Summary
Makrophagen-phagozytische Aktivität gegen Krebszellen, insbesondere 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zellen, wurde in dieser Studie abgebildet. Das Modell der Kokultur von Lebenden Zellen wurde mit einer Kombination aus fluoreszierender und differentialer Interferenzkontrastmikroskopie erstellt und beobachtet. Diese Bewertung wurde mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware zur Entwicklung von Multipoint-Zeitraffervideos abget/die sich erstellt haben.
Abstract
Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) wurden als wichtiger Bestandteil für Tumorwachstum, Invasion, Metastasierung und Resistenz gegen Krebstherapien identifiziert. Tumorassoziierte Makrophagen können jedoch je nach Tumormikroumgebung schädlich für den Tumor sein und ihre phänotypischen Eigenschaften reversibel verändern, indem sie entweder die zytotoxische Aktivität von Immunzellen antagonisieren oder die Anti-Tumor-Reaktion verbessern. Die molekularen Aktionen von Makrophagen und ihre Wechselwirkungen mit Tumorzellen (z.B. Phagozytose) wurden nicht umfassend untersucht. Daher steht die Interaktion zwischen Immunzellen (M1/M2-Subtyp TAM) und Krebszellen in der Tumormikroumgebung heute im Fokus der Krebsimmuntherapieforschung. In der vorliegenden Studie wurde ein Live-Zell-Kokulturmodell von induzierten M1-Makrophagen und Maus-Mamma-4T1-Karzinomzellen entwickelt, um die phagozytische Aktivität von Makrophagen mithilfe einer Zeitraffer-Videofunktion mithilfe von Phasenkontrast-, Fluoreszenz- und Differentialinterferenzkontrast(DIC)-Mikroskopie zu bewerten. Die vorliegende Methode kann die Mehrpunkt-Livezellbildgebung der Phagozytose beobachten und dokumentieren. Die Phagozytose von 4T1-Zellen durch M1-Makrophagen kann mittels fluoreszierender Mikroskopie beobachtet werden, bevor 4T1-Zellen mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) gefärbt werden. Die aktuelle Publikation beschreibt, wie Makrophagen und Tumorzellen in einer einzigen bildgebenden Schale kokultiviert werden, M1-Makrophagen polarisieren und Multipoint-Ereignisse von Makrophagen aufzeichnen, die 4T1-Zellen während 13 h Cokultur verschlingen.
Introduction
Makrophagen sind die erste Linie der Immunabwehr und spielen eine Rolle bei der Orchestrierung von Immunreaktionen gegen Krankheitserreger und Fremdstoffe, einschließlich Krebszellen. Sie sind eine spezialisierte Phagozyte, die unerwünschte Partikel im Körper zerstört und loswird. Makrophagen tragen zu Abwehrfunktionen wie der Clearance von apoptotischen Zellen und Mikroorganismen und der Rekrutierung anderer Immunzellenbei 1. Makrophagen können sich als Reaktion auf Umweltsignale2in zwei verschiedene Typen unterscheiden, M1- und M2-Makrophagen. M1-polarisierte Makrophagen (d.h. klassisch aktivierte Makrophagen) werden durch die Zytokininterferon-Interferon-- (IFN-) und Lipopolysaccharide (LPS) aktiviert und sind an der Entzündungsreaktion, der Pathogenclearance, der effizienten Phagozytose und der tumorzidenden Immunität3,4beteiligt. Die M2-Makrophagen sind eng mit tumorassoziierten Makrophagen (TAMs) verwandt und haben entzündungshemmende und Tumorfördereigenschaften4.
Phagozytose, abgeleitet aus dem Altgriechischen (Phagein), was "zu verschlingen" (kytos), was "Zelle" und -osis bedeutet, was "Prozess"bedeutet 5. Phagozytose ist ein Rezeptor-vermittelter Prozess, bei dem Phagozyten (einschließlich Makrophagen, Monozyten und Neutrophilen) eindringende Krankheitserreger töten und verschlingen, FremdeTeilchen säubern und apoptotische Zellablagerungen beseitigen. Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) sind im Stroma in verschiedenen Tumoren, einschließlich Brustkrebs, gefunden und haben Pro-Tumor-Funktionen6,7, was zu einer Resistenz gegen Phagozytose führt. Der detaillierte Mechanismus der Tumorzellphagozytose durch Makrophagen ist noch nicht verstanden.
