Summary
Macrophage phagocytic aktivitet mot kreftceller, spesielt 4T1 mus melke kreftceller, ble avbildet i denne studien. Den levende celle coculture modellen ble etablert og observert ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende og differensial forstyrrelser kontrast mikroskopi. Denne vurderingen ble avbildet ved hjelp av bildeprogramvare for å utvikle multipunkt time-lapse video.
Abstract
Tumor-assosiert makrofager (TAMs) har blitt identifisert som en viktig komponent for tumor vekst, invasjon, metastasering, og motstand mot kreft terapi. Men tumor-assosiert makrofager kan være skadelig for svulsten avhengig av tumor mikromiljøet og kan reverserbart endre sine fenotypiske egenskaper ved enten antagonizing den cytotoksisk aktiviteten av immunceller eller forsterke anti-tumor respons. De molekylære handlingene til makrofager og deres interaksjon med tumorceller (f. eks, fagocytose) har ikke blitt grundig studert. Derfor samspillet mellom immunceller (M1/m2-under type TAM) og kreftceller i tumor mikromiljøet er nå et fokus for kreft immunterapi forskning. I denne studien, en levende celle coculture modell av indusert M1 makrofager og mus melke 4T1 kreftceller ble utviklet for å vurdere phagocytic aktiviteten til makrofager bruker en time-lapse video funksjon ved hjelp av fase-kontrast, fluorescerende, og differensial forstyrrelser kontrast (DIC) mikroskopi. Den nåværende metoden kan observere og dokumentere multipunkt Live-celle Imaging av fagocytose. Fagocytose av 4T1 celler av M1 makrofager kan observeres ved hjelp av fluorescerende mikroskopi før farging 4T1 celler med carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE). Den nåværende publikasjonen beskriver hvordan du coculture makrofager og tumorceller i en enkelt tenkelig parabol, polariserer M1 makrofager, og posten multipunkt hendelser av makrofager henger 4T1 celler i løpet av 13 h av coculture.
Introduction
Makrofager er den første linjen av immunforsvaret og spille en rolle i orkestrering immunresponser mot patogener og utenlandske materialer, inkludert kreftceller. De er en spesialisert phagocyte som ødelegger og blir kvitt uønskede partikler i kroppen. Makrofager bidrar med defensive funksjoner som clearance av apoptotisk celler og mikroorganismer og rekruttering av andre immunceller1. Makrofager kan differensiere til to forskjellige typer, M1 og m2 makrofager, som svar på Miljøsignaler2. M1-polarisert makrofager (dvs. klassisk aktiverte makrofager) aktiveres av cytokin interferon-γ (IFN-γ) og lipopolysaccharides (LPS) og er involvert i inflammatorisk respons, patogen klaring, effektiv fagocytose, og tumoricidal immunitet3,4. M2 makrofager er nært beslektet med tumor-assosiert makrofager (TAMs) og har anti-inflammatorisk og tumor forfremmelse egenskaper4.
Fagocytose, avledet fra antikkens greske (phagein), som betyr "å sluke" (kytos), som betyr "celle" og-Osis, som betyr "prosess"5. Fagocytose er en reseptor-mediert prosess der phagocytes (inkludert makrofager, monocytter, og nøytrofile) drepe og sluker invaderende patogener, rydde opp fremmede partikler, og klare apoptotisk celle rusk. Tumor-Associated makrofager (TAMs) er funnet i stroma i ulike svulster, inkludert brystkreft, og har Pro-tumor funksjoner6,7, noe som resulterer i resistens mot fagocytose. Den detaljerte mekanismen av tumor celle fagocytose av makrofager er ennå ikke forstått.
Denne studien presenterer en to-trinns metode: 1) 4T1 mus melke kreftceller og M1-polarisert makrofager er cocultured, og 2) den phagocytic aktiviteten til makrofager er vurdert ved hjelp av Live-celle video mikroskopi. CFSE fluorescerende fargestoff ble brukt til å beis 4T1 mus melke kreftceller. Flekken etikettene 4T1 celler for å skille dem fra cocultured M1 makrofager innenfor en enkelt tenkelig parabolen. RAW 264,7 makrofager er polarisert med LPS og IFN-γ til en M1 fenotype. For å sikre en fullstendig polarisering, immunostaining med anti-iNOS antistoff som ble bøyd til FITC ble utført. Deretter ble det anskaffet en flerpunkts serie med tidsforløpbilder for å observere flere hendelser, inkludert fagocytose, i coculture.
