Summary
Makrofage fagocytos aktivitet mot cancerceller, specifikt 4T1 mus bröstcancerceller, var avbildad i denna studie. Den levande cell coculture modellen fastställdes och observerades med hjälp av en kombination av fluorescerande och differentiell interferens kontrast mikroskopi. Denna bedömning avbildades med hjälp av avbildningsprogram för att utveckla Multipoint Time-lapse video.
Abstract
Tumör-associerade makrofager (TAMs) har identifierats som en viktig komponent för tumörtillväxt, invasion, metastaser, och resistens mot cancerterapier. Emellertid, tumör-associerade makrofager kan vara skadligt för tumören beroende på tumören mikromiljö och kan reversibelt förändra deras fenotypiska egenskaper genom att antingen motarbeta den cytotoxiska aktiviteten av immunceller eller förbättra anti-tumörrespons. De molekylära åtgärderna för makrofager och deras interaktioner med tumörceller (t. ex. fagocytos) har inte studerats ingående. Därför är samspelet mellan immunceller (M1/M2-subtyp Tam) och cancerceller i tumören mikromiljö nu ett fokus för cancer immunterapi forskning. I den nuvarande studien, en levande cell samodling modell av inducerad M1 makrofager och mus bröst 4T1 carcinoma celler utvecklades för att bedöma fagocytos aktivitet av makrofager med hjälp av en time-lapse video funktion med hjälp av fas-kontrast, fluorescerande, och differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi. Den nuvarande metoden kan observera och dokumentera Multipoint Live-cell Imaging av fagocytos. Fagocytos av 4T1 celler av M1 makrofager kan observeras med hjälp av fluorescerande mikroskopi innan färgning 4T1 celler med karboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). Den aktuella publikationen beskriver hur man samodlar makrofager och tumörceller i en enda avbildning skålen, polarisera M1 makrofager, och spela in Multipoint händelser av makrofager uppsluka 4T1 celler under 13 h av coculture.
Introduction
Makrofager är den första raden av immunförsvaret och spela en roll i Iscensätt immunsvar mot patogener och främmande material, inklusive cancerceller. De är en specialiserad fagocyt som förstör och blir av med oönskade partiklar i kroppen. Makrofager bidra defensiva funktioner såsom clearance av apoptotiska celler och mikroorganismer och rekrytering av andra immunceller1. Makrofager kan differentiera i två olika typer, M1 och m2 makrofager, som svar på Miljösignaler2. M1-polariserade makrofager (dvs. klassiskt aktiverade makrofager) aktiveras av cytokin interferon-γ (IFN-γ) och lipopolysackarider (LPS) och är involverade i den inflammatoriska reaktionen, patogen clearance, effektiv fagocytos, och tumoricidal immunitet3,4. Den m2 makrofager är nära besläktade med tumör-associerade makrofager (TAMs) och har anti-inflammatoriska och tumörfrämjande egenskaper4.
Fagocytos, härstammar från antikens grekiska (phagein), som betyder "att sluta", (kytos), som betyder "cell" och-Osis, som betyder "process"5. Fagocytos är en receptor-medierad process där fagocyter (inklusive makrofager, monocyter, och neutrofiler) döda och uppslukar invaderande patogener, städa upp främmande partiklar, och klar apoptotiska cell skräp. Tumör-associerade makrofager (Tams) finns i stroma i olika tumörer, inklusive bröstcancer, och har Pro-tumör funktioner6,7, vilket resulterar i resistens mot fagocytos. Den detaljerade mekanismen för tumör cell fagocytos av makrofager är ännu inte förstått.
