مسببات الامراض الغازية ، وتنظيف الجزيئات الاجنبيه ، وواضحة الحطام خليه ابوتوتيك. يتم العثور علي الضامة المرتبطة بالورم (tams) في سدي في الأورام المختلفة ، بما في ذلك سرطان الثدي ، ولها وظائف الموالية للورم6،7، مما ادي إلى مقاومه كثرة الكريات. لم يتم بعد فهم اليه المفصلة لندره الخلايا السرطانية بالضامة.
تقدم هذه الدراسة طريقه من خطوتين: 1) 4t1 الفئران سرطان الثدي الخلايا والضامة M1 الاستقطاب هي الخياطة ، و 2) يتم تقييم النشاط أكله من الضامة باستخدام المجهر الفيديو الخلية الحية. وقد استخدمت CFSE صبغ الفلورسنت لوصمه عار الخلايا سرطان الثدي 4T1. العلامات وصمه عار الخلايا 4T1 لتمييزها من الضامة M1 الخياطة داخل صحن التصوير واحد. RAW 264.7 الضامة المستقطبة مع LPS و IFN-γ إلى النمط الظاهري M1. لضمان الاستقطاب الكامل ، تم تنفيذ المناعي مع الأجسام المضادة لمكافحه النوس مترافقة مع FITC. وفي وقت لاحق ، تم الحصول علي سلسله متعددة من الصور الفاصلة الزمنيه لمراقبه الاحداث المتعددة ، بما في ذلك ندره المحببات ، داخل الاستزراع.
قد يؤدي الفهم الأفضل للتفاعلات بين الخلايا السرطانية والضامة إلى العلاج المناعي المحتمل للسرطان. تقدم التصوير بالخلايا الحية عرضا مفصلا لديناميكيات الخلايا في الوقت الحقيقي ، وقد استخدمت لدراسة هجره الخلايا ، والفحص الظاهري ، والمبرمج ، والسمية الخلوية8،9 في علم الأعصاب ، والبيولوجيا التنموية ، واكتشاف المخدرات. علي الرغم من ان الورم المقترح في هذه الدراسة هو سرطان الثدي ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة علي الخلايا المستهدفة المتعددة والخلايا المستجيبة المتميزة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظه: الأقسام 1 − 6 وصف نموذج الزراعة الثديية من خلايا الفئران سرطان الثدي 4T1 والضامة 264.7 الماوس الخام. يصف القسم 7 تقييم الفاصل الزمني للخلايا M1 الضامة 4T1 الخلايا.
1. كولتورينج 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا والضامة 264.7 الماوس الخام
- ذوبان قارورة من الديتريوم الحفاظ علي 4T1 و RAW 264.7 مرور 6 خلايا عن طريق الانفعالات لطيف في حمام مائي في 37 درجه مئوية أو درجه حرارة النمو الطبيعي لخطوط الخلايا.
ملاحظه: يجب ان يتم الذوبان بسرعة ، تقريبا في غضون 2 دقيقه. لتجنب التلوث ، وأزاله القارورة من حمام المياه وتطهيرها عن طريق الرش مع 70 ٪ الايثانول. لتجنب الانحراف الوراثي ، وخاصه بالنسبة للبلضام ، استخدم رقم مرور منخفض (اي اقل من 20). - تمييع الخلايا المذابة في 10 مل من المتوسطة DMEM كامله في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي الخلايا في 600 x g ل 5 دقيقه للحصول علي خليه بيليه.
ملاحظه: يتم استخدام المتوسطة DMEM كامله مع 10 ٪ (v/v) الجنين البقري المصل (المدفع) ، 200 U/mL البنسلين/ستربتوميسين ، و 2 مم L-الجلوتامين يستخدم في جميع انحاء البروتوكول. - يستنشق بعناية وسائل الاعلام ، وأعاده تعليق الخلايا في 8 مل من متوسطه كامله ونقلها إلى 25 سم2 الانسجه ثقافة معالجه قارورة. الثقافة علي حد سواء 4T1 و RAW 264.7 الخلايا في المتوسط DMEM كامله في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: أعاده التعليق الكريات الخلية برفق وأضافه تعليق الخلية في الثقافة القارورة قطره بواسطة قطره لتجنب قتل الخلايا. - بعد أسبوع واحد من الخياطة للسماح بالتصاق بالخلايا ، راقب القارورة يوميا وأضف 8 مل من المتوسط الكامل لل DMEM حسب الحاجة.
