Summary
癌細胞に対するマクロファージ貪食活性、具体的には4T1マウス乳腺癌細胞を、本研究で画像化した。生細胞共培養モデルを確立し、蛍光干渉造影造影顕微鏡の組み合わせを用いて観察した。この評価は、イメージングソフトウェアを使用して画像化し、マルチポイントタイムラプスビデオを開発しました。
Abstract
腫瘍関連マクロファージ(AM)は、腫瘍の増殖、浸潤、転移、および癌治療に対する耐性の重要な構成要素として同定されている。しかし、腫瘍関連マクロファージは、腫瘍の微小環境に応じて腫瘍に有害であり、免疫細胞の細胞傷害活性に拮抗するか、または抗腫瘍応答を増強することによって、その表型特性を可逆的に変化させることができる。マクロファージの分子作用と腫瘍細胞との相互作用(例えば、食作用)は広く研究されていない。そこで、腫瘍微小環境における免疫細胞(M1/M2サブタイプTAM)とがん細胞との相互作用は、現在、がん免疫療法研究の焦点になっている。本研究では、誘導M1マクロファージおよびマウス乳腺4T1癌細胞の生細胞共培養モデルを開発し、位相コントラスト、蛍光、および差動干渉コントラスト(DIC)顕微鏡を用いてタイムラプスビデオ機能を用いてマクロファージの貪食活性を評価した。本方法は、食細胞症の多点生細胞イメージングを観察し、文書化することができる。M1マクロファージによる4T1細胞の貪食は、カルボキシフルオレセインコハシニミジルエステル(CFSE)で4T1細胞を染色する前に蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。本研究では、マクロファージと腫瘍細胞を単一のイメージング皿で共培養し、M1マクロファージを偏光させ、13時間の共培養中に4T1細胞を巻き込むマクロファージのマルチポイントイベントを記録する方法について説明している。
Introduction
マクロファージは免疫防御の第一線であり、癌細胞を含む病原体や異物に対する免疫応答を調整する役割を果たしています。彼らは破壊し、体内の不要な粒子を取り除く特殊な食細胞です。マクロファージは、アポトーシス細胞や微生物のクリアランスや他の免疫細胞1の募集などの防御機能に寄与する。マクロファージは、環境信号2に応答して、M1とM2マクロファージの2つの異なるタイプに区別することができます。M1偏光マクロファージ(すなわち、古典的に活性化されたマクロファージ)は、サイトカインインターフェロンγ(IFN-γ)およびリポ多糖(LPS)によって活性化され、炎症反応、病原体クリアランス、効率的な貪食、および腫瘍性免疫3、4に関与する。M2マクロファージは、腫瘍関連マクロファージ(AM)と密接に関連しており、抗炎症および腫瘍促進特性4を有する。
古代ギリシア語(ファゲイン)に由来する食細胞症は、「食べる」(キトス)を意味し、「細胞」を意味し、-osisは「プロセス」5を意味します。食細胞症は、食細胞(マクロファージ、単球、好中球を含む)が病原体を殺して巻き込み、異物を浄化し、アポトーシス細胞破片を除去する受容体媒介性プロセスです。腫瘍関連マクロファージ(AM)は、乳癌を含む異なる腫瘍の間質に見出され、プロ腫瘍機能6、7を有し、食細胞症に対する耐性をもたらす。マクロファージによる腫瘍細胞食作用の詳細なメカニズムはまだ分かっていない。
本研究は、1)4T1マウス乳腺癌細胞とM1偏光マクロファージが共培養され、2)マクロファージの貪食活性を生細胞ビデオ顕微鏡を用いて評価する2段階の方法を提示する。CFSE蛍光色素を用いて、4T1マウス乳腺癌細胞を染色した。染色は4T1細胞にラベルを付け、単一の画像皿内で養成されたM1マクロファージと区別する。RAW 264.7マクロファージは、LPSおよびIFN-γと共極化され、M1表現型に変調される。完全な偏光を確保するために、FITCに共役した抗iNOS抗体を用いた免疫染色を行った。その後、共培養中に食細胞症を含む複数の事象を観察するために、マルチポイントシリーズのタイムラプス画像を取得した。
腫瘍細胞とマクロファージ間の相互作用をよりよく理解することは、潜在的な癌免疫療法につながる可能性があります。生細胞イメージングは、リアルタイムの設定で細胞ダイナミクスの詳細なビューを提供し、神経科学、発生生物学、および創薬における細胞移動、フェノチピックスクリーニング、アポトーシス、および細胞毒性8、9の研究に使用されています。本研究で提案された腫瘍は乳癌であるが、この方法は複数の標的細胞および明確なエフェクター細胞にも適用することができる。