Denna studie presenterar en två-stegs metod: 1) 4T1 mus bröstcancerceller och M1-polariserade makrofager är coculodlade, och 2) den fagocytiska aktiviteten av makrofager bedöms med hjälp av levande cell video mikroskopi. Cfse fluorescerande färgämne användes för att färga 4T1 mus bröst carcinoma celler. Fläcken etiketter 4T1 celler för att skilja dem från coculodlade M1 makrofager inom en enda avbildning skålen. RÅ 264,7 makrofager är polariserat med LPS och IFN-γ till en M1 fenotyp. För att säkerställa en fullständig polarisering, immunofärgning med anti-iNOS antikropp konjugerat till FITC utfördes. Därefter, en Multipoint serie av tidsförlopp bilder förvärvades för att observera flera händelser, inklusive fagocytos, inom coculture.
En bättre förståelse av samspelet mellan tumörceller och makrofager kan leda till potentiell cancer immunoterapi. Live-cell Imaging erbjuder en detaljerad bild av cellulära dynamik i realtid inställning och har använts för att studera cell migration, fenotypisk screening, apoptos, och cytotoxicitet8,9 i neurovetenskap, utvecklingsbiologi, och Drug discovery. Även om den föreslagna tumören i denna studie är bröstcancer, metoden kan också tillämpas på flera målceller och distinkta effektorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: avsnitten 1 − 6 beskriva coculture modell av 4T1 mus bröstcancerceller och rå 264,7 mus makrofager. Avsnitt 7 beskriver tidsförlopp bedömning av M1 makrofager fagocyterade 4T1 celler.
1. culturing 4T1 mus bröstcancerceller och RAW 264,7 mus makrofager
- Tina en injektionsflaska av cryogenically bevarade 4T1 och rå 264,7 passage 6 celler av mild agitation i ett vattenbad vid 37 ° c eller den normala tillväxt temperaturen för cellinjer.
Anmärkning: upptinning bör ske snabbt, ungefär inom 2 min. För att undvika kontaminering, ta bort injektionsflaskan från vattenbadet och sanera den genom att spraya med 70% etanol. För att undvika genetisk drift, särskilt för makrofager, använda ett lågt passage nummer (dvs., mindre än 20). - Späd ut de tinade cellerna i 10 mL komplett DMEM-medium i ett 15 mL koniskt rör och centrifugera cellerna vid 600 x g i 5 minuter för att erhålla en cellpellet.
Anmärkning: komplett DMEM medium kompletterat med 10% (v/v) fetalt bovint serum (FBS), 200 U/mL penicillin/streptomycin, och 2 mM L-glutamin används i hela protokollet. - Noggrant aspirera media, Omsuspendera cellerna i 8 mL av hela mediet och överför till en 25 cm2 vävnadsodling behandlad kolv. Kultur både 4T1 och rå 264,7 celler i komplett DMEM medium vid 37 ° c med 5% CO2.
Obs: Omsuspendera cellen pellets försiktigt och tillsätt cellsuspensionen i kulturen kolven droppe för droppe för att undvika att döda cellerna. - Efter 1 veckas odling för att möjliggöra cellföljsamhet, övervaka kolven dagligen och tillsätt 8 mL komplett DMEM-medium efter behov.
2. immunofärgning av M1 polariserande rå 264,7 makrofager
- Som confluency av rå 264,7 celler når 70 − 80%, kassera kulturen media och skölj försiktigt 2x med minst 2 mL PBS.
Obs: innan sådd rå 264,7 celler, se till att ingen celldifferentiering har inträffat (dvs Dendrite-liknande fenotyp och/eller ökad Cellstorlek). Om cellmorfologi förändringar är synliga, kasta kulturen och Tina en ny cellinjer från den tidigare passage injektionsflaskan. - Förbered makrofager för insamling genom att försiktigt lossnar de anhängare celler med hjälp av en cell skrapa och överföra dem till en 15 ml koniskt rör.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern och förbereda en cellsuspension av 1 x 105 celler/skålen med hjälp av komplett DMEM medium.
- Utsäde 2 mL av makrofager suspensionen i två avbildning rätter. Inkubera cellerna 2 − 3 h vid 37 ° c med 5% CO2 för att möjliggöra cellföljsamhet.