2. المناعية من M1 المستقطبة الخام 264.7 الضامة
- كما كونفلوينسي الخلايا RAW 264.7 تصل إلى 70 − 80 ٪ ، وتجاهل وسائل الاعلام الثقافة وشطف بلطف 2x مع ما لا يقل عن 2 مل من تلفزيوني.
ملاحظه: قبل بذر RAW 264.7 الخلايا ، تاكد من عدم وجود تمايز الخلية (اي ، النمط الظاهري مثل dendrite و/أو زيادة حجم الخلية). إذا كانت التغييرات المورفولوجية الخلية مرئية ، تجاهل الثقافة وذوبان خط خليه جديده من قارورة المرور السابقة. - اعداد الضامة لجمع عن طريق الانفصال بلطف الخلايا الملتصقة باستخدام مكشطه الخلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية واعداد تعليق خليه من 1 × 105 خلايا/طبق باستخدام المتوسطة dmem كامله.
- بذور 2 مل من تعليق الضامة في اثنين من اطباق التصوير. احتضان الخلايا 2 − 3 ح عند 37 درجه مئوية مع 5% CO2 للسماح بالتصاق بالخلايا.
- اعداد وسائل الاعلام الاستقطاب M1 عن طريق أضافه 100 ng/mL LPS و 20 ng/mL IFN-γ إلى كامل DMEM المتوسطة10,11.
- تجاهل الثقافة ماده طافي من الضامة وغسل بعناية الطبقات الاحاديه في طبق 2x مع ما لا يقل عن 1 مل من تلفزيوني.
- أضافه 2 مل من وسائل الاعلام الاستقطاب M1 في واحده من اطباق التصوير ، والسماح للخلايا 264.7 RAW للحث علي النمط الظاهري M1 الضامة ، واحتضان 2-3 ح في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: بذره RAW 264.7 الضامة في طبق التصوير مع DMEM تستكمل مع 10% سلاح كعنصر تحكم لتلطيخ الأجسام المضادة للنوس. تسميه اطباق التصوير الخام (التحكم) و M1 الضامة (LPS و ifn-γ الاستقطاب) ، علي التوالي. - قبل التحصين ، إصلاح RAW 264.7 و M1 الضامة الخلايا باستخدام 2 مل من بارافورمالدهيد 4 ٪ واحتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية (درجه حرارة الغرفة ، RT).
- أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- إخماد مع 2 مل من كلوريد الأمونيوم 50 مم في التليفزيون واحتضان لمده 15 دقيقه في RT.
- بيركابايز باستخدام 2 مل من 0.3 ٪ تريتون X-100 في الاذاعه التلفزيونية لمده 15 دقيقه في RT.
- أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- كتله باستخدام 2 مل من 10 ٪ في الاذاعه التلفزيونية لمده 30 دقيقه في RT.
ملاحظه: الخطوة المانعة في المناعي هو تقليل الربط غير محدده من الأجسام المضادة داخل الخلية. - أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- احتضان مع 2 مل من المضادة للنوس-FITC في الاذاعه التلفزيونية و 1 ٪ من بين ليله وضحيها في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: تسميه الخلايا باستخدام تخفيف الأجسام المضادة المناسبة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. حماية الاطباق من الضوء من خلال تغطيتها مع رقائق ألومنيوم من هذه النقطة علي. - أزاله ماده طافي وغسل الخلية أحاديه الطبقة مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x.
- احتضان 1 مل من 300 nM 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI) في اطباق التصوير لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية ، في الظلام من خلال تغطيه مع رقائق ألومنيوم.
- غسل الخلايا مع 1 مل من تلفزيوني علي الأقل 3x وأضافه 1 مل من المتوسطة DMEM كامله في اطباق التصوير.
ملاحظه: الخلايا جاهزه الآن للتصوير الفلوري. الاعداد المجهر سوف تحتاج إلى مرحله مقلوبه ومرشحات الاثاره للبقع المختارة (في هذه الحالة ، FITC و DAPI). - قم بتشغيل المجهر وتحميل برنامج التصوير. جبل طبق التصوير علي المجهر وضبط التركيز لمراقبه RAW 264.7 و M1 الضامة. تحسين مظهر الصور FITC و DAPI علي النقيض من المرحلة عن طريق ضبط الضوء المرسل وأوقات التعرض.
