Summary
Syftet med detta protokoll är att visualisera Candida albicans cell form och lokalisering i däggdjurs mag-tarmkanalen.
Abstract
Candida albicans är en svamp komponent i tarmen bakterieflora hos människor och många andra däggdjur. Även om C. albicans inte orsakar symptom i de flesta koloniserade värdar, den kommensaler reservoaren fungerar som en förvaringsplats för infektionssjukdomar, och närvaron av hög svamp-titrar i tarmen är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom. Här beskriver vi en metod för att visualisera C. albicans cellmorfologi och lokalisering i en musmodell av stabil gastrointestinal kolonisering. Koloniseringen är etablerad med hjälp av en engångsdos av C. albicans hos djur som har behandlats med orala antibiotika. Segment av tarm vävnad är fasta på ett sätt som bevarar arkitekturen i luminala innehåll (mikroorganismer och slem) samt värd slemhinnan. Slutligen, fluorescerande in situ hybridisering utförs med hjälp av sonder mot svamp rRNA att färga för C. albicans och hyfer. En viktig fördel med detta protokoll är att det möjliggör samtidig observation av C. albicans cellmorfologi och dess rumsliga Association med värdstrukturer under gastrointestinal kolonisering.
Introduction
Candida albicans är en svamp kommensaler samt en opportunistisk mänsklig patogen. Denna jäst saknar en definierad miljö nisch och i stället sprider sig inom den gastrointestinala (GI) tarmkanalen, hud, och urogenital tarmkanalen av människor och andra däggdjur1. Den tidiga forskningen om C. albicans fokuserade främst på dess virulenspotential, men flera nya rapporter tyder på att Isaea föröknings organismer i tarmen kan spela viktiga roller vid normal hälsa, inklusive immun utvecklingen hos värd2,3,4. För att underlätta utredningar av C. albicans commensalism inom däggdjurs tarmen, utvecklade vi en musmodell av stabil GI kolonisering och en fluorescens i situ hybridisering (fisk)-baserad metod för att visualisera svampceller jäst och hyfer inom tarm lumen.
Med några undantag5, laboratoriefödde möss uppvisar typiskt resistens mot svamp kolonisering av mag-tarmkanalen. Kolonisering motstånd tros vara förmedlas av specifika bakteriearter; emellertid, detta kan övervinnas genom behandling av djuren med antibiotika6,7 eller användning av en kemiskt definierad diet som förmodligen förändrar bakterieart sammansättning8,9. På samma sätt, hos människor, användning av bredspektrumantibiotika har förknippats med C. albicans överväxt och spridning10. Vår murina kolonisationsmodell använder bredspektrumantibiotika för att etablera C. albicans kolonisering av immunkompetenta, konventionellt uppfödda möss. Penicillin och streptomycin tillhandahålls i djurens dricksvatten i en vecka före sonden med 108 Colony Forming enheter (cfus) av C. albicans. Så länge antibiotikum-infunderas vatten fortsätter, C. albicans kommer att propagera genom magtarmkanalen, nå fekal titrar av 106− 108 cfus/g. Trots den höga nivån av svamp kolonisering, djur förbli friska och få vikt i samma takt som icke-infekterade kontroller. Denna modell har använts framgångsrikt för att skärmen för och karakterisera flera C. albicans commensalism faktorer11,12.
Liksom andra medlemmar av svampens rike, C. albicans klarar av enorma morfologiska plasticitet13. Under in vitro-förhållanden, det har visat sig övergången bland minst sex encelliga jästcelltyper, samt multicellulära hyfer och pseudohyfer. Jästen till hypha övergången är en av dess bäst kännetecknas virulens attribut, och hyfer och pseudohyfer dominerar i de flesta däggdjurs sjukdomar modeller, liksom i infekterade mänskliga vävnader. För att bestämma C. albicans lokalisering och cellmorfologi inom murina mag-tarmkanalen, vi utvecklat en fisk teknik för färgning jäst och hyfer i fasta histologiska sektioner. Sonderna består av Fluorescent märkt DNA oligonukleotides att hybridisera till svamp 23S ribosomal RNA (rRNA), som distribueras i hela svampens cytoplasma. Eftersom värd vävnader är fast på ett sätt som bevarar den tredimensionella arkitekturen i tarmen, inklusive värd slemhinnan, matsmältningsorganen material, bakterieflora, och slem i tarmen lumen, denna teknik tillåter lokalisering av svamp celler med avseende på dessa landmärken när de färgas. FISK tekniken jämförs positivt med traditionella histologiska fläckar för svampar, såsom periodiska acid Schiff (PAS) eller Gomoris Metenamin-Silver (GMS), samt kommersiellt tillgängliga antimykotiska antikroppar, eftersom dessa reagenser inte är specifika för C. albicans. Dessutom, standard fixativ bort slem skiktet och störa andra innehållet i tarmen lumen14,15.