Diese Studie stellt eine zweistufige Methode vor: 1) 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen und M1-polarisierte Makrophagen werden kokultiviert, und 2) die phagozytische Aktivität der Makrophagen wird mittels Live-Zell-Videomikroskopie bewertet. CFSE-Fluoreszenzfarbstoff wurde verwendet, um die 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen zu färben. Der Fleck kennzeichnet 4T1-Zellen, um sie von den kokultivierten M1-Makrophagen in einer einzigen bildgebenden Schale zu unterscheiden. RAW 264.7 Makrophagen werden mit LPS und IFN-A zu einem M1-Phänotyp polarisiert. Um eine vollständige Polarisation zu gewährleisten, wurde eine Immunfärbung mit anti-iNOS-Antikörpern durchgeführt, die mit FITC konjugiert sind. Anschließend wurde eine Multipoint-Serie von Zeitrafferbildern angeschafft, um mehrere Ereignisse, einschließlich Phagozytose, innerhalb der Kokultur zu beobachten.
Ein besseres Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und Makrophagen kann zu einer potenziellen Krebsimmuntherapie führen. Die Live-Zell-Bildgebung bietet eine detaillierte Ansicht der zellulären Dynamik in Echtzeit und wurde verwendet, um Zellmigration, phäkotypisches Screening, Apoptose und Zytotoxizität8,9 in der Neurowissenschaft, Entwicklungsbiologie und Arzneimittelentdeckung zu untersuchen. Obwohl der vorgeschlagene Tumor in dieser Studie Brustkrebs ist, kann die Methode auch auf mehrere Zielzellen und verschiedene Effektorzellen angewendet werden.
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Protocol
HINWEIS: In den Abschnitten 1-6 wird das Cokulturmodell von 4T1-Maus-Mammakarzinomzellen und RAW 264.7-Mausmakrophagen beschrieben. Abschnitt 7 beschreibt die Zeitrafferbewertung von M1-Makrophagen, die 4T1-Zellen gephagogiert haben.
1. Culturing 4T1 Maus Mammakarzinom-Zellen und RAW 264.7 Maus Makrophagen
- Eine Durchstechflasche mit kryogen konservierten 4T1 und RAW 264.7 Durchgang 6 Zellen durch sanftes Rühren in einem Wasserbad bei 37 °C oder die normale Wachstumstemperatur für die Zelllinien auftauen.
HINWEIS: Das Auftauen sollte schnell erfolgen, ungefähr innerhalb von 2 min. Um eine Kontamination zu vermeiden, entfernen Sie die Durchstechflasche aus dem Wasserbad und dekontaminieren Sie sie durch Sprühen mit 70% Ethanol. Um genetische Drift, insbesondere für die Makrophagen, zu vermeiden, verwenden Sie eine niedrige Durchgangszahl (d. h. weniger als 20). - Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen in 10 ml komplettem DMEM-Medium in einem 15 ml konischen Rohr und zentrieren Sie die Zellen bei 600 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.
HINWEIS: Vollständiges DMEM-Medium, ergänzt durch 10% (v/v) fetales Rinderserum (FBS), 200 U/ml Penicillin/Streptomycin und 2 mM L-Glutamin wird im gesamten Protokoll verwendet. - Saugen Sie die Medien sorgfältig an, setzen Sie die Zellen in 8 ml komplettem Medium wieder ab und übertragen Sie sie in einen 25 cm2 Gewebekultur-behandelten Kolben. Kultur sowohl 4T1 als auch RAW 264.7 Zellen in komplettem DMEM-Medium bei 37 °C mit 5%CO2.
HINWEIS: Setzen Sie die Zellpellets sanft aus und fügen Sie die Zellsuspension Tropfen für Tropfen in den Kulturkolben ein, um das Abtöten der Zellen zu vermeiden. - Nach 1 Woche Kultivierung, um die Zellhaftung zu ermöglichen, überwachen Sie den Kolben täglich und fügen Sie bei Bedarf 8 ml komplettes DMEM-Medium hinzu.
2. Immunostainierung von m1 polarisierten RAW 264.7 Makrophagen
- Da die Konfluenz von RAW 264,7-Zellen 70 bis 80 % erreicht, entsorgen Sie die Kulturmedien und spülen Sie 2x vorsichtig mit mindestens 2 ml PBS ab.
HINWEIS: Stellen Sie vor dem Aussaat von RAW 264.7-Zellen sicher, dass keine Zelldifferenzierung stattgefunden hat (d. h. dendritenähnlicher Phänotyp und/oder erhöhte Zellgröße). Wenn Zellmorphologieänderungen sichtbar sind, verwerfen Sie die Kultur und tauen Sie eine neue Zelllinie aus der früheren Durchgangsdurchstecher auf. - Bereiten Sie die Makrophagen für die Sammlung vor, indem Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber entfernen und in ein 15 ml konisches Rohr übertragen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine Zellsuspension von 1 x 105 Zellen/Schale mit vollständigem DMEM-Medium vor.
- Samen 2 ml der Makrophagen Suspension in zwei bildgebende Gerichte. Inkubieren Sie die Zellen 2 x 3 h bei 37 °C mit 5%CO2, um die Zellhaftung zu ermöglichen.
