Summary
Formålet med denne protokollen er å visualisere Candida albicans celle form og lokalisering i pattedyr tarmen.
Abstract
Candida albicans er en sopp komponent i tarm bakterieflora hos mennesker og mange andre pattedyr. Selv om C. albicans ikke forårsaker symptomer i de fleste kolonisert verter, gjør Commensal reservoaret fungerer som et oppbevaringssted for smittsomme sykdommer, og tilstedeværelsen av høye fungal titers i tarmen er assosiert med inflammatorisk tarmsykdom. Her beskriver vi en metode for å visualisere C. albicans celle morfologi og lokalisering i en mus modell av stabil Gastrointestinal kolonisering. Kolonisering er etablert ved hjelp av en enkelt dose av C. albicans i dyr som har blitt behandlet med oral antibiotika. Segmenter av tarmen vev er løst på en måte som bevarer arkitekturen av luminal innhold (mikroorganismer og Slim) samt verten mucosa. Endelig er fluorescerende in situ hybridisering utføres ved hjelp av sonder mot sopp rRNA å beis for C. albicans og hyfer. En viktig fordel med denne protokollen er at den tillater samtidig observasjon av C. albicans celle morfologi og dens romlige tilknytning til verts strukturer under Gastrointestinal kolonisering.
Introduction
Candida albicans er en sopp Commensal, så vel som en opportunistiske menneskelig patogen. Dette gjær mangler en definert miljømessige nisje og i stedet sprer innen Gastrointestinal (GI) skrift, hud, og urin skrift av mennesker og andre pattedyr1. Mens tidlig forskning på C. albicans fokuserte primært på dens virulens potensial, flere nylige rapporter tyder på at commensally spre organismer i tarmen kan spille viktige roller i normal helse, inkludert immun utvikling av Host2,3,4. For å lette undersøkelser av C. albicans commensalism innen pattedyr tarmen, utviklet vi en mus modell av stabil gi kolonisering og en fluorescens in situ HYBRIDISERING (fisk)-basert metode for å visualisere sopp gjærceller og hyfer innenfor tarm lumen.
Med noen unntak5, laboratorium-avlet mus typisk vise motstand mot sopp kolonisering av fordøyelseskanalen. Kolonisering motstand antas å være formidlet av bestemte bakterielle arter; Men, dette kan overvinnes ved behandling av dyrene med antibiotika6,7 eller bruk av en kjemisk definert diett som antagelig endrer bakterielle arter sammensetning8,9. På samme måte, hos mennesker, har bruken av bredspektret antibiotika vært forbundet med C. albicans overvekst og formidling10. Vår murine kolonisering modell bruker bredspektret antibiotika for å etablere C. albicans kolonisering av immunkompetente, konvensjonelt oppdratt mus. Penicillin og Streptomycin er gitt i dyrenes drikkevann i en uke før gavage med 108 koloni forming enheter (CFUs) av C. albicans. Så lenge antibiotika-tilført vann fortsetter, C. albicans vil spre gjennom gi-tarmkanalen, nå avføring titers av 106− 108 CFUs/g. Til tross for det høye nivået av sopp kolonisering, dyr forblir friske og få vekt på samme hastighet som infisert kontroller. Denne modellen har blitt brukt med hell til skjermen for og karakterisere flere C. albicans commensalism faktorer11,12.
I likhet med andre medlemmer av fungal riket, er C. albicans i stand til enorme morfologiske plastisitet13. Under in vitro forhold, har det vist seg å overgangen mellom minst seks encellede gjær celletyper, samt flercellede hyfer og pseudohyphae. Den gjær-til-hypha overgangen er en av sine best-preget virulens attributter, og hyfer og pseudohyphae dominerer i de fleste pattedyr sykdom modeller, så vel som i infiserte menneskelige vev. For å fastslå C. albicans lokalisering og celle morfologi innenfor murine fordøyelseskanalen, utviklet vi en Fish teknikk for farging gjær og hyfer i faste histologiske seksjoner. Den sonder består av fluorescensmerkete merket DNA oligonukleotider som hybridize til fungal 23S ribosomal RNA (rRNA), som er distribuert gjennom fungal cytoplasma. Fordi verten vev er løst på en måte som bevarer den tredimensjonale arkitekturen i tarmen, inkludert verten mucosa, fordøyelsesenzymer, bakteriell bakterieflora, og mucus i tarmen lumen, tillater denne teknikken lokalisering av fungal celler med hensyn til disse landemerkene når beiset. FISH teknikken sammenligner gunstig til tradisjonelle histologiske flekker for sopp, slik som periodisk acid Schiff (PAS) eller Gomori ' s Methenamine-Silver (GMS), så vel som kommersielt tilgjengelige Antifungal antistoffer, fordi disse reagensene ikke er spesifikke for C. albicans. Videre standard fiksativene fjerne mucus laget og forstyrre annet innhold i tarmen lumen14,15.