I denna artikel, vi ger detaljerade instruktioner för upprättande av hög kvalitet C. albicans kolonisering av mus GI-tarmkanalen, för dissektion av mag-tarmkanalen från euthanized djur, för vävnadfixering på ett sätt som bevarar luminala och för detektion av C. albicans inom värd vävnader med hjälp av fisk. Förutom vildtyp och muterade stammar av C. albicans, kan sonddage tekniken användas för att leverera andra mikroorganismer. Fixeringstekniken skulle vara användbar för alla studier där konservering av tarminnehåll önskas. FISKEN förfarandet kan slutföras inom en dag och kan användas för att lokalisera flera svamparter med hjälp av flera, differentially märkta sonder.
Protocol
De steg som beskrivs nedan har godkänts av UCSF institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC).
1. gastrointestinal kolonisering av möss med C. albicans med oral sonson
- Ge bostäder för 18 − 21 g manliga eller honmöss (8 − 10 veckor gamla) som godkänts av den lokala IACUC. Använd autoklaverad mat och vatten från första dagen.
Anmärkning: Användningen av steriliserade burar, sängkläder, mat och vatten minskar risken för kontaminering med antibiotikaresistenta miljö bakterier som potentiellt kan tränga undan C. albicans från tarmen. Vidare, beroende på den experimentella frågan, enskilda bostäder av djur bör övervägas eftersom möss är coprophagic och Gut innehåll kommer att delas mellan coinrymt djur. - Följande dag, ersätta det autoklaverade dricksvattnet med autoklaverat vatten som innehåller 5% glukos, 1 500 U/mL Penicillin G, och 2 mg/mL streptomycin.
- För enkelhetens skull, Förbered 200x antibiotika lagerlösningar (tabell 1) i förväg, filter sterilisera, och frysa vid-20 ° c.
- Underhålla djur på antibiotika i en vecka.
- På dag 3 och 6 efter antibiotika har startats, bedöma varje djurs avföring för kontaminering med antibiotikaresistenta aeroba bakterier. Håll ett djur med en hand, placera en icke-utjämnade mikrofugrör röret nära anus och samla in minst en fekal pellet.
- Omsuspendera varje fekal pellet i 1 ml sterilt vatten och platta 100 μl på Luria buljong (lb), jästextrakt pepton dextros (yepd), eller hjärnan hjärta infusion (BHI) plus blod agar plattor. Inkubera plattorna över natten i en standard inkubator (ej anaerob) vid 37 ° c och Bedöm för bakterietillväxt.
Anmärkning: Plattorna bör uppvisa minimal tillväxt (0 − 20 kolonier). Om > 20 kolonier av bakterier återvinns från djur som behandlats med penicillin och streptomycin, då är det osannolikt att hög nivå kolonisering med C. albicans kommer att inrättas och försöket bör avbrytas.
- Tre dagar före gavage, Streak C. albicans från frysta glycerol lager till yepd + 2% agar plattor och inkubera vid 30 ° c i 2 dagar.
- En dag före Sonda, Inokulera en koloni av varje C. albicans stam som skall testas i 5 ml flytande yepd. Inkubera vid 30 ° c under natten med skakning.
- Morgonen sonder, späd den mättade kulturen av C. albicans till en optisk densitet vid 600 Nm (OD600) av 0,1 i 100 ml av yepd förvärmas till 30 ° c. Skaka i en orbital shaker vid 200 rpm vid 30 ° c för mellan 4 h och 5 h tills OD600 når 1 (Mid-log tillväxt).
- Överför varje 100 mL kultur till 2 50 mL koniska rör och centrifugera vid 3 000 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT).
Anmärkning: C. albicans propar relativt långsamt vid RT. Om man anpassar detta protokoll för en annan art, kan inokulat behöva förvaras på is för att förhindra fortsatt tillväxt. - Kassera supernatanten, Omsuspendera de pelleterade cellerna i 20 mL steril saltlösning per 50 mL kultur, och poolera de dubbla återupphängda pelletarna i enstaka koniska rör. Centrifugera vid 3 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten och Omsuspendera i 20 mL steril saltlösning. Vortex kort och ta bort 20 μL för OD600 mätning. Späd 1:50 i steril normal saltlösning. Centrifugera de kvarvarande återsuspenderade cellerna vid 3 000 x g i 5 min.
- Kassera supernatanten. För en inokulum storlek 1 x 108 CFU, Omsuspendera pelleterade celler till cirka 5 x 108 cfus/ml i steril normal saltlösning baserat på den uppskattade koncentrationen bestäms från OD600 mätning.
Anmärkning: Typiskt, en OD600 av 1 motsvarar ~ 1 x 107 jästceller/ml. Detta värde kan variera beroende på spektrofotometer och bör verifieras. Om en förändring i koncentrationen önskas för infektioner med en annan mikroorganism, planera för en inokulum volym av ≤ 10 μl/g mus för att minimera obehag till djuret. - Kontrollera koncentrationen av inokulum genom att räkna en 1:1000 utspädning med en hemocytometer. Justera volymen av celler som ska gavaged baserat på koncentrationen bestäms med hjälp av hemocytometer.