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Protocol
注:セクション1-6は、4T1マウス乳腺癌細胞およびRAW 264.7マウスマクロファージの共培養モデルについて説明する。セクション7は、M1マクロファージ貪食4T1細胞のタイムラプス評価について説明する。
1. 4T1マウス乳腺癌細胞およびRAW 264.7マウスマクロファージの培養
- 37°Cの水浴中の穏やかな攪拌または細胞株の正常な増殖温度により、極低温保存4T1およびRAW 264.7通路6細胞のバイアルを解凍する。
メモ:解凍は、約2分以内に迅速に行う必要があります。汚染を避けるため、水浴からバイアルを取り出し、70%のエタノールを吹き付けて除染します。遺伝的ドリフトを避けるために、特にマクロファージのために、低い通路数(すなわち、20未満)を使用する。 - 解凍した細胞を15mL円錐管内の完全DMEM培地の10mLで希釈し、細胞を600 x gで遠心分離して5分間細胞ペレットを得た。
注:10%(v/v)胎児ウシ血清(FBS)、200 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、および2 mM Lグルタミンを添加した完全なDMEM培地がプロトコル全体で使用されます。 - 慎重に培地を吸引し、完全培地の8mLで細胞を再中断し、25cm2組織培養処理フラスコに移す。4T1とRAW264.7の両方の細胞を37°Cで完全なDMEM培地に5%CO2で培養する。
注:細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、細胞を殺さないようにドロップして培養フラスコドロップに細胞懸濁液を追加します。 - 細胞の付着を可能にするために培養の1週間後、フラスコを毎日監視し、必要に応じて完全なDMEM培地の8 mLを追加します。
2. M1偏光RAW 264.7マクロファージの免疫染色
- RAW 264.7細胞のコンフルエンスが70−80%に達すると、培養媒体を廃棄し、少なくとも2mLのPBSで2xを穏やかにすす上げます。
注: RAW 264.7 細胞をシードする前に、細胞の分化が発生していないことを確認してください (つまり、樹状表現型や細胞サイズの増加)。細胞形態の変化が目に見える場合は、培養物を廃棄し、以前の通路バイアルから新しい細胞株を解凍します。 - 細胞スクレーパーを使用して付着細胞を穏やかに外し、15 mL円錐形チューブに移すことによって、収集のためのマクロファージを準備します。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、完全なDMEM培地を使用して1 x 105細胞/皿の細胞懸濁液を調製します。
- マクロファージサスペンションのシード2 mLを2つのイメージング皿に入れる。細胞を5%CO2で37°Cで2−3時間インキュベートし、細胞の付着を可能にします。
- 完全なDMEM媒体10、11に100 ng/mL LPSおよび20 ng/mL IFN-γを加えることによってM1偏光媒体を準備する。
- マクロファージから培養上清を廃棄し、少なくとも1mLのPBSで皿2x内のモノレイヤーを慎重に洗浄する。
- イメージング皿の1つに2mLのM1偏光メディアを追加し、RAW 264.7細胞がM1マクロファージ表現型を誘導し、5%CO2で37°Cで2〜3時間インキュベートできるようにします。
注:抗iNOS抗体染色の制御として10%FBSを補充したDMEMを用いたイメージング皿中の種子RAW 264.7マクロファージ。イメージング皿RAW(対照)およびM1マクロファージ(LPSおよびIFN-γ偏光)にそれぞれラベルを付けます。 - 免疫染色の前に、4%パラホルムアルデヒドの2mLを使用してRAW 264.7およびM1マクロファージ細胞を固定し、37°Cで15分間インキュベートします(室温、RT)。
- 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
- PBSで塩化アンモニウム50 mLの2mLでクエンチし、RTで15分間インキュベートする。
- RTで15分間PBSで0.3%トリトンX-100の2 mLを使用して透過する。
- 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
- RT で 30 分間、PBS で 10% FBS の 2 mL を使用してブロックします。