- Förbered M1-polariseringsmedia genom att tillsätta 100 ng/mL LPS och 20 ng/mL IFN-γ i fullständigt DMEM-medium10,11.
- Kassera kultur supernatanten från makrofager och tvätta omsorgsfullt enskiktslager i skålen 2x med minst 1 ml PBS.
- Tillsätt 2 mL M1-polariseringsmedia i en av bild rätterna, låt de råa 264,7-cellerna framkalla den M1-makrofagfenotypen och inkubera 2 – 3 h vid 37 ° c med 5% CO2.
Anmärkning: utsäde rå 264,7 makrofager i en avbildning skålen med DMEM kompletteras med 10% FBS som en kontroll för anti-iNOS antikropp färgning. Märk Imaging rätter RAW (kontroll) och M1 makrofager (LPS och IFN-γ polariserande), respektive. - Före immunofärgning, fixera de råa 264,7-och M1-makrofager cellerna med 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD och inkubera i 15 min vid 37 ° c (rumstemperatur, RT).
- Ta bort supernatanten och tvätta cellen enskiktslager med 1 ml PBS minst 3x.
- Quench med 2 mL 50 mM ammoniumklorid i PBS och inkubera i 15 minuter vid RT.
- Permeabilize med 2 mL 0,3% Triton X-100 i PBS för 15 min vid RT.
- Ta bort supernatanten och tvätta cellen enskiktslager med 1 ml PBS minst 3x.
- Blockera med 2 mL 10% FBS i PBS i 30 minuter vid RT.
Anmärkning: blockerande steg i immunofärgning är att minimera den icke-specifika bindningen av antikropp i cellen. - Ta bort supernatanten och tvätta cellen enskiktslager med 1 ml PBS minst 3x.
- Inkubera med 2 mL anti-iNOS-FITC i PBS och 1% FBS över natten vid 4 ° c.
Märk: Märk cellerna med lämplig antikropps utspädning enligt tillverkarens rekommendationer. Skydda rätter från ljus genom att täcka dem med aluminiumfolie från denna punkt på. - Ta bort supernatanten och tvätta cellen enskiktslager med 1 ml PBS minst 3x.
- Inkubera 1 mL 300 nM 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i Imaging rätter för 10 min i 37 ° c, i mörkret genom att täcka med aluminiumfolie.
- Tvätta celler med 1 mL PBS minst 3x och tillsätt 1 mL komplett DMEM-medium i bild rätterna.
Cellerna är nu klara för fluorescensavbildning. Mikroskopet Setup kommer att behöva en inverterad skede och excitation filter för de valda fläckar (i detta fall, FITC och DAPI). - Slå på mikroskopet och ladda bildprogram varan. Montera bild skålen på mikroskopet och justera fokus för att observera rå 264,7 och M1 makrofager. Optimera visningen av fas-Contrast FITC-och DAPI-bilder genom att justera genomlysnings-och exponeringstider.
Obs: börja avbilda när alla punkter är i fokus och kanalerna är optimerade. - Capture fas-Contrast FITC och DAPI bilder (figur 1).
3. sådd 4T1 mus bröstcancerceller
- Som confluency av 4T1 celler når 70 − 80%, kassera kulturen media och skölj försiktigt 2x med minst 2 mL PBS. Tillsätt 1 ml föruppvärmd trypsin för att separera cellerna och inkubera i upp till 20 min vid 37 ° c.
Obs: Observera cellerna under ett mikroskop. Lossna celler kommer att avrundas. - När cellerna lossnar, överför dem till ett 15 ml koniskt rör och tillsätt 2 ml föruppvärmd komplett DMEM medium för att inaktivera trypsin. Skingra försiktigt mediet genom att Pipettera cell lagrets yta för att återvinna cellerna. Sedan Centrifugera vid 600 x g i 5 min för att få en cellpellet.