- Med hjälp av en nål för utfodring av djur (figur 1A), sondmatning varje djur med den beräknade volymen av ett givet inoculum. Se steg 1.13.1 − 1.13.8 för sondmatning förfarandet.
Anmärkning: utbildning för sondtid bör erhållas från en erfaren utövare, och förfarandet bör bemästras i förväg. Ett lyckat förfarande för ett enda djur tar normalt inte längre än 1 min.- Fäst en autoklaverad utfodringsnål på en 1 mL spruta och Fyll sprutan med en gavinvolym och ta bort eventuella luftbubblor för att undvika en felaktig dos. Placera på en steril yta.
- Säkra djuret för Sonning. Håll djuret vid basen av svansen med den dominerande handen och skjut dominanta hand upp djurets tillbaka till den lösa huden precis bakom öronen.
- Använda pekfingret och tummen av dominanta hand, samla lös hud tillsammans tätt; Detta är "Scruff". Plocka upp djuret genom sin kragen och slinga litet finger av samma (nondominant) hand runt svansen att immobilisera djur mot handflatan. Försiktigt förlänga djurets huvud så att dess huvud och kropp (och därmed hals och matstrupen) är i en rak linje.
Anmärkning: Att försöka en sonson medan djurets kropp är böjd eller vriden kan resultera i komplikationer såsom esofagus perforation och död av djuret. - Plocka upp sprutan med den dominerande handen och håll den vinkelrät mot djuret, med den böjda nålen riktad nedåt (figur 1B). Med hjälp av bollen på nålen, försiktigt krok ett inre hörn av munnen, försiktigt förskott nålen längs sidan av munnen till baksida av halsen, och slutligen flytta nålen till centrum.
Anmärkning: Införandet av nålen längs en lateral väg hjälper till att undvika motstånd från djurets tänder och tunga. - När nålens kula är längst bak i halsen, luta nålen uppåt så att den är parallell med djurets kropps linje (figur 1C).
Anmärkning: Vid denna punkt, djuret kommer att uppvisa en gag reflex. Detta är ett bra tecken som indikerar att nålen är placerad korrekt, och munkavle rörelse hjälper till att vägleda nålen ner i matstrupen. Om det inte finns någon gag reflex, kan nålen vara i luftstrupen snarare än matstrupen. Dra försiktigt ut nålen och fortsätt tillbaka till steg 1.13.1. - Låt djuret svälja inokulum tills endast några få millimeter är synliga (figur 1D). Försätt nålen smidigt.
Anmärkning: Om nålen inte förskott, undvika att använda våld, som kan skada matstrupen. Ibland framåt den sista halvan centimeter kommer att kräva en extra stor gag från djuret. Om nålen verkar ha fastnat, sakta dra tillbaka den och försök igen från steg 1.13.4. - Testa att nålens kula är på rätt plats (magen) genom att försiktigt föra kolven. Om det inte finns något motstånd, fortsätta leverera inoculum. När inokulum har administrerats, långsamt dra nålen.
- Byt ut djuret i sin bur och fortsätt att övervaka djuret i 5 − 10 min för tecken på ansträngd andning eller ångest. Kontrollera att djuret återupptar normal aktivitet strax efter sonden.
- Om samma inokulum kommer att användas med nästa djur, rengör nålen med en sprit torka. Gå tillbaka till steg 1.13.1. Om en annan inokulum kommer att användas, Använd en ny nål och gå tillbaka till steg 1.13.1.
Anmärkning: Det är viktigt att inspektera djuren dagen efter sonden. Djur som uppvisar tecken på ångest (t. ex. böjd kroppshållning, ansträngd andning) bör vara humant euthanized, eftersom de har sannolikt lidit esofagus bristning, skador på lungorna, eller en annan inre skada från vilken återhämtning är osannolikt.
- Efter sonder av djuren, plattspädningar av inokulat för dos verifiering.
- Förbered 10-faldigt seriella utspädningar upp till 1:105. Platta en sondmatning volym av 1:105 utspädning på en 100 mm tallrik Sabouraud dextros agar.
- Inkubera plattan i 2 dagar vid 30 ° c. Räkna cfus för att bekräfta inokulum dos.
2. beredning av gastrointestinala vävnader för histologi
Anmärkning: Detta avsnitt av protokollet är anpassat från Johansson och Hansson16.
- Förbered 500 mL av methacarn-lösningen (60% metanol, 30% kloroform, 10% isättika) i en stor skruvkork plastburk för varje 2 djur dissekeras.