- Bereiten Sie M1 Polarisationsmedien vor, indem Sie 100 ng/mL LPS und 20 ng/mL IFN-- in das komplette DMEM-Medium10,11einfließen lassen.
- Entsorgen Sie den Kulturüberstand aus den Makrophagen und waschen Sie die Monolayer in der Schale sorgfältig 2x mit mindestens 1 ml PBS.
- Fügen Sie 2 ml M1-Polarisationsmedien in eines der bildgebenden Schalen ein, lassen Sie die RAW 264.7-Zellen den M1-Makrophagen-Phänotyp induzieren und 2–3 h bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: Seed RAW 264.7 Makrophagen in einer bildgebenden Schale mit DMEM ergänzt mit 10% FBS als Kontrolle für die Anti-iNOS-Antikörperfärbung. Beschriften Sie die bildgebenden Schalen RAW (Steuerung) bzw. M1-Makrophagen (LPS und IFN--Polarisierte). - Fixieren Sie vor der Immunfärbung die Makrophagenzellen RAW 264.7 und M1 mit 2 ml 4% Paraformaldehyd und inkubieren Sie 15 min bei 37 °C (Raumtemperatur, RT).
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS mindestens 3x.
- Mit 2 ml 50 ml Ammoniumchlorid in PBS abstellen und 15 min bei RT inkubieren.
- Permeabilisieren Sie mit 2 ml von 0,3% Triton X-100 in PBS für 15 min bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS mindestens 3x.
- Block mit 2 ml von 10% FBS in PBS für 30 min bei RT.
HINWEIS: Der Blockierender Schritt bei der Immunfärbung besteht darin, die unspezifische Bindung von Antikörpern innerhalb der Zelle zu minimieren. - Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS mindestens 3x.
- Inkubieren Sie mit 2 ml Anti-iNOS-FITC in PBS und 1% FBS über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Beschriften Sie die Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit der entsprechenden Antikörperverdünnung. Schützen Sie die Teller vor Licht, indem Sie sie von diesem Punkt an mit Aluminiumfolie bedecken. - Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellmonoschicht mit 1 ml PBS mindestens 3x.
- 1 ml 300 nM 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in bildgebende Schalen für 10 min bei 37 °C inkubieren, im Dunkeln durch Bedeckung mit Aluminiumfolie.
- Waschen Sie Zellen mit 1 ml PBS mindestens 3x und fügen Sie 1 ml komplettes DMEM-Medium in die bildgebenden Schalen ein.
HINWEIS: Die Zellen sind jetzt bereit für die Fluoreszenz-Bildgebung. Das Mikroskop-Setup benötigt eine invertierte Stufe und Anregungsfilter für die ausgewählten Flecken (in diesem Fall FITC und DAPI). - Schalten Sie das Mikroskop ein und laden Sie die Bildgebungssoftware. Montieren Sie die Bildform am Mikroskop und passen Sie den Fokus an RAW 264.7- und M1-Makrophagen an. Optimieren Sie das Erscheinungsbild von Phasenkontrast-FITC- und DAPI-Bildern, indem Sie die übertragenen Licht- und Belichtungszeiten anpassen.
HINWEIS: Beginnen Sie mit der Bildgebung, wenn alle Punkte im Fokus sind und die Kanäle optimiert sind. - Erfassen von FITC- und DAPI-Bildern mit Phasenkontrast (Abbildung 1).
3. Seeding 4T1 Maus Mammakarzinom-Zellen
- Wenn die Konfluenz von 4T1-Zellen 70 bis 80% erreicht, entsorgen Sie die Kulturmedien und spülen Sie 2x vorsichtig mit mindestens 2 ml PBS ab. Fügen Sie 1 ml vorgewärmtes Trypsin hinzu, um die Zellen zu dissoziieren und bis zu 20 min bei 37 °C zu brüten.
HINWEIS: Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop. Getrennte Zellen werden gerundet. - Sobald sich die Zellen lösen, übertragen Sie sie in ein 15 ml konisches Rohr und fügen Sie 2 ml vorgewärmtes komplettes DMEM-Medium hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Verteilen Sie das Medium vorsichtig, indem Sie die Zellschichtoberfläche pipetieren, um die Zellen wiederherzustellen. Dann Zentrifuge bei 600 x g für 5 min, um ein Zellpellet zu erhalten.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 10 ml vorgewärmtem DMEM-Medium wieder auf.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Samen 1 x 105 4T1 Zellen in 2 ml komplettem DMEM-Medium in zwei 35 mm Glasboden-Bildgebungsschalen, die mit Gewebekultur behandelt werden. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C mit 5%CO2.
HINWEIS: Kultur 4T1-Zellen in einem der bildgebenden Schalen mit M1-Polarisationsmedien und Etikett 4T1-Inducer (Steuerung). Dies soll ein normales Wachstum von 4T1-Zellen gewährleisten, wenn es den Induktoren ausgesetzt ist.