注:免疫染色におけるブロッキングステップは、細胞内の抗体の非特異的結合を最小限に抑える。 - 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
- PBSで2mLの抗iNOS-FITCを、4°Cで一晩FBSを1%でインキュベートします。
注:製造業者の推奨事項に従って、適切な抗体希釈を使用して細胞にラベルを付けます。この時点からアルミ箔でそれらをカバーすることにより、光から料理を保護します。 - 上清を取り除き、少なくとも3xのPBSで細胞単層を洗浄します。
- 300 nM 6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール(DAPI)の1 mLを、アルミ箔で覆って暗闇の中で、37°で10分間のイメージング皿にインキュベートします。
- 少なくとも3xのPBSの1 mLで細胞を洗浄し、イメージング皿に完全なDMEM培地の1 mLを追加します。
注:細胞は蛍光イメージングの準備ができました。顕微鏡のセットアップは選択された汚れ(この場合はFITCおよびDAPI)のための反転段階および励起フィルターを必要とする。 - 顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアをロードします。顕微鏡にイメージング皿を取り付け、RAW 264.7およびM1マクロファージを観察するように焦点を調整します。透過光時間と露光時間を調整して、位相コントラストFITCおよびDAPI画像の外観を最適化します。
メモ:すべてのポイントにフォーカスがあり、チャンネルが最適化されたら、イメージングを開始します。 - 位相コントラスト FITC および DAPI イメージのキャプチャ (図 1)。
3. 4T1マウス乳腺癌細胞の播種
- 4T1細胞のコンフルエンシーが70~80%に達すると、培養媒体を廃棄し、少なくとも2mLのPBSで2xを穏やかにすす上げます。1 mL の前温トリプシンを加えて細胞の解剖を解除し、37 °C で最大 20 分間インキュベートします。
メモ:顕微鏡で細胞を観察してください。デタッチされたセルは丸められます。 - 細胞が剥離したら、15 mL円錐形チューブに移し、2 mLの前温DMEM培地を加えてトリプシンを不活性化します。細胞層表面をピネットして媒体を穏やかに分散させ、細胞を回収する。次いで、600xgで5分間遠心分離機を行い、細胞ペレットを得た。
- 上清を取り外し、プレミングされた完全なDMEM培地の10 mLでペレットを再サスペンドします。
- 組織培養で処理した2つの35mmガラス底イメージング皿のそれぞれで、2mLの完全なDMEM培地でヘモサイトメーターとシード1 x 105 4T1細胞を使用して細胞をカウントします。細胞を5%CO2で37°Cで一晩インキュベートする。
注:M1偏光媒体とラベル4T1-インデューサー (制御)を用いたイメージング皿の1つに4T1細胞を培養する。これは、インデューサーにさらされたときに4T1細胞の正常な増殖を確実にするためである。
4. CFSE染色を用いた生きた4T1マウス乳腺癌細胞の標識
- まず、4T1細胞から既存のメディアを取り出して、皿をイメージングします。1mLのPBSで少なくとも2xの細胞単層を洗浄する。
- CFSEを1mLのPBSで希釈することにより、CFSE染色溶液を5μM調製します。各イメージング皿に5μM CFSE染色液を1mL加え、暗闇の中でRTまたは37°Cで20分間細胞をインキュベートします。
注:最適なCFSE染色濃度を得るために、メーカーの推奨事項と予備実験に従って適切なCFSE作業濃度を使用して細胞にラベルを付けます。CFSEをPBSで希釈すると、ラベリング効率が高くなります。 - 10%FBSと染色溶液を含む完全なDMEM培地の等量を細胞に添加して染色をクエンチし、暗闇の中でRTで5分間インキュベートする。
- CFSE含有溶液を廃棄し、同じ量の培養媒体で細胞1xを洗浄する。
注:4T1細胞が蛍光標識されるようになりました。 - 4T1-CFSE細胞を5%CO2のRTで標準培養条件に戻します。
5. RAW 264.7マウスマクロファージの播種と4T1との共培養
- RAW 264.7のコンフルエンスが70−80%に達すると、培養媒体を廃棄し、少なくとも2mLのPBSで2xを穏やかに洗い流す。
- 細胞スクレーパーを使用して付着細胞を穏やかに外し、15 mL円錐形チューブに移すことによって、収集のためのマクロファージを準備します。
- ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントし、播種密度に応じて完全なDMEM培地で残りの溶液を希釈することにより、1 x 105細胞/mLの細胞懸濁液を調製します。
注:共培養中の過度にコンフルエントな細胞は、食細胞症を著しく減少させる可能性があります。本研究では、マクロファージの播種率:癌細胞を1:1比に調整した。比率は、腫瘍細胞の攻撃性およびマクロファージの起源に応じて調整することができる。 - 凝置する前に、前日に播種した4T1細胞から培養上清を廃棄し(ステップ4.5)、少なくとも1mLのPBSで単層2xを慎重に洗浄する。
- 種子1 x 105 RAW 264.7細胞/2 mL当たりの完全なDMEM培地を4T1イメージング皿の1つに。細胞を5%CO2で37°Cで2−3時間インキュベートし、細胞の付着を可能にします。イメージングディッシュ4T1-M1共培養にラベルを付けます。
注:4T1(対照)細胞はマクロファージと共培養されなかった。
6. RAW 264.7マクロファージのM1偏光
- 10% (v/v) FBS10、11を補完する完全な DMEM 培地に 100 ng/mL LPS および 20 ng/mL IFN-γ を追加してM1偏光メディアを準備します。
- 前にインキュベートしたマクロファージから培養上清を廃棄し(ステップ5.5)、少なくとも1mLのPBSで皿2x内のモノレイヤーを慎重に洗浄する。
- 次いで、2mLのM1偏光メディアをイメージング皿に添加し、RAW264.7細胞を5%CO2で37°CでインキュベートすることによりM1マクロファージ表現型に誘導することを可能にする。
注:M1マクロファージ細胞は、完全な偏光を達成するために2−3時間のインキュベーションを要する場合があります。マクロファージの完全な偏光を可能にするために、適切なインキュベーション期間を確保するために予備実験を行う必要があります。
7. 食細胞症の生細胞ビデオ顕微鏡
注:画像露出の最適化、時間測定、自動焦点補正など、生み出し可能なビデオを得るためにライブセルイメージングを行う際には、多くの要因を考慮する必要があります。
- 実験の前に、サーモスタットを37°Cでオンにし、5%CO2を供給することにより、細胞培養インキュベーターを設定します。
メモ:顕微鏡のセットアップには、反転ステージ、ステージトップインキュベーター、湿度制御(95%)、ガスインキュベーションシステムが必要です。このセットアップは、長期生細胞ビデオ顕微鏡評価のための細胞を維持するために重要です。 - ピエゾステージを含む顕微鏡をオンにし、顕微鏡イメージングソフトウェアをロードします。
- シードコカルチャーセルをステージ中央の35mmガラス底イメージング皿に置き、上部チャンバーにそっとねじ込みます。ジョイスティックを使用して、イメージする位置を選択してステージをモータ化します。
- サンプルを表示するには、砲塔の位相コントラストフィルタを選択します。最初にサンプルを表示した後、適切なフィールドを見つけて、サンプルに焦点を合かします。
注:イメージングソフトウェアは、完全に自動化された客観的選択、パーフェクトフォーカスシステム、タイムラプスシリーズ、マルチチャンネル画像取得、およびマルチポイント画像取得を使用することができます。 - CFSEラベリングおよび差動干渉コントラスト集録のマルチチャンネル蛍光を設定するには、イメージングソフトウェア取得ダイアログボックスを開き、[Lambda]タブチェックボックスをオンにします(図2)。
メモ:13時間のタイムラプスイメージングでは、位相差チャネルを使用する必要があります。 - [ラムダ]タブを選択する |[光学構成]を選択し、差動干渉コントラストに[10X DIC]を選択し、緑色蛍光フィルタチェックボックスに[GFP-R]を選択します。[ラムダ] の下 |[フォーカス]欄に、[10X DIC]チェックボックスを選択してフォーカス参照として設定します。
- イメージングソフトウェア取得ダイアログボックスを開き、[XYZ時間...]ボタンをクリックし、[XY]タブを選択します。
- ライブ画像を確認しながら、電動ステージのジョイスティックを使用して画像取得ポイントに移動するか、接眼時計を介して別の位置を選択します。次に、[ポイント名]列の下にあるチェックボックスをクリックして、イメージキャプチャの各位置の各ポイントを設定します(図3参照)。
注:自動ステージでは、異なるXY座標のマルチポイント画像取得を可能にし、複数のフィールドをキャプチャできます。 - 画面に表示される各サンプルのフォーカスを微調整します。オートフォーカス補正のコントロールを使用します。