Försiktighet: Metanol och kloroform är skadliga vid inandning och bör manipuleras i en kemisk huva. Isättika kan vara frätande och bör hanteras med lämplig personlig skyddsutrustning. Metanol, kloroform och isättika skall kasseras som farligt avfall. - Vid den experimentella Endpoint, euthanize djur humant enligt ett protokoll som godkänts av den lokala IACUC.
Anmärkning: I antibiotika-behandlade djur, C. albicans kolonisering varierar vanligtvis från ~ 106 cfus/g på dag 5 upp till ~ 5 x 107 cfus/g av dag 25. - Sterilisera dissekera verktyg med 10% blekmedel och skölj med 70% etanol.
- Säkra varje djur till en dissektion yta, med ventrala sidan vänd uppåt. Använd 30 G nålar för att fästa extremiteterna på dissektionens yta (figur 2A). Spraya djuret med 70% etanol för att rengöra pälsen och minimera fastnar på verktygen.
- Använda trubbiga-slutade tång, nypa en del av buken hud med dominanta hand. Använda sax med dominerande hand, incisionsfilm huden och underliggande fascia nära basen av bäckenet. Förläng snittet i en U-form längs vardera sidan av peritonealhålan och upp till bröstkorgen. Lyft upp huden ur vägen.
- Med hjälp av en penna, prelabel histologi kassetter för GI segment som ska bedömas. Till exempel, för varje djur, etikett separata kassetter som "mage", "proximala tunntarm," "Mid tunntarm," "distala tunntarm," "blindtarmen," och "stora tarmar." Placera en skum dyna på undersidan av varje kassett (figur 2a).
Anmärkning: figur 2B beskriver föreslagna avsnitt att placera i kassetter. - Använda trubbiga-slutade tång, försiktigt extrahera blindtarmen från peritonealhålan. Använd sax för att bryta anslutningar mellan blindtarmen och de små och stora tarmarna.
Anmärkning: Cecal vävnad är mycket känslig och lätt att brista. Var försiktig när du manipulerar. - Placera hela blindtarmen i en histologisk kassett så att den är ovriden och lägger platt (figur 2C). Placera en andra skum dyna ovanpå och Stäng kassetten. Placera kassetten i ett skruvlock burk som innehåller methacarn.
- Punktskatter en del av de stora tarmarna som innehåller 1 − 2 fekal pellets, med en längd mindre än den i kassetten.
- Placera vävnads delen i kassetten, hålla vävnaden platt och ovriden. Överlägg med en andra skumdyna och Stäng kassetten. Placera kassetten i methacarn.
- För varje del av de små tarmarna som skall provtas, punktskatter en 1 − 2 cm segment som innehåller några matsmältningsorganen material.
- Placera segmentet i en histologi kassett, hålla vävnaden platt och ovriden. Överlägg med en andra skumdyna och Stäng kassetten. Placera kassetten i methacarn.
- För magen, Sever anslutningarna till matstrupen och tunntarm. Placera i en kassett, hålla vävnaden platt och ovriden. Överlägg med en andra skumdyna och Stäng kassetten. Placera kassetten i methacarn.
- Lämna kassetterna i methacarn-lösningen vid RT i minst 3 timmar och mindre än 2 veckor.
Anmärkning: Det finns flera punkter under vilka de fasta GI-segmenten kan överföras till en kommersiell histologisk tjänst. Dessa vävnader kan vara svåra att avsnitt utan avbrott i luminala innehåll, och optimala resultat kommer att erhållas av en erfaren tekniker. Om den kommersiella tjänsten är villig att utföra tvättar före inbäddning av vävnaderna i paraffin, kan kassetterna skickas i detta skede tillsammans med instruktioner för steg 2,16. - Börja smälta tillräckligt paraffinvax för att täcka alla vävnads kassetter i en stor bägare i en förvärmd 70 ° c hybridisering ugn.
- Efter fixering, ta bort skum dynorna och återgå varje intakt vävnad avsnitt tillbaka till sin kassett. Tvätta vävnaderna med följande lösningar vid RT med skakning: två gånger för 35 min i 100% metanol, två gånger för 25 min i 100% etanol, två gånger för 20 min i xylen.
Försiktighet: Xylen är brandfarlig, giftig och kan orsaka skador vid inandning. Använd i en kemisk huva med rätt skydd. Kassera xylen via procedurer för farligt avfall. - Klappa kassetterna torra på en pappershandduk och placera i försmält paraffinvax för 2 h vid 70 ° c i en hybridisering ugn. Se till att kassetterna är fyllda med paraffin och att inga bubblor återstår.
Anmärkning: Detta steg gör att vaxet att infiltrera GI segmentet och att stabilisera vävnad och innehåll. - Ta bort kassetterna från vax, låt överflödigt vax rinna, och förvara på RT tills de är inbäddade i vax block. Kassera det vax som innehåller spårmängder av xylener som farligt avfall.