4. Kennzeichnung lebender 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen mit CFSE-Färbung
- Entfernen Sie zunächst die vorhandenen Medien aus den 4T1-Zellen, die wärmende Schalen. Waschen Sie die Zellmonoschicht mindestens 2x mit 1 ml PBS.
- Bereiten Sie 5 M CFSE-Färbelösung vor, indem Sie CFSE in 1 ml PBS verdünnen. Fügen Sie in jeder Bildformschale 1 ml 5 M CfSE-Färbelösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen 20 min bei RT oder 37 °C im Dunkeln.
HINWEIS: Kennzeichnen Sie die Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers und vordere Experimente mit der entsprechenden CFSE-Arbeitskonzentration, um die optimale CFSE-Färbekonzentration zu erreichen. Die Kennzeichnungseffizienz wird höher sein, wenn CFSE in PBS verdünnt wird. - Die Färbung durch Zugabe eines gleichen Volumens des kompletten DMEM-Mediums, das 10% FBS enthält, und Färbelösung zu den Zellen und inkubieren für 5 min bei RT im Dunkeln.
- Entsorgen Sie die CFSE-haltige Lösung und waschen Sie die Zellen 1x mit einem gleichen Volumen an Kulturmedien.
HINWEIS: 4T1-Zellen sind jetzt fluoreszierend gekennzeichnet. - Bringen Sie die 4T1-CFSE-Zellen bei RT mit 5% CO2 auf Standardkulturbedingungenzurück.
5. Seeding RAW 264.7 MausMakropages und Cokultur mit 4T1
- Wenn die Konfluenz von RAW 264.7 7 70 bis 80% erreicht, entsorgen Sie die Kulturmedien und spülen Sie 2x vorsichtig mit mindestens 2 ml PBS ab.
- Bereiten Sie die Makrophagen für die Sammlung vor, indem Sie die anhaftenden Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber entfernen und in ein 15 ml konisches Rohr übertragen.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und bereiten Sie eine Zellsuspension von 1 x 105 Zellen/ml vor, indem Sie die verbleibende Lösung mit einem vollständigen DMEM-Medium entsprechend der Saatdichte verdünnen.
HINWEIS: Übermäßig konfluente Zellen in Kokulturen können die Phagozytose stark reduzieren. In dieser Studie wurde das Saatverhältnis von Makrophagen: Krebszellen auf ein Verhältnis von 1:1 angepasst. Das Verhältnis kann abhängig von der Aggressivität der Tumorzellen und dem Ursprung der Makrophagen angepasst werden. - Vor der Kokultivierung den Kulturüberstand aus den 4T1-Zellen, die einen Tag zuvor gesät wurden (Schritt 4.5), und die Monolayer sorgfältig 2x mit mindestens 1 ml PBS waschen.
- Samen 1 x 105 RAW 264,7 Zellen pro 2 ml komplettes DMEM-Medium in eines der 4T1-Bildschalen. Inkubieren Sie die Zellen 2 x 3 h bei 37 °C mit 5%CO2, um die Zellhaftung zu ermöglichen. Beschriften Sie die bildgebende Schale 4T1-M1 Cokultur.
HINWEIS: Die 4T1-Zellen (Steuerzellen) wurden nicht mit Makrophagen kokultiviert.
6. M1-Polarisation von RAW 264,7 Makrophagen
- Bereiten Sie M1 Polarisationsmedien vor, indem Sie 100 ng/mL LPS und 20 ng/mL IFN-- in das komplette DMEM-Medium hinzufügen, ergänzt durch 10% (v/v) FBS10,11.
- Entsorgen Sie den Kulturüberstand aus den zuvor inkubierten Makrophagen (Schritt 5.5) und waschen Sie die Monolayer in der Schale sorgfältig 2x mit mindestens 1 ml PBS.
- Fügen Sie dann 2 ml M1-Polarisationsmedien in die bildgebende Schale ein und lassen Sie die RAW 264.7-Zellen in den M1-Makrophagen-Phänotyp induzieren, indem sie bei 37 °C mit 5%CO2inkubieren.
HINWEIS: M1-Makrophagenzellen können eine Inkubationszeit von 2 bis 3 h aufnehmen, um eine vollständige Polarisation zu erreichen. Es müssen erste Experimente durchgeführt werden, um die geeignete Inkubationszeit zu gewährleisten, um eine vollständige Polarisation von Makrophagen zu ermöglichen.
7. Live-Zell-Videomikroskopie der Phagozytose
HINWEIS: Bei der Live-Zell-Bildgebung müssen viele Faktoren berücksichtigt werden, um ein produzierbares Video zu erhalten, einschließlich Optimierung der Bildbelichtung, Zeitmessung und automatische Fokuskorrektur.