En bedre forståelse av samspillet mellom tumorceller og makrofager kan føre til potensiell kreft immunterapi. Live-celle Imaging gir en detaljert visning av mobilnettet dynamikk i sann tidsinnstilling og har blitt brukt til å studere celle migrasjon, fenotypiske screening, apoptose og cytotoksisitet8,9 i nevrovitenskap, utviklingspsykologi biologi og narkotika oppdagelse. Selv om den foreslåtte svulsten i denne studien er brystkreft, kan metoden også brukes på flere målceller og distinkte Effektor celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: avsnittene 1 − 6 beskriver den coculture modellen av 4T1-celler for brystkreft og RAW 264,7 muse makrofager. § 7 beskriver tidsforløp vurderingen av M1 makrofager phagocyted 4T1 celler.
1. dyrking 4T1 mus brystkreftceller og RAW 264,7 mus makrofager
- Tin et hetteglass med cryogenically bevart 4T1 og RAW 264,7 passasje 6 celler ved mild agitasjon i et vannbad ved 37 ° c eller normal vekst temperatur for cellelinjene.
Merk: tine bør gjøres raskt, ca innen 2 min. For å unngå forurensning, Fjern hetteglasset fra vannbadet og decontaminate det ved sprøyting med 70% etanol. For å unngå genetisk drift, spesielt for makrofager, bruk en lav passasje tall (dvs. mindre enn 20). - Fortynne tint celler i 10 mL komplett DMEM medium i en 15 mL konisk rør og sentrifuger cellene på 600 x g i 5 min for å få en celle pellet.
Merk: komplett DMEM medium supplert med 10% (v/v) Foster storfe serum (FBS), 200 U/mL penicillin/Streptomycin, og 2 mM L-glutamin brukes gjennom hele protokollen. - Nøye aspirer mediene, resuspend cellene i 8 mL av komplett medium og overføre til en 25 cm2 vev kultur behandlet kolbe. Kultur både 4T1 og RAW 264,7 celler i komplett DMEM medium ved 37 ° c med 5% CO2.
Merk: Resuspend celle pellets forsiktig og tilsett celle fjæringen i kultur flasken dråpe for dråpe for å unngå å drepe cellene. - Etter 1 uke med dyrking for å tillate celle overholdelse, overvåke flasken daglig og tilsett 8 mL komplett DMEM medium etter behov.
2. Immunostaining av M1 polarisert RAW 264,7 makrofager
- Som confluency av RAW 264,7-cellene når 70 − 80%, kast kultur mediene og skyll 2x forsiktig med minst 2 mL PBS.
Merk: før seeding RAW 264,7 celler, kontroller at ingen celle differensiering har skjedd (dvs. dendrit-lignende fenotype og/eller økt Cellestørrelse). Hvis celle morfologi endringer er synlige, forkaste kulturen og tine en ny cellelinje fra tidligere passasje hetteglasset. - Forbered makrofager for samlingen ved forsiktig dislodging de tilhenger cellene ved hjelp av en celle skraper og overføre dem til en 15 mL konisk rør.
- Telle cellene ved hjelp av en hemocytometer og forberede en celle suspensjon av 1 x 105 celler/parabol med komplett DMEM medium.
- Seed 2 mL av makrofager suspensjon i to Imaging retter. Ruge cellene 2 − 3 t ved 37 ° c med 5% CO2 for å tillate celle overholdelse.
- Forbered M1 polarisering Media ved å legge 100 ng/mL LPS og 20 ng/mL IFN-γ i fullstendig DMEM medium10,11.
- Kast kulturen supernatanten fra makrofager og vask forsiktig monolagere i parabolen 2x med minst 1 mL PBS.
- Tilsett 2 mL M1 polarisering Media i en av Imaging retter, la RAW 264,7 celler å indusere M1 macrophage fenotype, og ruge 2-3 h ved 37 ° c med 5% CO2.
Merk: Seed RAW 264,7 makrofager i en tenkelig parabolen med DMEM supplert med 10% FBS som en kontroll for anti-iNOS antistoff farging. Label Imaging retter RAW (kontroll) og M1 makrofager (LPS og IFN-γ polarisert), henholdsvis. - Før immunostaining reparerer du RAW 264,7 og M1 makrofager celler med 2 mL 4% paraformaldehyde og ruge i 15 min ved 37 ° c (romtemperatur, RT).
- Fjern supernatanten og vask celle monolag med 1 mL PBS minst 3x.
- Slukke med 2 mL 50 mM ammonium klorid i PBS og ruge i 15 min ved RT.