I denne artikkelen gir vi detaljerte instruksjoner for å etablere høyverdig C. albicans kolonisering av musen gi-tarmkanalen, for Disseksjon av fordøyelseskanalen fra euthanized dyr, for vev fiksering på en måte som bevarer luminal arkitektur, og for påvisning av C. albicans innen vert vev ved hjelp av fisk. I tillegg til vill type og mutant stammer av C. albicans, den gavage teknikken kan brukes til å levere andre mikroorganismer. Fiksering teknikken vil være nyttig for enhver studie der bevaring av gut innholdet er ønsket. FISKEN fremgangsmåte kan fullført innen en dag og kan brukes å lokalisere mangfoldig fungal art av benytter mangfoldig, differensielt benevnt sonder.
Protocol
Fremgangsmåten beskrevet nedenfor er godkjent av UCSF institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. Gastrointestinal kolonisering av mus med C. albicans bruke oral Gavage
- Gi boliger til 18 − 21 g hann-eller hunn mus (8 − 10 uker gammel) som godkjent av den lokale IACUC. Bruk autoklaveres mat og vann som starter på den første dagen.
Merk: Bruken av sterilisert bur, sengetøy, mat og vann reduserer risikoen for forurensning med antibiotika-resistente miljømessige bakterier som potensielt kan fortrenge C. albicans fra tarmen. Fremme, avhenger på eksperimentelle spørsmål, individ huset av dyrene burde være betraktet som fordi mus er coprophagic og gut innholdet ville være delt blant cohoused dyrene. - Dagen etter erstatter du det autoklaveres drikkevannet med autoklaveres vann som inneholder 5% glukose, 1 500 U/mL penicillin G og 2 mg/mL Streptomycin.
- For enkelhets skyld, forberede 200x antibiotika lager løsninger (tabell 1) på forhånd, filter sterilisere, og fryse ved-20 ° c.
- Vedlikeholde dyrene opp på antibiotika for ettall uke.
- Opp på dager 3 og 6 etter antibiotika ha blitt begynte, vurdere hver dyrene ' feces for forurense med Antibiotikum-motstandsdyktig aerobic bacteria. Avholde en dyr med ettall hånd, sted en uncapped microfuge rør like ved det anus og samle det vil si ettall avføring pellet.
- Resuspend hver avførings pellet i 1 mL sterilt vann og plate 100 μL på Luria buljong (LB), gjærekstrakt peptone druesukker (YEPD), eller hjerne hjertet infusjon (BHI) pluss blod agar plater. Ruge platene over natten i en standard inkubator (ikke anaerob) ved 37 ° c og vurdere for bakteriell vekst.
Merk: Platene bør vise minimal vekst (0 − 20 kolonier). Hvis > 20 kolonier av bakterier utvinnes fra dyr behandlet med penicillin og Streptomycin, er det usannsynlig at høyt nivå kolonisering med C. albicans vil bli etablert og eksperimentet skal avbrytes.
- Tre dager før gavage, strek C. albicans fra frosne glyserol aksjer til YEPD + 2% agar plater og ruge ved 30 ° c i 2 dager.
- En dag før gavage vaksinere en koloni av hver C. albicans stamme som skal testes inn i 5 ml flytende YEPD. Ruge ved 30 ° c over natten med risting.
- Morgenen gavage, fortynne mettet kultur av C. albicans til en optisk tetthet på 600 NM (OD600) av 0,1 i 100 ml YEPD Prewarmed til 30 ° c. Rist i en orbital shaker ved 200 RPM ved 30 ° c for mellom 4 t og 5 timer til OD600 når 1 (Mid-log vekst).
- Overfør hver 100 mL-kultur til 2 50 mL koniske rør og sentrifuge ved 3 000 x g i 5 min ved romtemperatur (RT).
Merk: C. albicans sprer relativt langsomt på RT. Hvis du tilpasser denne protokollen for en annen art, kan inocula må holdes på isen for å hindre fortsatt vekst. - Kast supernatanten, resuspend de pelleted cellene i 20 mL sterilt saltvann per 50 mL kultur, og basseng de dupliserte resuspendert pellets i enkelt koniske rør. Sentrifuger på 3 000 x g i 5 min.