Anmärkning: The Noble Lab använder en kommersiell histologi tjänst för inbäddning och snittning av vävnader. För standard visualisering av C. albicans jästsvampar och hyfer används 4 μm-sektioner. För att utvärdera anslutning av hyphal segment, som vanligtvis sträcker sig genom flera plan, kan 8 μm sektioner användas. Beroende på förmågan hos fisk sonder att tränga in i preparatet, kan det vara möjligt att använda ännu tjockare sektioner.
3. validering av nydesignade sonder
Anmärkning: Följande protokoll för validering av C. albicans sonder anpassades från Swidsinski et al.17.
- Streak C. albicans SC5314 och närbesläktade komparator arter (t. ex. Candida dubliniensis, Candida tropicalis) till yepd + 2% agar tallrikar. Inkubera i 1 − 2 dagar vid 30 ° c.
- Inokulera 5 mL flytande YEPD-medium med en enda koloni.
- Pipettera över 1 mL av de suspenderade cellerna till ett microcentrifugerör och centrifugera vid 3 000 x g i 5 min. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pelleten i 100 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Pipettera över 5 − 10 μL återsuspenderade celler och fläck på en glas rutschbana. Sprids till en större cirkel och låt torka.
Anmärkning: Om cellerna inte är anhängare, Använd Poly-L-lysine belagda diabilder. - Cirkel cellen plats med en PAP-penna och täck med 50 μL av 2,5% PARAFORMALDEHYD (PFA) i PBS. Inkubera vid RT i 10 minuter.
Försiktighet: PFA är brandfarligt och kan orsaka hälsoproblem vid inandning eller hudkontakt. Föremål som kontaminerats med PFA ska kasseras som farligt avfall. - Tvätta 3x med PBS. Knacka på vätska på pappers handduken och täck med 100 μL PBS. Upprepa två gånger. Kassera slutlig tvätt.
-
Förbered bilder för lagring i flera dagar. Om du utför fisk på samma dag, gå vidare till steg 3,9 utan stegen i det här avsnittet.
Obs: det är bättre att utföra hybridisering omedelbart men om kort tid följer steg 3,8 före förvaring. Diabilder kan förvaras i flera dagar vid 4 ° c.- Täck platsen med 60% etanol. Inkubera vid RT i 3 min. Kassera lösningen.
- Täck platsen med 80% etanol. Inkubera vid RT i 3 min. Kassera lösningen.
- Täck platsen med 100% etanol. Inkubera vid RT i 3 min. Kassera lösningen. Gå vidare till steg 3,9.
- Placera glidbanorna i en hybridiseringsugn vid 50 ° c i 1 h. Om steg 3,8 följdes, förvara bilderna vid 4 ° c. Om inte, gå vidare till steg 4,2 för att utföra hybridiseringsprotokollet.
4. FISKSFÄRGNING i magtarmkanalen vävnader
- Devax paraffin-inbäddade histologiska sektioner.
- I en hybridiserings ugn, värm en Coplin burk fylld med xylen till 60 ° c.
- Sätt in bilderna i den xylenfyllda burken. Placera vid 60 ° c i 10 min. Kassera xylentvätten. Förvara glasen i burken och häll av xylen i en avfallsbehållare.
- Häll färsk RT xylen i burken och inkubera vid 60 ° c i 10 min. Kassera den andra xylentvätten.
- Fyll burken med 100% etanol och inkubera vid RT i 5 min. ta bort glasen från burken och lufttorka.
- Ställ hybridiserings ugnen till 50 ° c i steg i avsnitt 4,2.
- Fläcken C. albicans med Fish PROBE.
- Bered 1 mL färsk hybridiseringslösning (20 mM Tris – HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], 1% formamid i RNase-fritt vatten). Se tabell 1 för prov beräkningar.
- Blanda ihop 50 μL hybridiseringslösning med 1 μL C. albicans sond (5 ' CY3-ACAGCAGAAGCCGTGCC 3 '; 50 μg/ml i RNase-fritt vatten) för ett slutligt sond belopp på 0,5 μg per bild.
Anmärkning: Många laboratorieförädlade möss innehåller inga svampar bland deras bakterieflora. I detta fall är det möjligt att ersätta en pan-svamp sond (5 ' Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3 ') som erkänner 23S rRNA av de flesta svamparter, inte bara C. albicans. I författarnas erfarenhet, den panfungal sonden ger ljusare färgning än C. albicans-specifik sond. - Skydda lösningen från ljus och Värm till 50 ° c.
- Med hjälp av en PAP-penna, rita en cirkel runt vävnad avsnitt från avsnitt 4,1.
- Pipettera över 50 μL sond-innehållande hybridiseringslösning på den fasta vävnaden och fördela försiktigt över vävnads sektionen med pipettspetsen. Överlagra vätskan med en hybridisering täckslip att se till att förhindra bubblor.
- Tätnings glas i en vattentät hybridisering kammare och inkubera sektionerna för 3 h vid 50 ° c i mörkret i en hybridisering ugn.