- ソフトウェアを使用して、タイムラプスイメージキャプチャを設定します。イメージング ソフトウェアの取得ダイアログ ボックスで、[Time]タブを確認します (図 4参照)。
- [間隔](ある時点から別の時点までの遅延)と[期間](実験の全時間)を決定します。時間の単位はさまざまであり、ドロップダウン メニューからミリ秒 (ms)、秒 (秒)、分 (m)、または時間 (h) で選択できます。
注:蛍光およびDICタイムラプス多チャンネル取得のタイムラプスイメージングのイメージング期間の長さは、このアッセイで使用される蛍光色素によって異なる場合があります。標識された細胞があまりにも長く露出している場合、光脱白が起こることがある。 - 取得した画像を保存するには、[ファイルに保存]チェックボックスをオンにします。[タイムスケジュール]タブで、[今すぐ実行]ボタンをクリックしてマルチポイント時系列画像を取得します(図5参照)。
メモ:イメージングソフトウェアでは、イメージはnd2ファイル形式で保存されます。各タイムラプスは、後でMP4ファイル形式で個別に保存することができます。
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Representative Results
4T1マウス乳腺癌細胞株の共培養モデルのタイムラプス2次元(2D)画像は、13時間の間にM1マクロファージによって巻き込まれる4T1細胞を示す。免疫染色を行うことによってM1マクロファージの完全な偏光を確保することが重要である。結果(図1)は、100ng/mLリポ多糖(LPS)および20ng/mL IFN-γ偏光RAW 264.7マクロファージの濃度がM1状態であることを示す。標的細胞に蛍光色素で標識し、エフェクター細胞を未染色のままにしておくと、生細胞共培養モデル(ムービー1)が可能になります。13時間及び15分間隔を通して、4T1細胞との共培養におけるM1マクロファージの貪食活性を文書化した(ムービー2)。6つのマルチポイントビデオ(ムービー2のA-F)は、単一の35mmガラス底イメージング皿内の複数のイベントを評価するために記録されました。ムービー3は、M1マクロファージによって貪食された4T1細胞を示す。映画4は、この実験から撮影された詳細なビデオの一例として選ばれ、ムービー5はM1マクロファージによる4T1細胞の取り込みを示す。
図1:緑色の抗iNOS-FITCによる免疫蛍光染色、青色の核マーカーDAPI、およびマージされた画像の強化バージョン。これらのパネルは、RAW 264.7マクロファージ(対照)およびM1マクロファージ(LPSおよびIFN-γ刺激)を緑色で抗iNOS-FITC(M1マーカー)で免疫染色し、核マーカー、DAPIを青色でアンチステインすることを表す。(A)DAPI染色は、RAW 264.7およびM1マクロファージの両方を観察することができる。(B) 抗iNOS-FITC(緑)は、M1マクロファージ上の蛍光のみを行う。(C) DAPI染色と抗iNOS-FITCの画像をマージした。スケール バー = 50 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図2:イメージングソフトウェア集録ダイアログ制御における蛍光およびDIC画像取得の設定[1] [Lambda]タブチェックボックスを選択し、[2] [光構成]を選択し、緑色蛍光フィルタチェックボックスに[10X DIC]と[GFP-R]を選択し、[3][10X DIC]を選択 |[このチャンネルをフォーカス参照として設定]をクリックします。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:イメージングソフトウェア集録ダイアログコントロールでのマルチポイント画像集録の設定[4] [XY]タブを選択し、次の[5]は[ポイント名]列の下のチェックボックスを選択して、画像キャプチャの各ポイントを設定します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:タイムラプス測定画像キャプチャの間隔と継続時間を設定するタイムラプス画像キャプチャを設定するイメージングソフトウェア取得ダイアログコントロール。