- Kast supernatanten og resuspend i 20 mL sterilt saltvann. Vortex kort og fjerne 20 μL for OD600 måling. Fortynne 1:50 i steril normal saltvann. Sentrifuger de resterende resuspendert cellene ved 3 000 x g i 5 min.
- Kast supernatanten. For en inokulum størrelse på 1 x 108 CFU resuspend pelleted cellene til ca. 5 x 108 CFUs/ml i steril normal saltvann basert på estimert konsentrasjon fra OD600 måling.
Merk: Vanligvis tilsvarer en OD600 på 1 til ~ 1 x 107 gjærceller/ml. Denne verdien kan variere med spektrofotometer og bør verifiseres. Hvis en endring i konsentrasjonen er ønskelig for infeksjoner med en annen mikroorganismen, bør du planlegge et inokulum volum på ≤ 10 μL/g-mus for å minimere ubehag for dyret. - Kontroller konsentrasjonen av inokulum ved å telle en 1:1000-fortynning med en hemocytometer. Juster volumet av celler som skal gavaged basert på konsentrasjonen bestemmes ved hjelp av hemocytometer.
- Ved hjelp av et fôr nål (figur 1A), gavage hvert dyr med det beregnede volumet av en gitt inokulum. Se trinn 1.13.1 − 1.13.8 for gavage prosedyren.
Merk: trening for gavage bør fås fra en erfaren utøver, og prosedyren skal være mastret på forhånd. En vellykket prosedyre for et enkelt dyr tar vanligvis ikke lenger enn 1 min.- Fest en autoklaveres til en 1 mL sprøyte og fyll sprøyten med ett gavage volum, og fjern eventuelle luftbobler for å unngå en unøyaktig dose. Plasser på en steril overflate.
- Sikre dyret for gavage. Hold dyret på undersiden av halen med den dominerende hånden og skyv nondominant hånden opp dyret tilbake til den løse huden rett bak ørene.
- Bruk pekefingeren og tommelen på den nondominant hånden og samle den løse huden tett sammen; Dette er "scruff". Plukk opp dyret ved sin scruff og loop liten finger av samme (nondominant) hånd rundt halen å nakkens dyr mot håndflaten av hånden. Forleng forsiktig dyrets hode slik at hodet og kroppen (og derfor nakke og spiserør) er i en rett linje.
Merk: Forsøk på en gavage mens dyrets kropp er bøyd eller vridd kan føre til komplikasjoner som esophageal perforering og død av dyret. - Plukk opp sprøyten med den dominerende hånden og hold vinkelrett på dyret, med den buede nålen pekende ned (figur 1B). Bruk ballen på nålen, forsiktig kroken en innvendig hjørne av munnen, forsiktig forhånd nålen langs siden av munnen til baksiden av halsen, og til slutt flytte nålen til sentrum.
Merk: Innføring av nålen langs en lateral bane bidrar til å unngå motstand fra dyrets tenner og tungen. - Når ballen på nålen er på baksiden av halsen, vipp nålen opp slik at den er parallell med dyrets Kroppslinje (figur 1C).
Merk: På dette punktet, vil dyret viser en gag refleks. Dette er et godt tegn som indikerer at nålen er plassert riktig, og gagging bevegelse bidrar til å veilede nålen ned spiserøret. Hvis det ikke er vits refleks, kan nålen være i luftrøret i stedet for spiserøret. Trekk forsiktig ut nålen og gå tilbake til trinn 1.13.1. - La dyret å svelge inokulum til bare noen få millimeter forbli synlig (figur 1D). Før nålen jevnt.
Merk: Hvis nålen ikke forhånd, unngå å bruke makt, noe som kan skade spiserøret. Noen ganger fremme den siste halv centimeter vil kreve en ekstra stor vits fra dyret. Hvis nålen ser ut til å være fast, langsomt trekke det tilbake og prøv igjen fra trinn 1.13.4. - Test at ballen på nålen er på riktig sted (magen) ved å forsiktig fremme stempelet. Hvis det ikke er motstand, Fortsett å levere inokulum. Når inokulum er administrert, trekk nålen langsomt ut.
- Ombytte dyret inne dens bur og fortsette å dataskjerm dyret for 5 − 10 min for underskriver av anstrengt åndedrag eller nød. Kontroller at dyret gjenopptar normal aktivitet kort tid etter gavage.
- Hvis den samme inokulum skal brukes med neste dyr, rengjør du nålen med en alkoholserviett. Gå tilbake til trinn 1.13.1. Hvis en annen inokulum vil bli brukt, bruk en ny nål og gå tilbake til trinn 1.13.1.