- Permeabilize med 2 mL 0,3% Triton X-100 i PBS for 15 min ved RT.
- Fjern supernatanten og vask celle monolag med 1 mL PBS minst 3x.
- Blokker med 2 mL 10% FBS i PBS for 30 min ved RT.
Merk: blokkerings trinnet i immunostaining er å minimere den ikke-spesifikke bindingen av antistoff i cellen. - Fjern supernatanten og vask celle monolag med 1 mL PBS minst 3x.
- Ruge med 2 mL anti-iNOS-FITC i PBS og 1% FBS over natten ved 4 ° c.
Merk: etiketten cellene ved hjelp av riktig antistoff fortynning i henhold til produsentens anbefalinger. Beskytt rettene fra lys ved å dekke dem med aluminiumsfolie fra dette punktet på. - Fjern supernatanten og vask celle monolag med 1 mL PBS minst 3x.
- Ruge 1 mL 300 nM 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i Imaging retter i 10 min i 37 ° c, i mørket ved å dekke med aluminiumsfolie.
- Vask celler med 1 mL PBS minst 3x og tilsett 1 mL komplett DMEM medium i tenkelig rettene.
Merk: cellene er nå klare for fluorescens avbildning. Mikroskop oppsettet vil trenge en invertert fase og eksitasjon filtre for de valgte flekkene (i dette tilfellet FITC og DAPI). - Slå på mikroskopet og Last inn bilde programvaren. Monter bilde retten på mikroskopet og Juster fokuset for å observere RAW 264,7 og M1 makrofager. Optimaliser utseendet på FITC-og DAPI-bilder i fase kontrast ved å justere de overførte lys-og eksponeringstidene.
Merk: Begynn bildebehandling når alle punktene er i fokus og kanalene er optimalisert. - Fang opp FITC-og DAPI-bilder i fase kontrast (figur 1).
3. seeding 4T1 mus melke kreftceller
- Etter hvert som confluency i 4T1-cellene når 70 − 80%, forkaster du kultur mediene og skyll 2x forsiktig med minst 2 mL PBS. Tilsett 1 mL prewarmed Trypsin for å distansere cellene og ruge i opptil 20 min ved 37 ° c.
Merk: Observer cellene under et mikroskop. Frakoblede celler vil bli avrundet. - Når cellene løsner, overføre dem til en 15 mL konisk rør og tilsett 2 mL prewarmed komplett DMEM medium for å deaktivere Trypsin. Forsiktig spre mediet ved å pipettering celle laget overflaten for å gjenopprette cellene. Deretter sentrifuger på 600 x g for 5 min for å få en celle pellet.
- Fjern supernatanten og resuspend pellet i 10 mL prewarmed komplett DMEM medium.
- Telle cellene ved hjelp av en hemocytometer og frø 1 x 105 4T1 celler i 2 ml komplett DMEM medium i hver av 2 35 mm glass-Bottom Imaging retter behandlet med vev kultur. Ruge cellene over natten ved 37 ° c med 5% CO2.
Merk: kultur 4T1 celler i en av Imaging retter med M1 polarisering Media og etiketten 4T1-induser (kontroll). Dette er for å sikre normal vekst av 4T1 celler når de utsettes for induktorer.
4. merking levende 4T1 mus melke kreftceller ved hjelp CFSE farging
- Først fjerne eksisterende medier fra 4T1 cellene Imaging retter. Vask celle monolag minst 2x med 1 mL PBS.
- Klargjør 5 μM med CFSE farge løsning ved å fortynne CFSE i 1 mL PBS. Tilsett 1 mL 5 μM CFSE farge løsning i hver bilde rett og ruge cellene i 20 min ved RT eller 37 ° c, i mørket.
Merk: etiketten cellene ved hjelp av passende CFSE arbeids konsentrasjon i henhold til produsentens anbefalinger og foreløpige eksperimenter for å oppnå optimal CFSE farging konsentrasjon. Merking effektivitet vil være høyere hvis CFSE er fortynnet i PBS. - Slukke det flekk av tilføyer en likeverdig kvantum av fullstendig DMEM medium inneholder 10% FBS og flekk løsning å cellene og ruge for 5 min for RT inne mørket.
- Kast den CFSE-inneholdende løsningen og vask cellene 1x med et likt volum av kultur medier.
Merk: 4T1-celler er nå fluorescensmerkete merket. - Returner 4T1-CFSE-cellene til standard kultur forhold ved RT med 5% CO2.