- Richten Sie vor dem Experiment den Zellkultur-Inkubator ein, indem Sie den Thermostat bei 37 °C einschalten und 5%CO2liefern.
HINWEIS: Das Mikroskop-Setup erfordert eine invertierte Stufe, einen Bühnen-Inkubator, eine Feuchtigkeitskontrolle (95%) und ein Gasinkubationssystem. Dieses Setup ist entscheidend, um die Zellen für die langfristige Live-Zell-Videomikroskopie-Bewertung zu erhalten. - Schalten Sie das Mikroskop einschließlich der Piezo-Stufe ein und laden Sie die Mikroskop-Bildgebungssoftware.
- Positionieren Sie die gesäten Cokulturzellen in einer 35 mm Glasboden-Bildform in der Mitte der Bühne und schrauben Sie vorsichtig an der oberen Kammer. Verwenden Sie den Joystick, um die Bühne zu motorisieren, indem Sie die Position auswählen, die abgebildet werden soll.
- Um das Beispiel anzuzeigen, wählen Sie den Phasenkontrastfilter auf dem Turm aus. Suchen Sie nach dem ersten Betrachten des Beispiels die entsprechenden Felder, und fokussieren Sie die Probe.
HINWEIS: Die Imaging-Software ermöglicht die Verwendung einer vollautomatischen Objektivauswahl, des Perfect Focus Systems, der Zeitrafferserie, der Mehrkanal-Bildaufnahme und der Multipoint-Bildaufnahme. - Um die Mehrkanalfluoreszenz für die CFSE-Kennzeichnung und die Differenzenkontrasterfassung einzurichten, öffnen Sie das Dialogfeld zur Erfassung von Bildverarbeitungssoftware, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen [Lambda] (Abbildung 2).
HINWEIS: Für eine 13-h-Zeitraffer-Bildgebung sollte ein Phasenkontrastkanal verwendet werden. - Registerkarte [Lambda] auswählen | [Optische Konfiguration] und wählen Sie [10X DIC] für Differenzinterferenzkontrast und [GFP-R] für das Kontrollkästchen grüner Fluoreszenzfilter aus. Unter der [Lambda] | [Fokus], aktivieren Sie das Kontrollkästchen [10X DIC], das als Fokusreferenz festgelegt werden soll.
- Öffnen Sie das Dialogfeld zur Bildaufnahme und klicken Sie auf die Schaltfläche [XYZ Time ...] und wählen Sie die Registerkarte [XY].
- Wechseln Sie mit dem Joystick auf der motorisierten Bühne zum Bildaufnahmepunkt, während Sie das Livebild überprüfen, oder wählen Sie eine andere Position durch die Okularen aus. Klicken Sie dann auf das Kontrollkästchen unter der Spalte [Punktname], um jeden Punkt an jedem Ort für die Bildaufnahme festzulegen (siehe Abbildung 3).
HINWEIS: Die automatisierte Stufe ermöglicht die Mehrpunkt-Bildaufnahme verschiedener XY-Koordinaten, um mehrere Felder zu erfassen. - Optimieren Sie den Fokus für jedes auf dem Bildschirm angezeigte Sample. Verwenden Sie die Steuerelemente für die Autofokuskorrektur.
- Verwenden Sie die Software, um die Zeitraffer-Bildaufnahme einzurichten. Aktivieren Sie im Dialogfeld Für die Bildaufnahme die Registerkarte [Zeit] (siehe Abbildung 4).
- Bestimmen Sie das [Intervall] (die Verzögerung zwischen dem Beginn eines Zeitpunkts zu einem anderen Zeitpunkt) und [Dauer] (die Gesamtdauer des Experiments). Die Zeiteinheiten variieren und können in Millisekunden (ms), Sekunden (s), Minuten (m) oder Stunden (h) aus dem Dropdown-Menü ausgewählt werden.
HINWEIS: Die Zeitdauer für die Zeitraffer-Bildgebung von Fluoreszenz und DIC-Zeitraffer-Mehrkanalerfassung kann je nach dem in diesem Test verwendeten Fluoreszenzfarbstoff variieren. Photobleichungen können auftreten, wenn die beschrifteten Zellen zu lange freigelegt werden. - Aktivieren Sie das Kontrollkästchen [In Datei speichern], um aufgenommene Bilder zu speichern. Klicken Sie unter der Registerkarte [Zeitplan] auf die Schaltfläche [Jetzt ausführen], um Bilder aus mehrpunkten Zeitreihen zu erfassen (siehe Abbildung 5).
HINWEIS: In der Imaging-Software werden Bilder im nd2-Dateiformat gespeichert. Jeder Zeitraffer kann später einzeln in einem MP4-Dateiformat gespeichert werden.