- Avlägsna supernatanten och Omsuspendera pelleten i 10 mL förvärmd komplett DMEM-medium.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern och utsäde 1 x 105 4T1 celler i 2 ml komplett DMEM medium i varje 2 35 mm glasbotten avbildning rätter behandlade med vävnad kultur. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° c med 5% CO2.
Obs: kultur 4T1 celler i en av de Imaging rätter med M1 polariserings medier och etikett 4T1-inducerare (kontroll). Detta för att säkerställa normal tillväxt av 4T1 celler när de utsätts för inducerare.
4. märkning levande 4T1 mus bröst carcinom celler med cfse färgning
- Först, ta bort befintliga media från 4T1 celler Imaging rätter. Tvätta cellen enskiktslager minst 2x med 1 ml PBS.
- Bered 5 μM CFSE-färgningslösning genom att späda CFSE i 1 mL PBS. Tillsätt 1 mL 5 μM KLORFÄRGNINGSLÖSNING i varje avbildnings maträtt och inkubera cellerna i 20 minuter vid RT eller 37 ° c, i mörker.
Märk: Märk cellerna med hjälp av lämplig koncentration av CFSE i enlighet med tillverkarens rekommendationer och preliminära experiment för att få den optimala infärgning koncentrationen. Märknings effektiviteten blir högre om CFSE späds ut i PBS. - Släcka infärgning genom att tillsätta en lika stor mängd komplett DMEM-medium som innehåller 10% FBS och infärgnings lösning till cellerna och inkubera i 5 minuter vid RT i mörker.
- Kassera den CFSE-innehållande lösningen och tvätta cellerna 1x med en lika mängd odlingsmedier.
Notera: 4T1-celler är nu fluorescerande märkta. - Returnera 4T1-CFSE-cellerna till standard odlingsförhållanden vid RT med 5% CO2.
5. sådd rå 264,7 mus makrofager och samodling med 4T1
- Som confluency av rå 264,7 nå 70 − 80%, kassera kulturmedia och skölj försiktigt 2x med minst 2 mL PBS.
- Förbered makrofager för insamling genom att försiktigt lossnar de anhängare celler med hjälp av en cell skrapa och överföra dem till en 15 ml koniskt rör.
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometern och förbereda en cellsuspension av 1 x 105 celler/ml genom att späda den återstående lösningen med en komplett DMEM medium enligt sådd densitet.
Anmärkning: alltför konfluenta celler i samkulturer kan kraftigt minska fagocytos. I denna studie, den sådd förhållandet mellan makrofager: cancerceller justerades till en 1:1 ratio. Förhållandet kan justeras beroende på aggressiviteten hos tumörcellerna och ursprunget av makrofager. - Innan coculturing, kassera kulturen supernatanten från 4T1 celler seedade en dag före (steg 4,5) och noggrant tvätta enskiktslager 2x med minst 1 ml PBS.
- Utsäde 1 x 105 rå 264,7 celler per 2 ml komplett DMEM medium i en av de 4T1 Imaging rätter. Inkubera cellerna 2 − 3 h vid 37 ° c med 5% CO2 för att möjliggöra cellföljsamhet. Märk bild skålen 4T1-M1 coculture.
Anmärkning: 4T1 (kontroll) cellerna var inte coculodlade med makrofager.
6. M1 polarisering av rå 264,7 makrofager
- Förbered M1-polariseringsmedia genom att tillsätta 100 ng/mL LPS och 20 ng/mL IFN-γ i komplett DMEM-medium kompletterat med 10% (v/v) FBS10,11.
- Kassera kulturen supernatanten från makrofager inkuberas före (steg 5,5) och tvätta noggrant enskiktslager i skålen 2x med minst 1 ml PBS.