5. seeding RAW 264,7 mus makrofager og coculture med 4T1
- Når confluency til RAW 264,7 nå 70 − 80%, kast kultur mediene og skyll 2x forsiktig med minst 2 mL PBS.
- Forbered makrofager for samlingen ved forsiktig dislodging de tilhenger cellene ved hjelp av en celle skraper og overføre dem til en 15 mL konisk rør.
- Telle cellene ved hjelp av en hemocytometer og forberede en celle suspensjon av 1 x 105 celler/ml ved å fortynne den resterende løsningen med en komplett DMEM medium i henhold til seeding tetthet.
Merk: altfor confluent celler i cocultures kan sterkt redusere fagocytose. I denne studien, seeding forholdet mellom makrofager: kreftceller ble justert til en 1:1 ratio. Forholdet kan justeres avhengig av aggressivitet av tumorceller og opprinnelsen til makrofager. - Før coculturing, forkaste kulturen supernatanten fra 4T1 cellene seeded en dag før (trinn 4,5) og forsiktig vaske monolagere 2x med minst 1 mL PBS.
- Seed 1 x 105 RAW 264,7 celler per 2 ml komplett DMEM medium inn i en av 4T1 Imaging retter. Ruge cellene 2 − 3 t ved 37 ° c med 5% CO2 for å tillate celle overholdelse. Merk bilde parabolen 4T1-M1 coculture.
Merk: 4T1 (kontroll) cellene ble ikke cocultured med makrofager.
6. M1 polarisering av RAW 264,7 makrofager
- Forbered M1 polarisering Media ved å legge 100 ng/mL LPS og 20 ng/mL IFN-γ i komplett DMEM medium supplert med 10% (v/v)FBS.
- Kast kulturen supernatanten fra makrofager inkubert før (trinn 5,5) og vask forsiktig monolagere i parabolen 2x med minst 1 mL PBS.
- Deretter legger du til 2 mL M1 polarisering Media i tenkelig parabolen og la RAW 264,7 cellene å indusere i M1 macrophage fenotype ved incubating ved 37 ° c med 5% CO2.
Merk: M1 macrophage celler kan ta opp 2 − 3 timer inkubasjons for å oppnå fullstendig polarisering. Foreløpige eksperimenter må gjøres for å sikre den egnede inkubasjonsperioden for å tillate fullstendig polarisering av makrofager.
7. live-celle video mikroskopi av fagocytose
Merk: mange faktorer må vurderes når du utfører direkte celle bildebehandling for å få en produserbare video, inkludert optimalisering av bildeeksponering, tidsmåling og automatisk fokus korrigering.
- Før eksperimentet, sette opp cellen kultur inkubator ved å slå på termostat ved 37 ° c og leverer 5% CO2.
Merk: mikroskopet setup krever en invertert scene, en scene topp inkubator, fuktighet kontroll (95%), og gass inkubasjons system. Dette oppsettet er avgjørende for å opprettholde cellene for langsiktig Live-celle video mikroskopi vurdering. - Slå på mikroskopet, inkludert piezo fasen, og Last inn bilde programvaren for mikroskopet.
- Plasser seeded coculture cellene i en 35 mm glass-Bottom Imaging parabolen i midten av scenen og forsiktig skruen på øverste kammeret. Bruk styrespaken til å motorisere scenen ved å velge posisjonen som skal vises.
- Hvis du vil vise prøven, velger du filteret for fase kontrast på dreieskiven. Etter først å ha sett prøven, Finn de aktuelle feltene og Bring prøven i fokus.
Merk: Imaging programvare tillater bruk av helautomatisk objektiv valg, Perfect Focus system, time-lapse serien, flerkanals bildeoppkjøp, og multipunkt bildeoppkjøp. - Hvis du vil konfigurere flerkanals fluorescens for CFSE-merking og kontrast anskaffelse for differensial forstyrrelse, åpner du dialogboksen for innhenting av bildeprogramvare og velger avkrysningsruten [lambda] i kategorien (figur 2).
Merk: for 13 timer med tidsforløp bør du bruke en fase kontrast kanal. - Velg [lambda] -fanen | [Optisk konfigurasjon] og velger [10x dic] for differensial forstyrrelser kontrast og [GFP-R] for den grønne fluorescens Filter boksen. Under [lambda] | [Focus] -kolonnen, velger du avmerkingsboksen [10x dic] for å angi som fokus referanse.
- Åpen det tenkelig programvare oppkjøpet dialogue bokse med og falle i staver det [XYZ tid...] knapp og velge det [XY] tab.