- Under tiden, Förbered 50 mL av fisk tvättlösning (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl i RNase-fritt vatten). Se tabell 1 för prov beräkningar.
- Flytta tvättlösningen till 50 ° c för att förvärma.
- Efter 3 h, tillsätt tvättlösningen till en Coplin burk. Ta sedan försiktigt bort täckglaset från bilden med tång och placera bilden i tvättlösningen.
- Täck burken med aluminiumfolie och inkubera vid 50 ° c i 20 min.
- Under denna inkubering, Förbered mucin-nuklei färgning lösning (20 ng/mL 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], 1,6 μg/mL fluorescein isotiocyanat [FITC]-lectin i PBS). Se tabell 1 för prov beräkningar. För mage och stora tarmar, Använd FITC-ulex europaeus kall 1 (UEA-1). För tunntarm och blindtarmen, Använd en kombination av FITC-UEA-1 och FITC-vetegroddar kall (WGA).
Anmärkning: Lektiner från olika arter känner igen olika socker förändringar av glykoproteiner som mucin. De lektin kombinationer som rekommenderas här bestämdes empiriskt för optimal färgning av slem i olika GI-fack. - Tvätta glasen genom att hälla av fisk tvättlösningen och fylla på burken med RT PBS. Häll omedelbart av PBS och fyll på med PBS. Häll av PBS för totalt 2 tvättar.
- Veke bort PBS med en delikat uppgift torkar vävnad och cirkel tarm vävnad avsnitt med en PAP-penna. Placera bilderna i en ogenomskinlig plastbehållare och tillsätt 50 μL mucin-nuclei-färgningslösning till vävnads sektionen. Täck behållaren med aluminiumfolie för att skydda mot ljus. Inkubera vid 4 ° c i 45 min.
- Placera bilderna i en Coplin burk och tvätta snabbt två gånger i PBS vid RT.
- Knacka bort överflödig PBS på en pappershandduk, och sedan veka bort de sista dropparna av PBS med en vävnad.
- Placera en droppe av monteringsmedel på varje sektion och overlay med en glastäckslip, förhindra bubblor. Låt monterings mediet spridas under hela täcksteget. För omedelbar avbildning, ankare täckslip på plats med nagellack i hörnen. För långtidsförvaring, täta runt täckslip med nagellack.
- Bild bilderna med hjälp av ett fluorescerande Mikroskop.
Representative Results
Efter de instruktioner som tillhandahålls, kommer resultatet av denna teknik vara fluorescerande märkning av kärnor i värd epitel, slem, och C. albicans i SEKTIONERADE GI vävnader. Vild typ Candida albicans celler bör visas som antingen runda, encelliga jästceller eller mycket långsträckt, ibland förgrenade, flercelliga hyfer (cell-cell divisioner kommer inte att synas i hyfer). Mutanter av C. albicans kan dessutom visas som mindre, något långsträckt "grå" jäst eller som större, något LÅNGSTRÄCKT "Gut" (gastrointestinal-inducerad övergång) eller "ogenomskinliga" jästsvampar.
Figur 1 visar den utfodringsnål som används för oral Sonning, samt nyckelpositioner av nålen under sonden förfarandet. Figur 2 ger en typisk inställning som används för orgel dissektion och UTSEENDET på GI segment av musen.
Figur 3 visar fisk färgning av olika C. albicans celltyper efter förökning in vitro och inom musmodellen. Figur 3A visar fluorescens och fas bilder av fasta, permeabiliserade, in vitro-propagerade hyfer. Hypha bildas induceras med Liquid Lee ' s medium18 med 2% N-acetylglukosamin, pH 6,8 vid 37 ° c. Figur 3B visar fluorescens och fas bilder av fasta, permeabiliserade, in vitro-propagerade jästceller. Figur 3C, D visar fasta, permeabiliserade, in vitro-propagerade tarmceller och ogenomskinliga celler, respektive. GUT och ogenomskinliga celltyper är morfologiskt omöjlig att skilja utom när visualiseras genom scanning elektronmikroskopi. Observera att fisk färgning av in vitro-propagerade celler kommer att vara suboptimala om cellerna inte är väl permeabiliserad. Ett exempel på svag och diffus färgning visas i figur 3C. För bästa resultat bör cellernas fixering och permeabiliseringsförhållanden bestämmas empiriskt för varje celltyp och art som ska undersökas. Lyckligtvis, det rekommenderade protokollet för att visualisera C. albicans i sektionerade vävnader ger mer konsekvent permeabilisering.