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Representative Results
Die zeitraffigen zweidimensionalen (2D) Bilder des Cokulturmodells von 4T1 Maus-Mammakarzinom-Zelllinien zeigen die 4T1-Zellen, die während eines 13-Stunden-Zeitraums von M1-Makrophagen verschlungen werden. Es ist wichtig, eine vollständige Polarisation der M1-Makrophagen durch Immunfärbung zu gewährleisten. Die Ergebnisse (Abbildung 1) zeigen, dass die Konzentration von 100 ng/ml Lipopolysacchariden (LPS) und 20 ng/mL IFN--polarisierten RAW 264.7 Makrophagen in den M1-Zustand. Die Kennzeichnung der Zielzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff und das Unbefleckten der Effektorzellen ermöglicht ein Kokulturmodell mit lebenden Zellen (Film 1). Während des 13-Stunden- und 15-Minuten-Intervalls wurde die phagozytische Aktivität der M1-Makrophagen in der Kokultur mit den 4T1-Zellen dokumentiert (Film 2). Die sechs Mehrpunktvideos (A-F in Movie 2) wurden aufgezeichnet, um mehrere Ereignisse innerhalb einer einzigen 35-mm-Glasboden-Bildform zu bewerten. Film 3 zeigt die 4T1-Zellen, die von M1-Makrophagen phagozytosiert sind. Film 4 wurde als Beispiel für ein ausführliches Video ausgewählt, das aus diesem Experiment gefilmt wurde, und Film 5 zeigt die Aufnahme von 4T1-Zellen durch M1-Makrophagen.
Abbildung 1: Immunfluoreszenzfärbung mit Anti-iNOS-FITC in Grün, Kernmarker DAPI in blau und erweiterte Versionen von zusammengeführten Bildern. Diese Panels stellen RAW 264.7 Makrophagen (Steuerung) und M1-Makrophagen (LPS und IFN-stimuliert) immunstainiert mit Anti-iNOS-FITC (M1-Marker) in grün und gegenbefleckt mit Kernmarker, DAPI in blau. (A) DAPI-Färbung kann sowohl RAW 264.7 und M1 Makrophagen beobachtet werden. (B) Anti-iNOS-FITC (grün) nur fluoreszierend auf M1-Makrophagen. (C) Zusammengeführte Bilder von DAPI-Färbung und Anti-iNOS-FITC. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Einrichten von Fluoreszenz und DIC-Bildaufnahme in der Dialogsteuerung für die Bilderkennung von Software. [1] Aktivieren Sie das Kontrollkästchen [Lambda], [2] [Optische Konfiguration] und [10X DIC] und [GFP-R] für das Kontrollkästchen Grüner Fluoreszenzfilter, [3] [10X DIC] | [Stellen Sie diesen Kanal als Fokusreferenz ein]. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Einrichten der Multipoint-Bildaufnahme in der Dialogsteuerung für die Bilderkennung von Software. [4] Wählen Sie die Registerkarte [XY] und als nächstes [5] das Kontrollkästchen unter der Spalte [Punktname], um jeden Punkt für die Bildaufnahme festzulegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Einrichten von Intervallen und Dauer für die Zeitraffer-Messbildaufnahme. Die Dialogsteuerung zur Bilderfassung von Software zum Einrichten der Zeitraffer-Bildaufnahme. Um die Zeitraffer-Bildaufnahme [6] einzurichten, überprüfen Sie auf der Registerkarte [Zeit] [7] bestimmen Sie das [Intervall] (nach Sek., Min. oder Stunde) und [8] die [Dauer] (nach Sek., min oder Stunde). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Einrichten von Multipoint-Filmpanels für die Zeitraffer-Messung von Bildaufnahmen. Die Vorschau von sechs Multipoint-Filme Panels kombiniert nach Abschluss von 13 h Cokultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Film 1: Ein repräsentativer Film von ungefärbten M1-Makrophagen und 4T1 CFSE-gefärbten Maus-Mammakarzinomzellen in Derkokultur, der mittels Mehrkanalerfassung von Fluoreszenz- und DIC-Mikroskopie erfasst wurde. Die Ergebnisse zeigen CFSE in der grün beschrifteten Zellwand von 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen, die mit ungefärbten M1-Makrophagen kokultiviert sind. Die Zeitrafferbilder wurden für einen 13-stunden-Kokulturzeitraum mit 15 minuten Zeitintervallen mittels Mehrkanalerfassung (Schritt 7.3, siehe Abbildung 2) aufgenommen. (A) Differentialinterferenzkontrast (roter Kreis) zeigt kleine, runde M1-Makrophagen, die an die 4T1-Zellen anhaften, die eine epitheliale Morphologie aufweisen. (B) Ein Fluoreszenzmikroskopiebild von 4T1-Zellen, die mit CFSE vor der Phagozytose durch Makrophagen gefärbt sind. (C) Zusammengeführte DIC- und Fluoreszenzmikroskopiebilder von CFSE-gebeizten 4T1-Zellen, die von ungefärbten M1-Makrophagen verschlungen werden. Die blauen Pfeile zeigen ungefärbte M1-Makrophagen, die grün fluoreszieren, während sie CFSE-markierte 4T1-Zellen verschlingen. Skala Bar = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Film 2: Live-Zell-Videomikroskopie-Filme