- Flytt til bildet oppkjøpet punkt ved hjelp av joysticken på den motoriserte scenen mens du sjekker Live bildet eller velg en annen posisjon gjennom okularene. Deretter klikker du på avkrysningsruten under [punkt navn] -kolonnen for å angi hvert punkt i hvert sted for bildeopptak (se Figur 3).
Merk: den automatiserte fasen tillater multipunkt bilde anskaffelse av ulike XY-koordinater for å fange opp flere felt. - Finjuster fokuset for hvert utvalg som vises på skjermen. Bruk kontrollene på Auto-Focus korreksjon.
- Bruk programvaren til å konfigurere tidsforløp bildeopptak. I dialogboksen for bildebehandlingsprogramvare kan du se kategorien [tid] (se Figur 4).
- Bestem [intervall] (forsinkelsen mellom begynnelsen av et tidspunkt til et annet tidspunkt) og [varighet] (den totale tiden av eksperimentet). Tidsenhetene varierer og kan velges i millisekunder (MS), sekunder (er), minutter (m) eller timer (h) fra rullegardinmenyen.
Merk: Imaging perioden lengden for time-lapse Imaging av fluorescens og DIC time-lapse flerkanals oppkjøpet kan variere avhengig av fluorescerende fargestoff som brukes i denne analysen. Photobleaching kan oppstå hvis de merkede cellene vises for lenge. - Merk av i avkrysningsruten [Lagre til fil] for å lagre hentede bilder. Under [tidsplan] -fanen klikker du på [Kjør nå] -knappen for å kjøpe multipunkt tidsserie bilder (se figur 5).
Merk: i bildebehandlingsprogrammet lagres bildene i nd2 filformat. Hver tidsforløp kan lagres enkeltvis i et MP4-filformat senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den tidsforløp to-dimensjonale (2D) bilder av coculture modell av 4T1 mus brystkreft cellelinjer viser 4T1 cellene blir oppslukt av M1 makrofager i løpet av en 13 h periode. Det er viktig å sikre en fullstendig polarisering av M1 makrofager ved å utføre immunostaining. Resultatene (figur 1) viser at konsentrasjonen av 100 ng/ml LIPOPOLYSACCHARIDES (LPS) og 20 ng/ml IFN-γ polarisert RAW 264,7 makrofager i M1 staten. Merking av målrettede celler med et fluorescerende fargestoff og forlate effektor cellene unstained åpner for en live-celle coculture modell (film 1). Gjennom 13 h og 15 minutters intervall ble den phagocytic aktiviteten til M1 makrofager i coculture med 4T1-cellene dokumentert (film 2). De seks multipunkt videoene (A − F i film 2) ble innspilt for å vurdere flere hendelser innenfor en enkelt 35 mm glass-bunn Imaging parabolen. Film 3 viser 4T1 cellene phagocytosed av M1 makrofager. Movie 4 ble valgt som et eksempel på en grundig video filmet fra dette eksperimentet og film 5 viser opptaket av 4T1 celler av M1 makrofager.
Figur 1: Immunofluorescence farging med anti-iNOS-FITC i grønt, kjerner markør DAPI i blått, og forbedrede versjoner av sammenslåtte bilder. Disse panelene representerer RAW 264,7 makrofager (kontroll) og M1 makrofager (LPS og IFN-γ stimulert) immunostained med anti-iNOS-FITC (M1 markør) i grønt og counterstained med kjerner markør, DAPI i blått. (A) DAPI flekken kan OBSERVERES både RAW 264,7 og M1 makrofager. (B) anti-INOS-FITC (grønn) bare Fluorescerer på M1 makrofager. (C) flettede bilder av DAPI beis og anti-INOS-FITC. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: sette opp fluorescens og dic bilde oppkjøpet i Imaging programvare oppkjøpet dialog kontroll. [1] Velg avmerkings boksen [lambda] i kategorien [ 2] Velg [optisk konfigurasjon] og velg [10x dic] og [GFP-R] for det grønne fluorescens Filter boksen, [3] Velg [10x dic] | [Angi denne kanalen som fokus referanse]. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: sette opp multipunkt bildeoppkjøp i Imaging programvare oppkjøpet dialog kontroll. [4] Velg [XY]-fanen og neste [5] Merk av i boksen under [punkt navn]-kolonnen for å angi hvert punkt for bildeopptaket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sette opp intervaller og varighet for bildeopptak med tidsforløp. Den Imaging programvare oppkjøpet dialog kontroll for å sette opp time-lapse Image Capture. For å sette opp tid-lapse Image Acquisition [6] sjekk på [Time] kategorien [ 7] bestemme [intervall] (etter sekund, min, eller time) og [8] [varighet] (per sekund, min eller time). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: konfigurere flerpunkts film paneler for måling av tidsforløp bilde. Forhåndsvisningen av seks multipunkt filmer paneler kombinert etter ferdigstillelse av 13 h av coculture. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: en representativ film av unstained M1 makrofager og 4T1 CFSE-farget mus brystkreftceller i coculture fanget ved hjelp av flerkanals oppkjøp av fluorescerende og dic mikroskopi. Resultater utstillingsmonter CFSE i den grønne-merket celle veggen av 4T1 mus melke kreftceller cocultured med unstained M1 makrofager. Tidsforløp bildene ble anskaffet for en 13 timer coculture periode med 15 min tidsintervaller ved hjelp av flerkanals oppkjøp (trinn 7,3, se figur 2). (A) differensial forstyrrelser kontrast, (rød sirkel) viser små, runde M1 makrofager å følge 4T1 cellene, som har en epitel morfologi. (B) en fluorescens mikroskopi bilde av 4T1 celler farget med CFSE før fagocytose av makrofager. (C) fusjonerte dic og fluorescens mikroskopi bilder av CFSE-beiset 4T1 celler blir oppslukt av unstained M1 makrofager. De blå pilene viser unstained M1 makrofager fluorescerende grønt som de sluker CFSE-merket 4T1 celler. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 2: Live-celle video mikroskopi filmer fra flere etappe poeng i en enkelt bildebehandling parabol viser fagocytose av 4T1 mus brystkreftceller ved indusert M1 makrofager. Resultatene representerer seks forskjellige punkter (film 2a − F) som er satt opp og koordinert ved hjelp av bildeprogramvare (trinn 7,4, se Figur 3−figur 5). M1 makrofager har en uregelmessig, pannekake-lignende morfologi med en porøs cytoplasma, mens 4T1 mus brystkreft svulster har en epitel morfologi. M1 makrofager og 4T1 celler var cocultured for 13 h inne i scene inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 før de ble observert for Live-celle video mikroskopi. Bilder ble tatt med 15 min tidsintervaller for 13 h. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 3: Live-celle video mikroskopi film av et enkelt koordinat punkt (se film 2) valgt å vise fagocytose av 4T1 mus brystkreft svulster av indusert M1 makrofager i detalj. Den røde pilen viser fagocytose. Den gule sirkelen viser at antall 4T1 celler som slukket oppslukningsprosess av 4T1 celler. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 4: en detaljert video for ytterligere å visualisere fagocytose prosessen med 4T1 celler av M1 makrofager. Dette panelet viser live M1 macrophage celler med en porøs cytoplasma fenotype. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Film 5: makrofager beveger seg mot 4T1-celler for å etablere celle-til-celle-kontakt, etterfulgt av opptaket av 4T1-celler med M1 makrofager (se film 2a). Den fase-kontrast mikroskopi time-lapse video ble avbildet i 15 min tidsintervaller for 13 h av coculture inne i en scene topp inkubator på 37 ° c med 5% CO2. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet krever to trinn: 1) coculture av 4T1 mus melke kreftceller og M1-polarisert makrofager, og 2) vurdering av macrophage phagocytic aktivitet ved hjelp av time-lapse mikroskopi. Levende celle coculture er mye brukt i fagocytose og migrasjon analyser. Den levende celle coculture modellen her er en enkel, tilpasningsdyktig in vitro prosedyre (figur 2) som utnytter en fluorescerende fargestoff, CFSE, som brukes til å merke 4T1 målrettede celler. Dette brukes til riktig sporing av celle typene under direkte celle bildebehandling. Time-lapse Live-celle Imaging ble brukt til å vurdere phagocytic aktivitet av M1 makrofager bruker multipunkt time-lapse 2D Imaging før 13 h av coculture.