ملاحظه: بدء التصوير عندما تكون جميع النقاط في التركيز والقناات الأمثل. - التقاط صور FITC و DAPI علي النقيض من المرحلة (الشكل 1).
3. البذر 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا
- كما كونفلوينسي الخلايا 4T1 تصل إلى 70 − 80 ٪ ، وتجاهل وسائل الاعلام الثقافة وشطف بلطف 2x مع ما لا يقل عن 2 مل من تلفزيوني. أضف 1 مل من التريبسين المسخن للفصل بين الخلايا واحتضانها لمده تصل إلى 20 دقيقه عند 37 درجه مئوية.
ملاحظه: مراقبه الخلايا تحت المجهر. سيتم تقريب الخلايا المنفصلة. - مره واحده في فصل الخلايا ، نقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأضافه 2 مل من المتوسطة كامله DMEM المسبقة لتنشيط التريبسين. تفريق المتوسطة بلطف عن طريق الأنابيب سطح طبقه الخلية لاستعاده الخلايا. ثم ، جهاز الطرد المركزي في 600 x g لمده 5 دقائق للحصول علي خليه بيليه.
- أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 10 مل من المتوسطة كامله dmem الحرارة.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية والبذور 1 × 105 4t1 الخلايا في 2 مل من المتوسطة dmem كامله في كل من 2 35 mm الزجاج القاع التصوير الاطباق التعامل مع ثقافة الانسجه. احتضان الخلايا بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: الثقافة 4T1 الخلايا في واحده من الاطباق التصوير مع وسائل الاعلام الاستقطاب M1 والتسمية 4T1-الحث (السيطرة). هذا هو لضمان النمو الطبيعي للخلايا 4T1 عندما تتعرض للمحرز.
4. وضع العلامات المعيشة 4T1 الماوس الخلايا سرطان الثدي باستخدام CFSE تلطيخ
- أولا ، أزاله الوسائط الموجودة من الخلايا 4T1 التصوير الاطباق. اغسل الخلية أحاديه الطبقة علي الأقل 2x مع 1 مل من تلفزيوني.
- اعداد 5 μM من محلول تلطيخ CFSE عن طريق تمييع CFSE في 1 مل من تلفزيوني. أضافه 1 مل من محلول تلطيخ CFSE 5 μM في كل طبق التصوير واحتضان الخلايا لمده 20 دقيقه في RT أو 37 درجه مئوية ، في الظلام.
ملاحظه: تسميه الخلايا باستخدام تركيز العمل CFSE المناسبة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة والتجارب الاوليه للحصول علي تركيز التلطيخ CFSE الأمثل. ستكون كفاءه الوسم اعلي إذا تم تخفيف CFSE في الاذاعه التلفزيونية. - إخماد تلطيخ عن طريق أضافه حجم متساو من المتوسطة DMEM كامله التي تحتوي علي 10 ٪ الحل وتلطيخ للخلايا واحتضان لمده 5 دقائق في RT في الظلام.
- تجاهل الحل الذي يحتوي علي CFSE واغسل الخلايا 1x بحجم متساو من وسائط الثقافة.
ملاحظه: يتم الآن تسميه الخلايا 4T1 فلوريسسينتلي. - إرجاع الخلايا 4T1-CFSE إلى ظروف الثقافة القياسية في RT مع 5% CO2.
5. بذر RAW 264.7 الماوس الضامة والزراعة مع 4T1
- كما كونفلوينسي من RAW 264.7 الوصول إلى 70 − 80 ٪ ، وتجاهل وسائل الاعلام الثقافة وشطف بلطف 2x مع ما لا يقل عن 2 مل من تلفزيوني.
- اعداد الضامة لجمع عن طريق الانفصال بلطف الخلايا الملتصقة باستخدام مكشطه الخلية ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية واعداد تعليق خليه من 1 × 105 خلايا/مل عن طريق تمييع الحل المتبقي مع متوسط dmem كامله وفقا لكثافة البذر.