Figur 3e-G skildra c. albicans i mus stora tarmar, färgade med c. albicans-specifik sond(figur 3E) eller panfungal sond (figur 3F, G). C. albicans visas rött i dessa bilder, värd cellkärnor är blå, och slem skiktet är grönt. Både runda jästsvampar och mycket långsträckt hyfer (vita pilspetsar) förekommer i de stora tarmarna. Observera att färgning är ljusare med panfungal sonden. Figur 3G skildrar en ume6 Mutant i samma fack, färgade med panfungal sond. ume6 kodar en transkriptionsfaktor som krävs för hypha-bildning under in vitro-betingelser19 . Intressant, den jäst-låst fenotyp som visas av denna Mutant under in vitro-förhållanden inte rekapitueras i tarmen, vilket tyder på att en överflödig faktor måste aktiveras inom värd12. Figur 4 skildrar utseendet av vild typ C. albicans i olika segment av murina GI-tarmkanalen, inklusive de regioner som omedelbart gränsar till värd slemhinnan och mer centrala områden i tarmen lumen.
Bild 1: viktiga matar nål positioner under sonden. A) utfodring av nålen. (B) utfodring nål bollen in på sidan av tungan. (C) utfodring nål i upprätt läge med insättning i matstrupen. Dutfodring av nålen insatt i magen med några få millimeter synliga ovanför näsan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: exempel på dissektion-layout. (A) dissektion pad och verktyg. B) EXCISED GI-tarmkanalen. Proximal (matstrupen) till distala (anus) sektioner: I. mage. II. proximala tunntarm. III. mediala tunntarm. IV. distala tunntarm. V. cecum. VI. tjocktarmen. Rosa streckade kant rutor anger vilka vävnader som ska åtgärdas. Cvävnader som placerats i kassetter. Romerska siffror är desamma som i panel B. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa bilder av fisk-färgade c. albicans. (a) fisk av c. albicans hyfer odlas i flytande Lee ' s Media18 med 2% N-acetylglukosamin, pH 6,8. Bfisk av C. albicans runda JÄSTCELLER odlade på yepd + 2% agar plattor. C) fisk av c. albicans tarmceller (ySN1045) som odlas på yepd + 2% agarplattor. Dfisk av C. albicans ogenomskinliga celler som odlas på yepd + 2% agarplattor. (E) vild typ c. albicans (ySN250) i stora tarmar, färgade med C. albicans-specifik sond. (F) vild typ C. albicans i stora tarmar, färgade med panfungal sonden. (G) Ume6 Mutant (ySN1479) i stora tarmar, färgade med panfungal sonden: röd är C. albicans, blå är värd epitelial kärnor, och grönt är mucin. Pilspetsar indikerar hyfer. Pilar indikerar jäst. Skalstreck = 20 μm. bilder F och G är anpassade från Witchley et al.12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: utseende av fisk-färgade C. albicans i olika tarm fack. Wild Type C. albicans visas i de angivna segmenten av mus-GI-tarmkanalen. Inom varje fack, bilder skildrar området intill värd slemhinnan och den centrala regionen i tarmen lumen. Färgning utfördes med panfungal sonden. Skalstapel = 20 μm. bilder är anpassade från Witchley et al.12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antibiotikum lager (200x) | |||
| Mer från Penicillin G | 181 mg/mL | ||
| Streptomycin | 400 mg/μL | ||
| Methacarn | |||
| Lager | Slutliga koncentrationen | Volym | Enheter |
| Metanol | 60% | 300 | Ml |
| Kloroform | 30 | 150 | Ml |
| Isättika | 10 | 50 | Ml |
| Hybridisering lösning | |||
| Lager | Slutliga koncentrationen | Volym | Enheter |
| 1 M Tris-HCl, pH 7,4 | 20 mM | 20 | Μl |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 180 | Μl |
| 10% SDS | 0,10% | 10 | Μl |
| 100% formamid | 1,00% | 10 | μL (förvaras i små alikvoter vid-20 ° c mellan användningar) |
| RNase-fritt vatten | 780 | Μl | |
| FISK tvättlösning | |||
| 1 M Tris-HCl, pH 7,4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 9 | Ml |
| RNase-fritt vatten | 40 | Ml | |
| Mucin-nuklei färgning lösning | |||
| DAPI, 10 μg/mL | 20 ng/mL | 2 | Μl |
| lectin, 40 μg/mL | 1,6 μg/mL | 40 | Μl |
| PBS, pH 7,4 | 958 | Μl | |
Tabell 1: typiska volymer och koncentrationer av lösningar som används i detta protokoll.
Discussion
Den metod som beskrivs här tillåter visualisering av C. albicans jäst och hyfer i GI skrifter av Isaea koloniserade möss av alla kön eller stam. FISKEN sonden hybridizes till 23S rRNA, som distribueras i hela svampen cytoplasma. Vår metod har anpassats från ett tidigare rapporterat protokoll för visualisering av tarmbakterier20. Eftersom C. albicans ändrar sin morfologi inom värden, metoden är användbar för att övervaka svamp cell form samt lokalisering. Till exempel har vi använt denna metod för att motbevisa hypotesen att jäst dominerar hela mag-tarmkanalen, och att exponera avvikelser mellan in vivo och in vitro fenotyper av vissa "filamentation-defekta" mutanter12.