von mehreren Stufenpunkten in einer einzigen bildgebenden Schale, die Phagozytose von 4T1-Maus-Mammakarzinomzellen durch induzierte M1-Makrophagen zeigt. Die Ergebnisse stellen sechs verschiedene Punkte dar (Film 2A-F), die mit Bildgebungssoftware eingerichtet und koordiniert werden (Schritt 7.4, siehe Abbildung 3- Abbildung5). M1-Makrophagen haben eine unregelmäßige, pfannkuchenartige Morphologie mit einem porösen Zytoplasma, während 4T1-Maus-Mammakarzinome eine epitheliale Morphologie haben. M1-Makrophagen und 4T1-Zellen wurden 13 h lang im Stadiumdestauchzentrum bei 37 °C mit 5 %CO2 kokultiviert, bevor sie für die Live-Zell-Videomikroskopie beobachtet wurden. Die Bilder wurden in 15 min Zeitintervallen für 13 h aufgenommen. Scale bar = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Film 3: Live-Zell-Videomikroskopie-Film eines einzelnen Koordinatenpunkts (siehe Film 2), der ausgewählt wurde, um die Phagozytose von 4T1-Maus-Mammakarzinomen durch induzierte M1-Makrophagen im Detail zu zeigen. Der rote Pfeil zeigt Phagozytose. Der gelbe Kreis zeigt, dass die Anzahl der 4T1-Zellen, die die Verschlingen von 4T1-Zellen gelöscht. Skala Bar = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Film 4: Ein detailliertes Video zur weiteren Visualisierung des Phagozytose-Prozesses von 4T1-Zellen durch M1-Makrophagen. Dieses Panel zeigt lebende M1-Makrophagenzellen mit einem porösen Zytoplasma-Phänotyp. Skala Bar = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Film 5: Makrophagen bewegen sich in Richtung 4T1-Zellen, um einen Zell-zu-Zell-Kontakt herzustellen, gefolgt von der Aufnahme von 4T1-Zellen durch M1-Makrophagen (siehe Film 2A). Das Phase-Kontrast-Zeitraffer-Zeitraffer-Video wurde in 15 min Zeitintervallen für 13 h Cokultur in einem Bühnen-Top-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2abgebildet. Skala Bar = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Das beschriebene Protokoll erfordert zwei Schritte: 1) Kokultur von 4T1 Maus-Mammakarzinomzellen und M1-polarisierten Makrophagen und 2) Bewertung der phagozytischen Makrophagenaktivität mittels Zeitraffermikroskopie. Live-Zell-Kokultur ist weit verbreitet in Phagozytose und Migration Assays verwendet. Das Live-Zell-Kokulturmodell ist hier ein einfaches, anpassungsfähiges In-vitro-Verfahren (Abbildung 2), das einen fluoreszierenden Farbstoff CFSE verwendet, der zur Kennzeichnung der 4T1-Zielzellen verwendet wird. Dies wird für die korrekte Verfolgung der Zelltypen während der Live-Zell-Bildgebung verwendet. Die Zeitraffer-Livezellbildgebung wurde verwendet, um die phagozytische Aktivität von M1-Makrophagen mittels Multipoint-Zeitraffer-2D-Bildgebung vor den 13 h der Kokultur zu bewerten.
Das Modell der Live-Zell-Kokultur wurde mit 4T1-Maus-Mammakarzinomzellen und M1-Mausmakrophagen erstellt. Um die Zellen voneinander zu unterscheiden, wurden 4T1-Zellen mit einem CFSE-Fluoreszenzfarbstoff gefärbt (siehe Abschnitt 4). CFSE ermöglicht die Nachverfolgung der Zellen und die Überwachung der Zellteilung. CFSE kann passiv in Zellen diffundieren, was CFSE-Färbung zu einem geeigneten Zelltracker macht, um die Phagozytose von Zielzellen zu visualisieren. Wenn phagozytische Makrophagen Krebszellen verdauen und verschlingen, nehmen sie den CFSE-Farbstoff auf und werden schließlich fluoreszierend12,13. Es ist wichtig, 4T1-Zellen in der bildgebenden Schale vor den M1-Makrophagen auszusäen. Dies ist auf die unterschiedlichen Größen und Formen beider Zellen zurückzuführen. Die 4T1-Zellen haben eine epitheliale Morphologie, die sich in kleinen Clustern vermehrt. Außerdem müssen die 4T1-Zellen vor der Kokultur mit den ungefärbten M1-Makrophagen mit CFSE befleckt werden. Vor der Makrophagenpolarisation mit LPS und IFN-A sind die murinen Makrophagen RAW 264.7 rund, klein und wachsen in der Regel als Einzelzellen. Nach der LPS- und IFN-Polarisation haben induzierte M1-Makrophagen eine relativ abgeflachte, pfannkuchenartige Form mit einem porösen Zytoplasma14,15. Um eine ordnungsgemäße Polarisation von RAW 264.7 in Richtung M1-Zustand zu gewährleisten, wurden 100 ng/mL LPS und 20 ng/mL IFN-stimulierte Makrophagen mit einem M1-Marker immunstainiert, Anti-iNOS-Antikörper konjugiert mit FITC (Abbildung 1). Dieses Protokoll wird vor der Kokultivierung der Makrophagen und Zielzellen durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Makrophagen vollständig in den M1-Zustand polarisiert werden.