[時間]タブでタイムラプス画像取得[6]チェックを設定するには、[7][間隔](秒、分、または時間)、[期間]を決定します(秒、分、または時間単位)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:タイムラプス測定画像キャプチャ用のマルチポイントムービーパネルの設定コカルチャーの13時間の完了後に組み合わせた6つのマルチポイントムービーパネルのプレビュー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:蛍光およびDIC顕微鏡の多チャンネル取得を用いて捕捉した共培養中の未染色M1マクロファージおよび4T1 CFSE染色マウス乳腺癌細胞の代表的なムービー。結果は、4T1マウス乳腺癌細胞の緑色標識細胞壁にCFSEを示し、染色されていないM1マクロファージで共培養した。マルチチャネル集録を使用して15分の時間間隔で13時間の共培養期間のタイムラプス画像を取得しました(ステップ7.3、図2を参照)。(A)微分干渉コントラストは、(赤い円)上皮形態を有する4T1細胞に付着した小さな丸いM1マクロファージを示す。(B)マクロファージによる食細胞症の前にCFSEで染色された4T1細胞の蛍光顕微鏡画像。(C)未染色M1マクロファージによって巻き込まれるCFSE染色4T1細胞のDICおよび蛍光顕微鏡画像を結合した。青い矢印は、CFSE標識4T1細胞を巻き込むと、染色されていないM1マクロファージが緑色に蛍光を送っていることを示しています。スケールバー = 50μm このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画2:M1マクロファージを誘導して4T1マウス乳腺癌細胞の貪食を示す単一の画像化皿の多段階点からの生細胞ビデオ顕微鏡ムービー。結果は、イメージング ソフトウェアを使用してセットアップおよび調整された 6 つの異なるポイント (ムービー 2A-F)を表します (手順 7.4、図 3-図 5を参照)。M1マクロファージは多孔質細胞質を有する不規則なパンケーキ様形態を有し、4T1マウス乳腺癌は上皮形態を有する。M1マクロファージおよび4T1細胞を、生細胞ビデオ顕微鏡で観察される前に、37°Cでステージインキュベーター内で13時間培養した。画像は13時間の15分間隔で撮影されたスケールバー = 50μm.このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画3:単一座標点の生細胞映像顕微鏡ムービー (ムービー2参照)は、M1マクロファージを誘導して4T1マウス乳腺癌の貪食を示すために選ばれた。赤い矢印は食細胞症を示す。黄色い円は、4T1細胞の巻き込みを急行した4T1細胞の数を示す。スケールバー = 10μm このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画4:M1マクロファージにより4T1細胞の貪食過程をさらに可視化する詳細な映像。このパネルは、多孔質細胞質表現型を有する生きたM1マクロファージ細胞を示す。スケールバー = 10μm このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
動画 5: 4T1 細胞に向かって移動して細胞間接触を確立し、続いて M1 マクロファージによる 4T1 細胞の取り込み(ムービー 2A を参照)位相差顕微鏡のタイムラプスビデオを、5%CO2で37°Cのステージトップインキュベーター内の13時間の共培養に対して15分間隔で画像化した。スケールバー = 10μm このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
記載されたプロトコルは、2つのステップを必要とする:1)4T1マウス乳腺癌細胞およびM1偏光マクロファージの共培養、および2)タイムラプス顕微鏡を用いたマクロファージ貪食活性の評価。生細胞共培養は、食細胞症および遊走アッセイに広く使用されている。ここでの生細胞共培養モデルは、4T1標的細胞の標識に使用される蛍光色素CFSEを利用した、シンプルで適応可能なインビトロ手順(図2)です。これは、生細胞イメージング中の細胞タイプの適切な追跡に使用されます。タイムラプス生細胞イメージングは、13時間の共培養前に多点タイムラプス2Dイメージングを用いてM1マクロファージの貪食活性を評価するために用われた。