- Tillsätt sedan 2 mL M1-polariseringsmedia i avbildnings skålen och låt de råa 264,7-cellerna inducera in i M1-makrofagfenotypen genom att inkuberas vid 37 ° c med 5% CO2.
Obs: M1 makrofager celler kan ta upp 2 − 3 h av inkubering för att uppnå fullständig polarisering. Preliminära experiment måste göras för att säkerställa lämplig inkubationstid för att möjliggöra fullständig polarisering av makrofager.
7. live-cell videomikroskopi av fagocytos
Obs: många faktorer måste övervägas när du utför live-cell Imaging för att få en producible video, inklusive optimering av bildexponering, tidmätning, och automatisk fokusering korrigering.
- Innan experimentet, Ställ in cellkulturen inkubator genom att vrida på termostat vid 37 ° c och levererar 5% CO2.
Obs: mikroskopet setup kräver ett inverterat skede, en scen Top inkubator, fuktkontroll (95%), och gas inkubations system. Denna inställning är avgörande för att bibehålla cellerna för långsiktig Live-cell video mikroskopi bedömning. - Slå på mikroskopet inklusive piezo scenen och ladda Mikroskop Imaging programvara.
- Placera seedade coculture celler i en 35 mm glasbotten avbildning skålen i mitten av scenen och försiktigt skruva på den övre kammaren. Använd joysticken för att motorisera scenen genom att välja den position som ska avbildas.
- Om du vill visa provet väljer du faskontrast filtret på revolvern. När du först har tittat på exemplet letar du rätt på lämpliga fält och tar med provet i fokus.
Obs: bildprogram tillåter användning av helt automatiserad mål urval, perfekt fokus system, Time-lapse serie, Multichannel bild förvärv, och Multipoint bild förvärv. - Om du vill ställa in flerkanalfluorescens för CFSE-märkning och differential störnings kontrast anskaffning öppnar du dialogrutan för hämtning av avbildningsprogram och väljer fliken [lambda] (bild 2).
Obs: för en 13 h tidsfördröjning avbildning, en fas-kontrast kanal bör användas. - Välj [lambda] Tab | [Optisk konfiguration] och välj [10X DIC] för differential störnings kontrast och [GFP-R] för den gröna fluorescensfilter kryssrutan. Enligt [lambda] | [Focus] markerar du kryssrutan [10X DIC] för att ange som fokus referens.
- Öppna dialogrutan hämtning av avbildningsprogram och klicka på knappen [XYZ Time...] och välj fliken [xy] .
- Flytta till bild insamlingsplatsen med hjälp av joysticken på den motoriserade scenen medan du kontrollerar Live-bilden eller väljer en annan position genom okularen. Klicka sedan på kryssrutan under kolumnen [Punktnamn] för att ange varje punkt på varje plats för Bildinsamling (se figur 3).
Obs: den automatiserade fasen tillåter Multipoint bild förvärv av olika XY koordinater för att fånga flera fält. - Finjustera fokus för varje prov som visas på skärmen. Använd kontrollerna för korrigering av automatisk fokusering.
- Använd programvaran för att ställa in tidsfördröjning bildfångst. Kontrollera fliken [tid] i dialogrutan hämtning av avbildningsprogram (se figur 4).
- Bestäm [intervall] (fördröjningen mellan början av en tidpunkt pekar på en annan tidspunkt) och [varaktighet] (den totala tiden för experimentet). Tidsenheter varierar och kan väljas i millisekunder (MS), sekunder (s), minuter (m) eller timmar (h) från den nedrullningsbara menyn.
Obs: bild periodlängden för tidsfördröjning avbildning av fluorescens och DIC Time-lapse flerkanals förvärv kan variera beroende på fluorescerande färgämne som används i denna analys. Foto blekning kan inträffa om de märkta cellerna exponeras för länge. - Markera kryssrutan [Spara till fil] för att spara förvärvade bilder. Under fliken [tidsschema] klickar du på knappen [Run now] för att hämta Multipoint Time Series-bilder (se figur 5).