Diese Studie beschreibt eine Methode für die fluoreszierende Mikroskopie, um die phagozytische Aktivität lebender Makrophagen zu visualisieren. Um Photobleichungen zu minimieren und eine bessere Fluoreszenz-Bildgebung zu ermöglichen, kann die Fluoreszenzmikroskopie mit anderen bildgebenden Verfahren kombiniert werden, die dem Fluorchrom ähnlich wie DIC nicht destruktiv sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Materialien und Methoden, die für die Beurteilung der Phagozytose von Maus-Mammakarzinomzellen durch LPS und IFN-stimulierte Makrophagen mittels fluoreszierender und DIC-Zeitraffermikroskopie erforderlich sind. Dennoch haben fluoreszierende Mikroskopiestudien Bei der Untersuchung der Live-Zell-Bildgebung Im Vergleich zur Phase-Kontrast-Zeitraffer-Bildgebung Grenzen. Bei der fluoreszierenden Live-Zell-Bildgebung kann eine längere Exposition gegenüber einer hohen Menge an Anregungslicht schwere Zellschäden verursachen16. Photobleaching kann erhebliche Probleme bei der Bildgebung von Lebendenzellen verursachen. Die hochintensive Beleuchtung, die in der Live-Zell-Bildgebung verwendet wird, kann die Fluoresenfähigkeit von CFSE-Farbstoffen verringern. Dennoch wurde im zweiten Teil dieser Studie eine 13-h-Phagozytose-Bewertung mit Phase-Kontrast-Zeitraffer-2D-Bildgebung(Filme 2–5) durchgeführt.
Die Zeitraffermikroskopie bietet Vorteile wie die Generierung von Daten aus einem einzigen Experiment zu jedem Beliebigen während des gewünschten Zeitraums und signifikant können mehrere Stufenpunkte innerhalb einer einzelnen Bildform für ein einzelnes Experiment erfasst werden. Dies ermöglicht die Beobachtung verschiedener Positionen in einem einzigen Experiment. Das Protokoll kann auch mit mehreren Brunnen von Kulturplatten (z.B. 6, 24, 96 Wellplatten) verwendet werden. Zu den wichtigsten technischen Herausforderungen für erfolgreiche Live-Zell-Bildgebungsexperimente gehört die Aufrechterhaltung der Zellen in einem gesunden Zustand, indem ein Bühnen-Inkubator verwendet wird, um eine stabile Temperatur von 37 °C, 95 % der Luftfeuchtigkeit und 5 %CO2zu gewährleisten. Da das Experiment 13 stunden dauerte, war es entscheidend, dass das Mikroskop durchweg normal funktioniert.
Während dieser Studie wurden sechs verschiedene Punkte in der bildgebenden Schale während einer Dauer von 13 h für 15 min Intervalle pro Punkt erfasst (Film 2). Die Punkte können je nach Ereignis der untersuchten Zelle angepasst werden. Wenn man bedenkt, dass es mehrere Stufenpunkte gibt, die während dieses Experiments erfasst werden müssen, ist es wichtig sicherzustellen, dass jeder Punkt einen stabilen Fokus hat, bevor die Live-Zell-Videoaufzeichnung durchgeführt wird. Das Zeitintervall für die Untersuchung muss optimiert werden. Ein verringertes Zeitintervall weist detailliertere Punkte auf, die abgebildet werden können. Die Dateigröße ist jedoch sehr groß. Das Erhöhen des Zeitintervalls führt zu einem langen Video und führt dazu, dass der Film an Kontinuität verliert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800 finanziert. Wir danken dem Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) Laboratorien und Mikroskopie-Bildgebungsanlage. Besonderer Dank geht an Mohd Daniel Hazim für die Hilfe bei der Bearbeitung und Aufnahme des experimentellen Videos für diese Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
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