ملاحظه: الخلايا متموج بشكل مفرط في cocultures قد يقلل بشده كثرة الكريات. في هذه الدراسة ، ونسبه البذر من الضامة: تم تعديل الخلايا السرطانية إلى نسبه 1:1. ويمكن تعديل نسبه اعتمادا علي العدوانية من الخلايا السرطانية واصل الضامة. - قبل coculturing ، وتجاهل الثقافة ماده طافي من الخلايا 4t1 المصنفة في اليوم السابق (الخطوة 4.5) وغسل بعناية أحادي الطبقات 2x مع ما لا يقل عن 1 مل من تلفزيوني.
- البذور 1 × 105 264.7 الخلايا الخام لكل 2 مل من المتوسطة dmem كامله في واحده من اطباق التصوير 4T1. احتضان الخلايا 2 − 3 ح عند 37 درجه مئوية مع 5% CO2 للسماح بالتصاق بالخلايا. تسميه طبق التصوير 4T1-M1 الزراعة.
ملاحظه: كانت الخلايا 4T1 (التحكم) لا الدوس مع الضامة.
6.m1 الاستقطاب من الضامة 264.7 RAW
- اعداد وسائل الاعلام الاستقطاب M1 عن طريق أضافه 100 ng/mL LPS و 20 ng/mL IFN-γ إلى المتوسطة DMEM كامله تستكمل مع 10 ٪ (v/v) المنفذة10،11.
- تجاهل الثقافة ماده طافي من الضامة حضن قبل (الخطوة 5.5) وغسل بعناية الطبقات الاحاديه في طبق 2x مع ما لا يقل عن 1 مل من تلفزيوني.
- ثم ، أضافه 2 مل من وسائل الاعلام الاستقطاب M1 في صحن التصوير والسماح للخلايا 264.7 RAW للحث علي النمط الظاهري M1 الضامة من خلال احتضان في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2.
ملاحظه: الخلايا الضامة M1 قد يستغرق 2 − 3 h من الحضانة لتحقيق الاستقطاب الكامل. التجارب الاوليه يجب القيام به لضمان فتره الحضانة مناسبه للسماح الاستقطاب الكامل من الضامة.
7. المجهرية الفيديو الخلية الحية من كثرة الفندره
ملاحظه: هناك العديد من العوامل التي يجب مراعاتها عند تنفيذ تصوير الخلايا الحية للحصول علي فيديو قابل للإنتاج ، بما في ذلك تحسين التعرض للصورة ، وقياس الوقت ، وتصحيح التركيز التلقائي.
- قبل التجربة ، اعداد حاضنه ثقافة الخلية عن طريق تشغيل الحرارة في 37 درجه مئوية وتوريد 5 ٪ CO2.
ملاحظه: يتطلب الاعداد المجهر مرحله مقلوبه ، حاضنه اعلي المرحلة ، والتحكم في الرطوبة (95 ٪) ، ونظام حضانة الغاز. هذا الاعداد أمر بالغ الاهميه للحفاظ علي خلايا لتقييم المجهرية الفيديو الخلية الحية علي المدى الطويل. - بدوره علي المجهر بما في ذلك المرحلة بيزو وتحميل برنامج التصوير المجهر.
- ضع خلايا الزراعة المصنفة في صحن تصوير بالزجاج السفلي 35 مم في وسط المرحلة والمسمار بلطف علي الغرفة العلوية. استخدم عصا التحكم لتحريك المرحلة عن طريق تحديد الموضع الذي سيتم تصويره.
- لعرض العينة ، حدد فلتر تباين المراحل علي البرج. بعد عرض العينة في البداية ، حدد موقع الحقول المناسبة وجعل العينة في التركيز.
ملاحظه: يسمح برنامج التصوير باستخدام الاختيار الموضوعي المؤتمت بالبالكامل ، ونظام التركيز المثالي ، وسلسله الفواصل الزمنيه ، واكتساب الصور متعدد القناات ، واكتساب الصور متعددة النقاط. - لاعداد الفلورية متعددة القناات لوسم CFSE والتباين في التداخل التفاضلي ، افتح مربع الحوار اكتساب برامج التصوير وحدد خانه الاختيار [لأمدا] علامة التبويب (الشكل 2).