Anm: i bildhanteringsprogrammet sparas bilder i nd2-format. Varje tidsfördröjning kan sparas individuellt i ett MP4-filformat senare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tid-lapse tvådimensionella (2D) bilder av coculture modell av 4T1 mus bröst carcinom cellinjer visar 4T1 celler som uppslukas av M1 makrofager under en 13 h period. Det är viktigt att säkerställa en fullständig polarisering av M1 makrofager genom att utföra immunofärgning. Resultaten (figur 1) visar att koncentrationen av 100 ng/ml lipopolysackarider (LPS) och 20 ng/ml IFN-γ POLARISERADE rå 264,7 makrofager till M1-staten. Märkning de riktade cellerna med en fluorescerande färg och lämnar effektor celler ofärdig tillåter en levande cell coculture modell (film 1). Under hela 13 h och 15 min intervall, den fagocytiska aktiviteten av M1 makrofager i samodling med 4T1 cellerna dokumenterades (film 2). De sex Multipoint-videorna (a − F i film 2) spelades in för att bedöma flera händelser inom en enda 35 mm glasbotten bild maträtt. Film 3 visar 4T1 celler fagocytos av M1 makrofager. Film 4 valdes som ett exempel på en djupgående video filmad från detta experiment och film 5 visar upptaget av 4T1 celler av M1 makrofager.
Figur 1: färgning av immunofluorescensteknik med anti-Inos-FITC i grönt, nuklei markör DAPI i blått och förbättrade versioner av sammanslagna bilder. Dessa paneler representerar rå 264,7 makrofager (kontroll) och M1 makrofager (LPS och IFN-γ stimuleras) immunostained med anti-iNOS-FITC (M1 markör) i grönt och motmålat med kärnor markör, DAPI i blått. (A) DAPI Stain kan OBSERVERAS både rå 264,7 och M1 makrofager. (B) anti-INOS-FITC (grön) endast fluorescerar på M1 makrofager. (C) sammanslagna bilder av DAPI Stain och anti-INOS-FITC. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: ställa in fluorescens och DIC bild förvärv i Imaging Software förvärv dialogrutan kontroll. [1] Markera kryssrutan [lambda] , [2] Välj [optisk konfiguration] och välj [10X DIC] och [GFP-R] för det gröna fluorescensfiltret, [3] Välj [10X DIC] | [Ställ in den här kanalen som fokus referens]. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: ställa in Multipoint bild förvärv i dialogrutan för hämtning av avbildningsprogram kontroll. [4] Välj fliken [xy] och nästa [5] Markera kryssrutan under kolumnen [punktnamn] för att ange varje punkt för bild fångsten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: ställa in intervaller och varaktighet för mätning av tidsförlopp bildtagning. Dialogrutan för insamling av avbildningsprogram för att ställa in Bildinsamling för tidsfördröjning. Om du vill ställa in tidsfördröjning bild förvärv [6] kontrollera på fliken [tid] [7] bestämma [intervall] (av SEC, min, eller timme) och [8] [varaktighet] (per sekund, min eller timme). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: ställa in Multipoint-filmpaneler för mätning av tidsförlopp bildtagning. Förhandsvisningen av sex Multipoint-filmer paneler kombinerade efter avslutad 13 h av samodling. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1: en representativ film av ofärgade M1 makrofager och 4T1 CFSE-färgade mus bröstcancerceller i samodling fångas med hjälp av flerkanals förvärv av fluorescerande och DIC mikroskopi. Resultat skylta CFSE i grön-märkta cellväggen i 4T1 mus bröstcancerceller coculodlade med ofärgade M1 makrofager. Tids fördröjnings bilderna förvärvades för en 13 h-samkulturperiod med 15 minuters tidsintervall med hjälp av flerkanals förvärv (steg 7,3, se figur 2). (A) differential interferens kontrast, (röd cirkel) visar små, runda M1 makrofager ansluter sig till 4T1 celler, som har en epitelial morfologi. Ben mikroskopi av fluorescensbilder av 4T1-celler som färgats med cfse före fagocytos genom makrofager. (C) sammanslagna DIC och fluorescens mikroskopi bilder av cfse-färgade 4T1 celler som uppslukas av ofärgade M1 makrofager. De blå pilarna visar ofärgade M1 makrofager fluorescera grönt som de uppsluka CFSE-märkta 4T1 celler. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Film 2: Live-cell video mikroskopi filmer från flera steg punkter i en enda avbildning skålen visar fagocytos av 4T1 mus bröstcancerceller genom inducerad M1 makrofager. Resultaten representerar sex olika punkter (film 2a − F) som inrättats och samordnats med hjälp av bildhanteringsprogram (steg 7,4, se figur 3−figur 5). M1 makrofager har en oregelbunden, pannkaka-liknande morfologi med en porös cytoplasma, medan 4T1 mus bröstcancer karcinom har en epitelial morfologi. M1 makrofager och 4T1 celler var coculodlas för 13 h inne i scenen inkubator vid 37 ° c med 5% CO2 innan observeras för Live-cell videomikroskopi. Bilder fångades på 15 min tidsintervall för 13 h. Scale bar = 50 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Film 3: Live-cell video Mikroskop film av en enda koordinat punkt (se film 2) valt att Visa fagocytos av 4T1 mus bröstcancer karcinom av inducerad M1 makrofager i detalj. Den röda pilen visar fagocytos. Den gula cirkeln visar att antalet 4T1 celler som släckte omvälvning av 4T1 celler. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Film 4: en detaljerad video för att ytterligare visualisera fagocytos processen av 4T1 celler av M1 makrofager. Denna panel visar levande M1 makrofag celler med en porös cytoplasma fenotyp. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Film 5: makrofager rör sig mot 4T1 celler för att upprätta cell-till-cell kontakt, följt av upptaget av 4T1 celler av M1 makrofager (se film 2a). Den fas-kontrast mikroskopi Time-lapse video var avbildas i 15 min tidsintervall för 13 h av samodling inuti en scen Top inkubator vid 37 ° c med 5% CO2. Scale bar = 10 μm. vänligen klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det protokoll som beskrivs kräver två steg: 1) samodling av 4T1 mus bröstcancerceller och M1-polariserade makrofager, och 2) bedömning av makrofagen fagocytos aktivitet med hjälp av Time-lapse mikroskopi. Levande cell coculture används ofta i fagocytos och migrationsanalyser. Den levande cell coculture modell här är en enkel, anpassningsbar in vitro-förfarande (figur 2) som använder ett fluorescerande färgämne, cfse, som används för att märka 4T1 riktade celler. Detta används för korrekt spårning av celltyper under levande cell avbildning. Time-lapse levande-cell tänkbar var använd till bedöma den fagocytic aktivitet av M1 makrofager användande Multipoint tid-förlopp 2D tänkbar framför den 13 h av coculture.