Flera musmodeller finns för C. albicans kommensaler Colonization. Bakterieflora av laboratoriemöss och människor är distinkta och, i möss, användning av antibiotika eller en specialiserad diet krävs för att etablera stabila kolonisering. Behandling med antibiotika ökar också C. albicans kolonisering av människor och är en viktig riskfaktor för disseminerad sjukdom10. De antibiotika som används i denna studie är relativt billiga och ger tillförlitliga minskningar i bakterieflora. Observera att antibiotika används för att minska bördan av antagonistiska bakteriearter, inte för att eliminera alla bakterier från djuren. Om forskare vill studera C. albicans-värd interaktioner i avsaknad av bakterier eller för att undvika användning av antibiotika eller en särskild diet, bakteriefria djur kan ersätta konventionellt uppfödda djur; men, gnotobiotiska möss uppvisar vissa immun-och anatomiska avvikelser och därför kanske inte lämpar sig för alla ändamål.
Flera steg är viktiga för lyckad fisk färgning: den rekommenderade fixeringsmetoden är avgörande för att bevara den strukturella integriteten hos GI-vävnader, särskilt det ömtåliga innehållet i tarmlumen, såsom slem skiktet och den tredimensionella organisering av svampar och bakterier16. Observera att många vanligt förekommande fixeringslösningar som innehåller vatten är mycket skadliga för luminala-arkitekturen. Fixeringsmedel och lösningar för tvättningar efter fixering som rekommenderas i detta protokoll innehåller inte vatten, och det är viktigt att undvika kontaminering med vatten. Ett annat kritiskt steg är hybridiserings steget, där det är viktigt att undvika avdunstning av hybridiserings lösningen under inkubering av rutschkanor i hybridiseringsugnen. Vi föreslår att du placerar diabilderna i en vattentät behållare för att undvika detta problem. Alternativt kan man använda vattentäta hybridiserings kammare som de som ursprungligen användes för hybridisering av Microarrays.
En C. albicans-specifik fisksond beskrivs i detta protokoll. Men eftersom många laboratorie uppfödda möss inte innehåller C. albicans eller andra svampar som en del av deras naturliga tarmbiota, en panfungal sond kan specifikt färga C. albicans i experimentellt koloniserade djur. Substitution av en panfungal sond kan vara önskvärt på grund av dess överlägsna hybridisering egenskaper och högre signal-brus-förhållande. Om panfungal sonden används som en pseudospecifik sond för C. albicans, det är viktigt att dokumentera en brist på färgning i icke-infekterade djur (dvs., behandlas med antibiotika men inte C. albicans). Färgning av en noncolonized kontrolldjur är också användbart för att bedöma bakgrunds färgning som kan resultera från vidhäftning av fisk sonder till matpartiklar. Övergripande, användning av fisk sonder erbjuder förbättrad specificitet över de flesta andra metoder för färgning svampar, såsom calcofluor vit (som fläckar Chitin, en cell vägg komponent som kan variera mellan celltyper), GMS, eller kommersiellt tillgängliga svampdödande antikroppar. Dessutom tillåter fisk färgning av flera organismer som använder differentially märkta fisk sonder till artspecifika rRNAs.
En varning för denna teknik är att vissa C. albicans jästcell typer verkar mycket lika av fisk (till exempel, den OGENOMSKINLIG och Gut celltyper). För att skilja mellan dessa celltyper, skulle det vara bra att utveckla hybridisering sonder till celltyp-specifik svamp mRNAs. Ändå, i sin nuvarande form, har fisk tekniken redan avslöjat överraskande avvikelser mellan in vivo och in vitro beteenden av C. albicans mutanter utvärderas under båda villkoren12, indikerar komplexa interaktioner i naturliga kommensaler miljö som inte är tillräckligt efterhärmade av befintliga in vitro-analyser. Ytterligare studier av olika C. albicans fläckar i ytterligare vild typ och Mutant värdar kommer sannolikt att ge ytterligare insikter i svamp-värd interaktioner. I synnerhet kommer det att vara lärorikt att profilera C. albicans i modeller av inflammatorisk tarmsjukdom, som är förknippad med höga titrar av c. albicans hos människor21, och andra modeller av c. albicans överväxt och sjukdom. FISK tekniken kan också kombineras med immunohistokemi för att fläcka specifika värdceller. Sammantaget ger den metod som presenteras här ett rimligt snabbt och tillförlitligt sätt att bestämma C. albicans lokalisering och morfologi inom DÄGGDJURS-GI-tarmkanalen.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka Carolina Tropini, Katharine ng, Justin Sonnenburg och KC Huang för vägledning i utvecklingen av fisk tekniken. Teresa o ' Meara gav hjälpsamma kommentarer om manuskriptet, och Miriam Levy hjälpte till med fotografering. Detta arbete stöddes av NIH Grants R01AI108992, R01DK113788, och en Burroughs Welcome Award i patogenesen för infektionssjukdomar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).