Den levende celle coculture modellen ble etablert ved hjelp 4T1 mus melke kreftceller og M1 mus makrofager. For å skille cellene fra hverandre, 4T1 celler ble farget ved hjelp av en CFSE fluorescerende fargestoff (se avsnitt 4). CFSE tillater sporing av celler og overvåking celledeling. CFSE kan passivt diffus i celler, noe som gjør CFSE farging en passende celle tracker for å visualisere fagocytose av målrettede celler. Som phagocytic makrofager fordøye og sluker kreftceller, tar de opp CFSE fargestoff og til slutt bli fluorescerende12,13. Det er viktig å frø 4T1 celler i tenkelig parabolen før M1 makrofager. Dette er på grunn av ulike størrelser og former av begge cellene. 4T1-cellene har en epitel morfologi som proliferates i små klynger. Dessuten må 4T1 cellene være farget med CFSE før coculture med unstained M1 makrofager. Før macrophage polarisering ved hjelp av LPS og IFN-γ, den murine makrofager RAW 264,7 er runde, små, og vanligvis vokser som enkeltceller. Etter LPS og IFN-γ polarisering, indusert M1 makrofager har en relativt flat, pannekake-lignende form, med en porøs cytoplasma14,15. For å sikre riktig polarisering av RAW 264,7 mot M1 tilstand, 100 ng/mL LPS og 20 ng/mL IFN-γ stimulert makrofager ble immunostained med en M1 markør, anti-iNOS antistoff bøyd til FITC (figur 1). Denne protokollen er utført før coculturing makrofager og målrettede celler for å sikre at makrofager er helt polarisert inn i M1 staten.
Denne studien beskriver en metode for fluorescerende mikroskopi for å visualisere den phagocytic aktiviteten til levende makrofager. Å minimere photobleaching og å skaffe bedre fluorescens tenkelig, fluorescerende mikroskopi kan kombinert med annet tenkelig teknikker det er ikke-destruktive å det fluorokromkonjugert, analog med DIC. Den nåværende protokollen beskriver materialer og metoder som er nødvendige for vurdering av fagocytose av mus melke kreftceller av LPS og IFN-γ stimulert makrofager bruker fluorescerende og DIC time-lapse mikroskopi. Likevel har fluorescerende mikroskopi studier begrensninger ved å studere Live-celle Imaging i forhold til fase-kontrasten tidsforløp Imaging. Under fluorescerende Live-celle bildebehandling kan langvarig eksponering for en stor mengde eksitasjon-lys indusere alvorlig celle skade16. Photobleaching kan forårsake betydelige problemer i direkte celle bildebehandling. Den høy intensitet belysning som brukes i live-celle Imaging kan redusere evnen til CFSE fargestoff å fluorescerer. Likevel ble det oppnådd en 13 h fagocytose vurdering i den andre delen av denne studien, ved hjelp av fase-lapse 2D-avbildning (film 2 – 5).
Time-lapse mikroskopi gir fordeler som generering av data fra et enkelt eksperiment når som helst i løpet av den ønskede varighets perioden og betydelig, flere etappe poeng innenfor en enkelt tenkelig parabol kan fanges opp for et enkelt eksperiment. Dette gjør det mulig å observere ulike posisjoner i et enkelt eksperiment. Protokollen kan også brukes ved hjelp av flere brønner fra kultur plater (f. eks, 6, 24, 96 brønn plater). Blant de mest kritiske tekniske utfordringene for å utføre vellykket Live-celle Imaging eksperiment omfatter å opprettholde cellene i en sunn tilstand ved hjelp av en scene topp inkubator for å gi en stabil temperatur på 37 ° c, 95% av fuktighet, og 5% CO2. Fordi eksperimentet tok 13 timer, slik at mikroskopet fungerer normalt gjennom var avgjørende.