Merk: Det er viktig å inspisere dyr dagen etter gavage. Dyr viser tegn på nød (f. eks bøyd holdning, anstrengt pust) bør være humant euthanized, som de har sannsynligvis lidd esophageal brudd, skader på lungene, eller en annen intern skade som utvinning er usannsynlig.
- Etter gavage av dyrene, plate fortynninger av inocula for dose verifisering.
- Forbered 10-fold seriell fortynninger opp til 1:105. Plate en gavage volum av 1:105 fortynning på en 100 mm plate av Sabouraud druesukker agar.
- Ruge platen i 2 dager ved 30 ° c. Count CFUs å bekrefte inokulum dose.
2. utarbeidelse av gastrointestinal vev for histologi
Merk: Denne delen av protokollen er tilpasset fra Johansson og Hansson16.
- Forbered 500 mL methacarn oppløsning (60% metanol, 30% kloroform, 10% bre eddiksyre) i en stor skrue cap plast krukke for hver 2 dyr dissekert.
Forsiktig: Metanol og kloroform er skadelige ved innånding og bør manipuleres i en kjemisk hette. Kan være etsende og bør håndteres med riktig personlig verneutstyr. Metanol, kloroform og isbre eddiksyre skal kastes som farlig avfall. - På det eksperimentelle endepunktet, euthanize dyrene humant i henhold til en protokoll godkjent av den lokale IACUC.
Merk: I antibiotika-behandlede dyr, C. albicans kolonisering vanligvis spenner fra ~ 106 CFUs/g på dag 5 opp til ~ 5 x 107 CFUs/g etter dag 25. - Sterilisere disseksjon verktøy med 10% blekemiddel og skyll med 70% etanol.
- Fest hvert dyr til en disseksjon overflate, med ventrale IDen vendt opp. Bruk 30 G nåler for å feste lemmer til disseksjon overflate (figur 2A). Spray dyret med 70% etanol å rengjøre pelsen og minimere stikker til verktøy.
- Ved hjelp av Butt-endte tang, klype en del av abdominal hud med nondominant hånd. Bruke saks med dominerende hånd, incise huden og underliggende konseptet nær bunnen av bekkenet. Forleng snittet i en U-form langs hver side av bukhulen og opp til rib bur. Løft huden ut av veien.
- Ved hjelp av en blyant, prelabel histologi kassetter for GI segmenter som skal vurderes. For hvert dyr kan du for eksempel merke separate kassetter som "mage", "proksimale små tarmer", "midt i små tarmen", "cecum små tarmen", "" og "store tarmen". Plasser en skum pute på undersiden av hver kassett (figur 2a).
Merk: figur 2B skisserer foreslåtte seksjoner for å plassere i kassetter. - Ved hjelp av stump-endte tang, forsiktig trekke ut cecum fra bukhulen. Bruk saks til å bryte forbindelser mellom cecum og små og store tarmen.
Merk: Cecal vev er svært delikat og lett å sprekke. Vær forsiktig når du manipulerer. - Plasser hele cecum i en histologi kassett slik at den er snodd og ligger flatt (figur 2C). Plasser en ekstra skum pute oppå og Lukk kassetten. Plasser kassetten i en krukke med skrulokk som inneholder methacarn.
- Avgiftsdirektoratet en del av den store tarmen som inneholder 1 − 2 avførings pellets, med en lengde mindre enn kassetten.
- Plasser vevs delen i kassetten, og hold vevet flatt og snodd. Overlegg med en ekstra skum pute og Lukk kassetten. Plasser kassetten i methacarn.
- For hver del av den lille tarmen som skal samplet, forbrukeravgift en 1 − 2 cm segment som inneholder noen fordøyelseskanal materiale.
- Plasser segmentet i en histologi kassett, holde vevet flatt og snodd. Overlegg med en ekstra skum pute og Lukk kassetten. Plasser kassetten i methacarn.
- For magen, bryte forbindelsene til spiserøret og små tarmen. Plasser i en kassett, holde vevet flatt og snodd. Overlegg med en ekstra skum pute og Lukk kassetten. Plasser kassetten i methacarn.
- La kassettene i methacarn løsning på RT i minst 3 timer og mindre enn 2 uker.