ملاحظه: بالنسبة للتصوير بفاصل زمني 13 ساعة ، يجب استخدام قناه تباين المراحل. - حدد علامة التبويب [لأمدا] | [التكوين البصري] وحدد [10x DIC] لتباين التداخل التفاضلي و [gfp-R] لاختيار الفلتر الفلوري الأخضر. تحت [لأمدا] | عمود [التركيز] ، حدد خانه الاختيار [10 × DIC] لتعيينها كمرجع للتركيز.
- افتح مربع الحوار اكتساب برامج التصوير وانقر فوق الزر [XY الوقت...] وحدد علامة التبويب [س ص] .
- انتقل إلى نقطه اكتساب الصور باستخدام عصا التحكم علي المرحلة اليه اثناء التحقق من الصورة الحية أو حدد موضعا مختلفا من خلال العدسات العينية. ثم انقر علي مربع الاختيار تحت العمود [اسم النقطة] لتعيين كل نقطه في كل موقع للتقاط الصور (انظر الشكل 3).
ملاحظه: تسمح المرحلة المؤتمتة بالحصول علي صوره متعددة لإحداثيات XY مختلفه للتقاط عده حقول. - اضبط التركيز لكل عينه معروضه علي الشاشة. استخدم عناصر التحكم الخاصة بتصحيح التركيز التلقائي.
- استخدم البرنامج لاعداد التقاط الصور بفواصل زمنيه. في مربع الحوار اكتساب برامج التصوير ، تحقق من علامة التبويب [الوقت] (انظر الشكل 4).
- تحديد [الفاصل الزمني] (التاخير بين بداية نقطه زمنيه واحده إلى نقطه زمنيه أخرى) و [المدة] (الطول الإجمالي للوقت الخاص بالتجربة). وحدات من الوقت تختلف ويمكن اختيارها بالمللي ثانيه (مللي ثانيه) ، ثوان (ق) ، دقائق (م) ، أو ساعات (ح) من القائمة المنسدلة.
ملاحظه: قد يختلف طول فتره التصوير للتصوير بالفاصل الزمني للمضان واكتساب القناات الفاصلة الزمنيه DIC حسب الصبغة الفلورية المستخدمة في هذا الفحص. قد يحدث الرشح الضوئي إذا تعرضت الخلايا المسمية لفتره طويلة جدا. - تحقق من خانه الاختيار [حفظ إلى ملف] لحفظ الصور المكتسبة. ضمن علامة التبويب [الجدول الزمني] ، انقر علي الزر [تشغيل الآن] للحصول علي صور متعددة السلاسل الزمنيه (انظر الشكل 5).
ملاحظه: في برنامج التصوير ، يتم حفظ الصور بتنسيق ملف nd2. يمكن حفظ كل فاصل زمني بشكل فردي بتنسيق ملف MP4 لاحقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الوقت الفاصل بين الصور ثنائيه الابعاد (2D) من نموذج الاستزراع الثديي للخطوط الخلية سرطان الثدي 4T1 تظهر الخلايا 4T1 التي اجتاحتها الضامة M1 خلال فتره 13 ح. من المهم لضمان الاستقطاب الكامل من الضامة M1 عن طريق أداء المناعي. النتائج (الشكل 1) تبين ان تركيز 100 Ng/ml lipopolysاكتشاريدس (lps) و 20 Ng/ML ifn-γ المستقطبة RAW 264.7 الضامة في الدولة M1. وسم الخلايا المستهدفة بصبغه فلورية وترك الخلايا المستجيبة غير ملطخه يسمح لنموذج الزراعة الحية الخلية (فيلم 1). في جميع انحاء 13 ساعة و 15 دقيقه الفاصل الزمني ، تم توثيق النشاط أكله من الضامة M1 في الزراعة مع الخلايا 4t1 (فيلم 2). وسجلت أشرطه الفيديو الستة متعددة النقاط (ا − F في الفيلم 2) لتقييم الاحداث المتعددة داخل واحد 35 mm الزجاج أسفل الطبق التصوير. الفيلم 3 يظهر الخلايا 4t1 مبتلع بواسطة M1 الضامة. تم اختيار فيلم 4 كمثال علي الفيديو في العمق تصويرها من هذه التجربة والفيلم 5 يظهر امتصاص الخلايا 4t1 بالضامة M1.