Live cell coculture modellen etablerades med hjälp av 4T1 mus bröst carcinoma celler och M1 mus makrofager. För att särskilja cellerna från varandra, färgas 4T1 celler med en CFSE fluorescerande färgämne (se avsnitt 4). CFSE möjliggör spårning av celler och övervakning celldelning. CFSE kan passivt sprida sig till celler, vilket gör att CFSE färgning en lämplig cell Tracker för att visualisera fagocytos av riktade celler. Som fagocytos makrofager smälta och uppsluka cancerceller, de tar upp cfse färgämne och så småningom bli fluorescerande12,13. Det är viktigt att utsäde 4T1 celler i Imaging skålen före M1 makrofager. Detta beror på de olika storlekarna och formerna av båda cellerna. Den 4T1 celler har en epitelial morfologi som sprider sig i små kluster. Dessutom måste 4T1-cellerna färgas med CFSE innan de samodlar med de obefläckade M1-makrofages. Innan makrofagpolarisering med LPS och IFN-γ, den murina makrofager rå 264,7 är runda, små, och brukar växa som enstaka celler. Efter LPS och IFN-γ polarisering, inducerade M1 makrofager har en relativt tillplattad, pannkaka-liknande form, med en porös cytoplasma14,15. För att säkerställa korrekt polarisering av rå 264,7 mot M1-stat var 100 ng/mL LPS och 20 ng/mL IFN-γ stimulerade makrofager immunfärgade med en M1-markör, anti-iNOS-antikropp konjugerad till FITC (figur 1). Detta protokoll utförs innan man coculturing makrofager och riktade celler för att säkerställa att makrofager är helt polariserade i M1-staten.
Denna studie beskriver en metod för fluorescerande mikroskopi att visualisera fagocytos aktivitet levande makrofager. För att minimera foto blekning och ge bättre fluorescens Imaging, kan fluorescerande mikroskopi kombineras med andra Imaging tekniker som är icke-förstörande till fluorochrome, liknande DIC. Det nuvarande protokollet beskriver de material och metoder som krävs för bedömning av fagocytos av mus bröstcancerceller av LP-skivor och IFN-γ stimulerade makrofager använder fluorescerande och DIC Time-lapse mikroskopi. Icke desto mindre, fluorescerande mikroskopi studier har begränsningar när man studerar Live-cell Imaging jämfört med fas-kontrast Time-lapse Imaging. Under fluorescerande levande cell avbildning, långvarig exponering för en hög mängd excitation ljus kan framkalla allvarlig cellskada16. Foto blekning kan orsaka betydande problem i Live-cell Imaging. Den högintensiva belysning som används i levande cell avbildning kan minska möjligheten för CFSE färgämne att fluorescera. Ändå, en 13 h fagocytos bedömning uppnåddes i den andra delen av denna studie med fas-kontrast Time-lapse 2D-avbildning (filmer 2 – 5).
Time-lapse mikroskopi erbjuder fördelar såsom generering av data från ett enda experiment när som helst under den önskade varaktighets perioden och avsevärt, kan flera steg punkter inom en enda avbildning skålen fångas för ett enda experiment. Detta möjliggör observation av olika positioner i ett enda experiment. Protokollet kan också användas med hjälp av flera brunnar från odlings plåtar (t. ex. 6, 24, 96 väl plattor). Bland de mest kritiska tekniska utmaningarna för att utföra framgångsrika Live-cell Imaging experiment ingår att upprätthålla cellerna i ett hälsosamt tillstånd genom att använda en scen Top inkubator att ge en stabil temperatur på 37 ° c, 95% av luftfuktigheten, och 5% CO2. Eftersom experimentet tog 13 h, se till att mikroskopet fungerar normalt hela var avgörande.
Under denna studie, sex olika punkter i Imaging skålen fångades under en 13 h varaktighet för 15 min intervall per punkt (film 2). Poängen kan justeras beroende på händelse av cellen under utredning. Med tanke på att det finns flera steg punkter som ska fångas under detta experiment, är det viktigt att se till att varje punkt har ett stabilt fokus innan du utför live-cell videoinspelning. Tidsintervallet för undersökningen måste optimeras. Ett minskat tidsintervall kommer att ha mer detaljerade punkter som kan avbildas; filstorleken kommer dock att vara mycket stor. Ökande tidsintervall kommer att resultera i en lång video och kommer att göra filmen förlora kontinuitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades ekonomiskt av Geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Vi vill tacka Agro-Biotechnology Institute, Malaysia (ABI) laboratorier, och mikroskopi Imaging anläggning. Speciellt tack till Mohd Daniel hazim för hjälp med redigering och inspelning av experimentell video för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