生細胞共培養モデルは、4T1マウス乳腺癌細胞およびM1マウスマクロファージを用いて確立された。細胞を互いに区別するために、4T1細胞をCFSE蛍光色素を用いて染色した(セクション4参照)。CFSEは細胞を追跡し、細胞分裂を監視することを可能にする。CFSEは受動的に細胞に拡散することができ、CFSEは標的細胞の貪食を可視化するのに適した細胞トラッカーを染色する。貪食マクロファージが消化し、癌細胞を巻き込むように、彼らはCFSE色素を取り込み、最終的に蛍光12、13になる。M1マクロファージの前にイメージング皿に4T1細胞を播種することが不可欠です。これは、両方のセルのサイズと形状が異なっているためです。4T1細胞は、小さなクラスターで増殖する上皮形態を有する。また、4T1細胞は、染色されていないM1マクロファージと共培養する前にCFSEで染色する必要があります。LPSおよびIFN-γを用いたマクロファージ偏光の前に、マウスマクロファージRAW 264.7は円形で小さく、通常は単一細胞として増殖する。LPSおよびIFN-γ偏光後、誘導されたM1マクロファージは、比較的平坦化されたパンケーキ状の形状を有し、多孔質細胞質14、15を有する。M1状態に向けてRAW 264.7の適切な偏光を確保するために、100ng/mL LPSおよび20 ng/mL IFN-γ刺激マクロファージをM1マーカーで免疫染色し、FITCに結合した抗iNOS抗体を有する(図1)。このプロトコルは、マクロファージと標的細胞を体系化する前に実行され、マクロファージがM1状態に完全に二極化していることを確認します。
本研究では、生きているマクロファージの貪食活性を可視化する蛍光顕微鏡法について説明する。光漂白を最小限に抑え、より良い蛍光イメージングを提供するために、蛍光顕微鏡は、DICと同様に、フルオロクロムに対して非破壊的な他のイメージング技術と組み合わせることができます。本プロトコルは、蛍光およびDICタイムラプス顕微鏡を用いたLPSおよびIFN-γ刺激マクロファージによるマウス乳腺癌細胞の貪食の評価に必要な材料および方法について説明する。それにもかかわらず、蛍光顕微鏡研究は、位相差タイムラプスイメージングと比較して生細胞イメージングを研究する際に限界がある。蛍光生細胞イメージングの間、高量の励起光への長時間の暴露は、重篤な細胞損傷を誘発し得る16。光脱白は、生細胞イメージングに重大な問題を引き起こす可能性があります。生細胞イメージングに使用される高輝度照明は、CFSE色素が蛍光を及ぶ能力を低下させることができます。それにもかかわらず、位相コントラストタイムラプス2Dイメージング(映画2-5)を用いて、この研究の第2部で13時間の食細胞症評価が達成された。
タイムラプス顕微鏡検査は、所望の期間を通じて任意の時点で単一の実験からデータを生成するなどの利点を提供し、有意に、単一の実験のために単一の画像化皿内の複数のステージポイントを捕捉することができる。これにより、1回の実験で様々な位置を観察することができます。このプロトコルはまた、培養プレート(例えば、6、24、96ウェルプレート)から複数のウェルを使用して使用することができる。ライブセルイメージング実験を成功させるための最も重要な技術的課題の中には、ステージトップインキュベーターを使用して37°C、湿度95%、および5%CO2の安定した温度を提供することにより、細胞を健康な状態で維持することが含まれます。実験は13時間かかったので、顕微鏡が全体を通して正常に機能することを保証することは非常に重要でした。
この研究では、イメージング皿の6つの異なるポイントを1ポイントあたり15分間隔で13時間にわたってキャプチャしました(ムービー2)。ポイントは、調査中のセルのイベントに応じて調整できます。この実験を通じてキャプチャするステージポイントが複数あることを考えると、ライブセルビデオ録画を実行する前に、各ポイントが安定した焦点を持っていることを確認することが重要です。調査の時間間隔を最適化する必要があります。時間間隔を短くすると、イメージ可能なより詳細なポイントが含まれます。ただし、ファイル サイズは非常に大きくなります。時間間隔を長くすると、ビデオが長くなり、ムービーの連続性が失われます。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品は、ジェラン・プトラ・ベリムパック(GBP)、大学プトラマレーシア:9542800によって財政的に資金提供されました。アグロバイオテクノロジー研究所、マレーシア(ABI)研究所、顕微鏡画像設備に感謝申し上げたいと思います。この作品の実験ビデオの編集と録画に協力してくれてありがとう。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
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