الشكل 1: تلطيخ المناعي مع المضادة للنوس-FITC في الأخضر ، النوى علامة DAPI باللون الأزرق ، والإصدارات المحسنة من الصور المدمجة. هذه اللوحات تمثل RAW 264.7 الضامة (السيطرة) و M1 الضامة (LPS و IFN-γ حفز) مناعية مع مضاده للنوس-FITC (علامة M1) في الأخضر والملطخة مع علامة نوى ، DAPI باللون الأزرق. (ا) يمكن ملاحظه وصمه عار dapi علي حد سواء RAW 264.7 و M1 الضامة. (B) المضادة للنوس-fitc (الأخضر) فقط يتالق علي الضامة M1. (ج) الصور المدمجة لوصمه العار dapi والمضادة للنوس-fitc. شريط مقياس = 50 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: اعداد الصورة الفلورية واكتساب الصور DIC في عنصر تحكم الحوار الحصول علي برامج التصوير. [1] حدد خانه الاختيار [لأمدا] علامة التبويب ، [2] حدد [التكوين البصري] وحدد [10X DIC] و [gfp-R] لمرشح الفلورية الخضراء ، [3] حدد [10x dic] | [تعيين هذه القناة كمرجع التركيز]. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اعداد اكتساب الصور متعددة النقاط في عنصر تحكم الحوار الحصول علي برنامج التصوير. [4] حدد علامة التبويب [XY] والتالي [5] حدد خانه الاختيار تحت العمود [اسم النقطة] لتعيين كل نقطه للتقاط الصورة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: اعداد الفواصل الزمنيه والمدة للتقاط صوره قياس الفاصل الزمني. عنصر تحكم الحوار اكتساب برنامج التصوير لاعداد التقاط الصور الفاصلة الزمنيه. لاعداد الحصول علي صوره الفاصل الزمني [6] تحقق من علامة التبويب [time] ، [7] حدد [الفاصل الزمني] (بالثواني أو الدقيقة أو الساعة) و [ 8] [ المدة] (بالثواني أو الدقيقة أو الساعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: اعداد لوحات الأفلام متعددة النقاط للتقاط صور قياس الفاصل الزمني. معاينه سته لوحات الأفلام متعددة النقاط مجتمعه بعد الانتهاء من 13 ساعة من الزراعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
فيلم 1: فيلم تمثيلي من الضامة M1 غير ملون و 4T1 CFSE الملونة الفئران سرطان الثدي الخلايا في الزراعة التي تم الاستيلاء عليها باستخدام القناات المتعددة من الفلورسنت والمجهر DIC. النتائج عرض CFSE في جدار الخلية الأخضر المسمي من الخلايا سرطان الثدي 4T1 الثديية مع الضامة M1 غير ملون. تم الحصول علي الصور الفاصلة الزمنيه لمده 13 ساعة من الزراعة مع فترات زمنيه 15 دقيقه باستخدام الاستحواذ متعدد القناات (الخطوة 7.3 ، انظر الشكل 2). (ا) تباين التداخل التفاضلي ، (الدائرة الحمراء) يظهر الضامة M1 الصغيرة المستديرة الانضمام إلى الخلايا 4T1 ، التي لها المورفولوجية الظهاريه. (ب) صوره المجهر الفلوري من الخلايا 4T1 ملطخه cfse قبل كثرة الكريات الضامة. (ج) المدمجة DIC والصور المجهرية الفلورية من الخلايا 4T1 cfse الملطخة التي اجتاحتها الضامة M1 غير ملون. الأسهم الزرقاء تظهر الضامة M1 غير ملون الاستشعاع الأخضر لأنها تبتلع الخلايا المسمية CFSE 4T1. شريط مقياس = 50 μm. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيلم 2: يعيش الخلية الفيديو المجهري الأفلام من نقاط مرحله متعددة في صحن التصوير واحده تظهر كثرة من الخلايا الثديية الماوس 4T1 سرطان الثدي من قبل الضامة M1 المستحثة. تمثل النتائج ست نقاط مختلفه (الفيلم 2A − F) تم اعدادها وتنسيقها باستخدام برامج التصوير (الخطوة 7.4 ، انظر الشكل 3-الشكل 5). الضامة M1 لديها غير النظامية ، مثل فطيره الشكل مع سيتوتوبلاسما مساميه ، في حين 4T1 الفئران سرطان الثدي لديها المورفولوجية الظهاريه. وكانت الضامة M1 و 4T1 الخلايا بالخياطة ل 13 ح داخل حاضنه المرحلة في 37 درجه مئوية مع 5% CO2 قبل ان يلاحظ لمجهريه الفيديو الخلية الحية. تم التقاط الصور في 15 دقيقه فترات زمنيه ل 13 ح. شريط مقياس = 50 μm. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيلم 3: يعيش الخلية فيلم المجهر الفيديو من نقطه واحده احداثي (انظر الفيلم 2) المختار لإظهار كثرة المحببات من سرطان الثدي 4t1 الثديية بسبب الضامة M1 المستحثة بالتفصيل. يظهر السهم الأحمر كثرة الفندره. تظهر الدائرة الصفراء ان عدد الخلايا 4T1 التي تطفئ أحاطه الخلايا 4T1. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيلم 4: فيديو مفصل لمزيد من تصور عمليه الفندره من الخلايا 4T1 بالضامة M1. تظهر هذه اللوحة خلايا الضامة M1 الحية مع النمط الظاهري الخلوي المساميه. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
الفيلم 5: الضامة تتحرك نحو خلايا 4t1 لأقامه اتصال خليه إلى خليه ، تليها امتصاص الخلايا 4t1 بالضامة M1 (انظر الفيلم 2a). وكان الفيديو المجهر المرحلة التباين الزمني الفاصلة في 15 دقيقه فترات زمنيه لمده 13 ساعة من الزراعة داخل حاضنه المرحلة العليا في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2. شريط مقياس = 10 μm. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتطلب البروتوكول الموصوف خطوتين: 1) زراعه الخلايا السرطانية الثديية الماوس 4T1 والضامة M1-المستقطبة ، و 2) تقييم النشاط الضام البلاجي باستخدام المجهر الزمني الفاصل. ويستخدم علي نطاق واسع في زراعه الخلايا الحية في كثرة الكريات واختبارات الهجرة. نموذج زراعه الخلايا الحية هنا هو بسيط, قابل للتكيف في المختبر الاجراء (الشكل 2) التي تستخدم صبغه فلورية, cfse, الذي يستخدم لتسميه 4T1 الخلايا المستهدفة. ويستخدم ذلك للتتبع السليم لأنواع الخلايا اثناء تصوير الخلايا الحية. تم استخدام التصوير بالخلايا الحية بفواصل زمنيه لتقييم النشاط الخلوي لضام M1 باستخدام التصوير ثنائي الابعاد بفاصل زمني متعدد النقاط قبل 13 ساعة من الزراعة.
تم تاسيس نموذج الخلية الحية الزراعة باستخدام 4T1 الفئران سرطان الثدي الخلايا والضامة الماوس M1. ولتمييز الخلايا عن بعضها البعض ، كانت خلايا 4T1 ملطخه باستخدام صبغه فلورية من طراز CFSE (انظر القسم 4). CFSE يسمح لتتبع الخلايا ورصد تقسيم الخلية. CFSE يمكن ان تنتشر بشكل سلبي في الخلايا ، مما يجعل CFSE تلطيخ تعقب خليه مناسبه لتصور كثرة الخلايا المستهدفة. كما يهضم الضامة هضم وابتلاع الخلايا السرطانية ، فانها تاخذ حتى صبغ cfse وتصبح في نهاية المطاف الفلورسنت12،13. من الضروري البذور 4T1 الخلايا في طبق التصوير قبل الضامة M1. ويرجع ذلك إلى احجام واشكال مختلفه من كلا الخليتين. الخلايا 4T1 لديها المورفولوجية الظهاريه التي تكاثر في مجموعات صغيره. أيضا ، يجب ان تكون ملطخه الخلايا 4T1 مع CFSE قبل الزراعة مع الضامة M1 غير ملون. قبل الاستقطاب الضام باستخدام LPS و IFN-γ, الضامة murine RAW 264.7 هي مستديرة, صغيره, وعاده ما تنمو كخلايا واحده. بعد lps و ifn-γ الاستقطاب ، التي يسببها M1 الضامة لها بالأرض نسبيا ، شكل فطيره تشبه ، مع سيتوتوبلاسما مساميه14،15. لضمان الاستقطاب السليم من RAW 264.7 نحو M1 الدولة ، 100 ng/mL LPS و 20 نانوغرام/مل γ الضامة حفز كانت مناعية مع علامة M1 ، المضادة للأجسام الأضداد مترافق إلى FITC (الشكل 1). يتم تنفيذ هذا البروتوكول قبل coculturing الضامة والخلايا المستهدفة لضمان ان الضامة هي الاستقطاب تماما في الدولة M1.