I løpet av denne studien, seks forskjellige punkter i Imaging parabolen ble fanget gjennom en 13 h varighet for 15 min intervaller per punkt (film 2). Poengene kan justeres avhengig av hendelsen i cellen under etterforskning. Tatt i betraktning det er flere etappe poeng å bli fanget gjennom dette eksperimentet, er det viktig å sørge for at hvert punkt har et stabilt fokus før du utfører Live-celle videoopptak. Tidsintervallet for undersøkelsen må optimaliseres. En redusert tidsintervall vil ha mer detaljerte punkter som kan bli avbildet; Imidlertid, filen størrelse ville være meget stor. Økende tidsintervall vil resultere i en lang video og vil gjøre filmen mister kontinuitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk finansiert av geran Putra Berimpak (GBP), Universiti Putra Malaysia: 9542800. Vi vil gjerne takke Agro-bioteknologi Institute, Malaysia (ABI) laboratorier, og mikroskopi Imaging anlegget. Spesiell takk til Mohd Daniel Hazim for hjelp med redigering og innspilling av eksperimentell video for dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-INOS antibody conjugated FITC | Miltenyi Biotec | REA982 | 150 µg in 1 mL |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Invitrogen | C1157 | 25 mg |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | 10 mg |
| DMEM/high glucose | HyClone | SH30003.04 | 670.0 g |
| Fetal bovine serum | Tico Europe | FBSEU500 | 500 mL |
| Lipopolysaccharides | Sigma | L4516-1MG | 1 mg |
| Mouse recombinant interferon-gamma | Stemcell Technologies | 78021 | 100 µg |
| Penicillin-streptomycin solution | Cellgro | 30-003-CI | 100 mL |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 pack |
| Trypsin EDTA | Cellgro | 25-052-CI | 1X, 100 mL |
| 1000 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-01-052 | 5000 tips/case |
| 2 mL serological pipette | JET BIOFIL | GSP012002 | Non-pryogenic |
| 200 µL pipette tips | WhiteBox | WB-301-02-302 | 20,000 tps/case |
| 25 cm2 cell culture flask | Corning | CLS430639 | Tissue culture treated |
| Bench top centrifuge | Dynamica | FA15C | Model: Velocity 14R |
| Biological safety fume hood | Nuaire | NU-565-400 | Model: Home/ LabGard® ES TE NU-565 Class II, Type B2 Biosafety Fume Hood |
| CO2/air mixer | Chamlide (Live Cell Instrument) | FC-R-20 | FC-5 (CO2/Air Mixer) with the flow meter |
| Cell scrapper | NEST | 710001 | 220 mm |
| CO2 cell incubator | Panasonic | N/A | Model: MCO-19M(UV) |
| Confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | N/A | Nikon Ti-Eclipse |
| Glass bottom dish | Ibidi | 81218-200 | 35 mm |
| NIS elements software | Nikon Instruments Inc. | Available online download | |
| Pipette controller | CappAid | PA-100 | CappController pipette controller, 0.1-100ml |
| Thermostat | Shinko | Discontinued | JCS-33A 48 x 48 x 96.5mm |
References
- Rostam, H. M., Reynolds, P. M., Alexander, M. R., Gadegaard, N., Ghaemmaghami, A. M. Image based Machine Learning for identification of macrophage subsets. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Mantovani, A., Sozzani, S., Locati, M., Allavena, P., Sica, A. Macrophage polarization: Tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends in Immunology. , (2002).
- Lee, K. Y. M1 and M2 polarization of macrophages a mini-review. 2 (1), 1-5 (2019).
- Martinez-Marin, D., Jarvis, C., Nelius, T., Filleur, S. Assessment of phagocytic activity in live macrophages-tumor cells cocultures by Confocal and Nomarski Microscopy. Biology Methods and Protocols. 2 (1), 1-7 (2017).
- Tauber, A. I.
- Eiro, N., Gonzalez, L. O., Cid, S., Schneider, J., Vizoso, F. J. Breast Cancer Tumor Stroma: Cellular Components, Phenotypic Heterogeneity, Intercellular Communication, Prognostic ImplicationsTherapeutic Opportunities. Cancers. 11 (5), 1-26 (2019).
- Larionova, I., et al. Interaction of tumor-associated macrophages and cancer chemotherapy. OncoImmunology. 8 (7), 1-15 (2019).
- Jain, P., Worthylake, R. A., Alahari, S. K. Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (63), e3585 (2012).
- Weiss, S., Luchman, H. A., Restall, I., Bozek, D. A., Chesnelong, C. Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58152 (2018).
- Tsitsilashvili, E., Sepashvili, M., Chikviladze, M., Shanshiashvili, L., Mikeladze, D. Myelin basic protein charge isomers change macrophage polarization. Journal of Inflammation Research. 12, 25-33 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Kobelt, G., Eriksson, J., Phillips, G., Berg, J. The burden of multiple sclerosis 2015: Methods of data collection, assessment and analysis of costs, quality of life and symptoms. Multiple Sclerosis Journal. 2, 153-156 (2017).
- Escórcio-Correia, M., Hagemann, T. Measurement of tumor cytolysis by macrophages. Current Protocols in Immunology. , SUPPL.92 1-11 (2011).
- Cui, K., Ardell, C. L., Podolnikova, N. P., Yakubenko, V. P. Distinct migratory properties of M1, M2, and resident macrophages are regulated by αdβ2and αmβ2integrin-mediated adhesion. Frontiers in Immunology. 9, 1-14 (2018).
- McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17253-17258 (2013).
- Penjweini, R., Loew, H. G., Hamblin, M. R., Kratky, K. W. Long-term monitoring of live cell proliferation in presence of PVP-Hypericin: A new strategy using ms pulses of LED and the fluorescent dye CFSE. Journal of Microscopy. 45 (1), 100-108 (2012).