تصف هذه الدراسة طريقه لمجهر الفلورسنت لتصور النشاط البالع للبلضام الحية. للحد من التسرب الضوئي وتوفير التصوير الفلوري أفضل ، يمكن الجمع بين المجهر الفلورسنت مع تقنيات التصوير الأخرى التي هي غير مدمره ل الفلوروكروم ، علي غرار DIC. يصف هذا البروتوكول المواد والأساليب اللازمة لتقييم كثرة الخلايا السرطانية الثديية للماوس من قبل LPS و IFN-γ حفز الضامة باستخدام الفلورسنت و DIC المجهر الزمني الفاصل. ومع ذلك ، فان الدراسات المجهرية الفلورية لها قيود عند دراسة التصوير بالخلايا الحية مقارنه بالتصوير الفاصل بين المراحل والتباين الزمني. خلال التصوير الخلوي الحي الفلورسنت ، يمكن ان يؤدي التعرض لفترات طويلة إلى كميه عاليه من ضوء الاثاره إلى تلف الخلايا الخطيرة16. يمكن ان يسبب الرشح الضوئي مشاكل كبيره في التصوير بالخلايا الحية. الاضاءه عاليه الكثافة المستخدمة في التصوير بالخلايا الحية يمكن ان تقلل من قدره صبغ CFSE ليتالق. ومع ذلك ، تم التوصل إلى تقييم لندره المحببات في الجزء الثاني من هذه الدراسة باستخدام التصوير ثنائي الابعاد الفاصل بين المراحل الزمنيه (الأفلام 2 – 5).
المجهر الفاصل الزمني يوفر مزايا مثل توليد البيانات من تجربه واحده في اي وقت من الأوقات طوال فتره المدة المطلوبة وبشكل كبير ، يمكن التقاط نقاط مرحله متعددة داخل طبق تصوير واحد لتجربه واحده. وهذا يسمح بمراقبه المواقف المختلفة في تجربه واحده. ويمكن أيضا استخدام البروتوكول باستخدام ابار متعددة من لوحات الثقافة (علي سبيل المثال ، 6 ، 24 ، 96 لوحات جيده). من بين التحديات التقنية الأكثر اهميه لأداء تجربه التصوير بالخلايا الحية الناجحة تشمل الحفاظ علي الخلايا في حاله صحية باستخدام حاضنه المرحلة العليا لتوفير درجه حرارة مستقره من 37 درجه مئوية ، 95 ٪ من الرطوبة ، و 5 ٪ CO2. لان التجربة استغرقت 13 ساعة ، وضمان ان وظائف المجهر عاده في جميع انحاء كان حاسما.
خلال هذه الدراسة ، تم التقاط ست نقاط مختلفه في صحن التصوير طوال 13 ساعة لمده 15 دقيقه لكل نقطه (فيلم 2). ويمكن تعديل النقاط تبعا لحاله الخلية قيد التحقيق. بالنظر إلى ان هناك نقاط مرحله متعددة ليتم التقاطها خلال هذه التجربة ، فمن المهم للتاكد من ان كل نقطه لديها تركيز ثابت قبل تنفيذ تسجيل الفيديو الخلية الحية. ويجب تحسين الفترة الزمنيه للتحقيق. وانخفاض الفترة الزمنيه سيكون لها أكثر تفصيلا النقاط التي يمكن ان تكون غير المسنين; ومع ذلك ، سيكون حجم الملف كبير جدا. زيادة الفاصل الزمني سيؤدي إلى فيديو طويلة وسوف تجعل الفيلم تفقد الاستمرارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل ماليا من قبل جيران بوترا Berimpak (GBP) ، جامعه بوترا ماليزيا: 9542800. ونود ان نشكر معهد التكنولوجيا الحيوية الزراعية ، ومختبرات ماليزيا (ABI) ، ومرفق التصوير المجهري. شكر خاص لمحمد دانيال حازم للمساعدة في تحرير وتسجيل الفيديو التجريبي لهذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