Merk: Det finnes flere punkter der de faste GI-segmentene kan overføres til en kommersiell histologi tjeneste. Disse vev kan være vanskelig å seksjon uten forstyrrelse av luminal innhold, og optimale resultater vil bli oppnådd av en erfaren tekniker. Hvis den kommersielle tjenesten er villig til å utføre vasker før innebygging av vev i parafin, kan kassettene sendes på dette stadiet sammen med instruksjoner for trinn 2,16. - Begynn å smelte nok parafinvoks til å dekke alle vevs kassetter i et stort beger i en forvarmet 70 ° c hybridisering ovn.
- Etter fiksering, fjerne skum pads og returnere hver intakt vev delen tilbake til sin kassett. Vask vevet med følgende løsninger på RT med risting: to ganger for 35 min i 100% metanol, to ganger i 25 min i 100% etanol, to ganger i 20 min i xylen.
Forsiktig: Xylen er brannfarlig, giftig, og kan forårsake skade ved innånding. Bruk i en kjemisk hette med riktig beskyttelse. Kassering av xylen via farlige avfalls prosedyrer. - Klapp kassettene tørre på et papir håndkle og plasser i premelted parafinvoks for 2 t ved 70 ° c i en hybridisering ovn. Sørg for at kassettene er fylt med parafin og at det ikke gjenstår bobler.
Merk: Dette trinnet gjør at voks å infiltrere GI segmentet og å stabilisere vev og innhold. - Fjern kassetter fra voks, la overflødig voks renne, og oppbevar på RT før de er innebygd i voks blokker. Kast voks som inneholder spormengder xylenes som farlig avfall.
Merk: The Noble Lab bruker en kommersiell histologi tjeneste for innebygging og skjæring av vev. For standard visualisering av C. albicans gjær og hyfer, 4 μm seksjoner brukes. For å evaluere tilkobling av hyphal segmenter, som vanligvis strekker seg gjennom flere plan, kan 8 μm seksjoner brukes. Avhengig av evnen til fiske sonder til å trenge inn i prøven, kan det være mulig å bruke enda tykkere seksjoner.
3. validering av nylig designede sonder
Merk: Følgende protokoll for validering av C. albicans sonder ble tilpasset fra Swidsinski et al.17.
- Stripe C. albicans SC5314 og nært beslektede komparator arter (f. eks Candida dubliniensis, Candida TROPICALIS) til YEPD + 2% agar plater. Ruge for 1 − 2 dager ved 30 ° c.
- Vaksinere 5 mL flytende YEPD medium med en enkelt koloni.
- Pipetter 1 mL av de suspenderte cellene til et mikrosentrifugen rør og sentrifuger ved 3 000 x g i 5 min. kast supernatanten.
- Resuspend av pellet i 100, μL av fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Pipette 5 − 10 μL av resuspendert celler og flekk på et glass lysbilde. Spre seg til en større sirkel og la det tørke.
Merk: Hvis cellene ikke er tilhenger, bruke Poly-L-lysin belagt lysbilder. - Sett ring rundt celle stedet med en PAP-penn og dekk med 50 μL av 2,5% paraformaldehyde (PFA) i PBS. Ruge for RT for 10 min.
Forsiktig: PFA er brannfarlig og kan forårsake helseproblemer ved innånding eller hudkontakt. Gjenstander som er forurenset med PFA skal kastes som farlig avfall. - Vask 3x med PBS. Trykk væske av på papir håndkle og dekk med 100 μL av PBS. Gjenta to ganger. Kast siste vask.
-
Klargjør lysbilder for multiday lagring. Hvis du utfører FISH på samme dag, går du videre til trinn 3,9 uten trinnene i dette avsnittet.
Merk: det er å foretrekke å utføre hybridisering umiddelbart, men hvis kort tid følger trinn 3,8 før lagring. Lysbildene kan lagres i flere dager ved 4 ° c.- Dekk stedet med 60% etanol. Ruge ved RT for 3 min. kast løsningen.
- Dekk stedet med 80% etanol. Ruge ved RT for 3 min. kast løsningen.
- Dekk stedet med 100% etanol. Ruge ved RT for 3 min. kast løsningen. Gå videre til trinn 3,9.
- Plasser lysbildene avdekket i en hybridisering ovn ved 50 ° c for 1 t. Hvis trinn 3,8 ble fulgt, lagrer du lysbildene ved 4 ° c. Hvis ikke, går du videre til trinn 4,2 for å utføre hybridisering-protokollen.
4. fisk Sstaining i GI luftveiene vev
- Dewax parafin-embedded histologiske seksjoner.
- I en hybridisering ovn, prewarm en Coplin krukke fylt med xylen til 60 ° c.
- Sett inn lysbildene i den xylen fylte glasset. Sted ved 60 ° c i 10 min. kast xylen vask. Hold lysbildene i glasset og hell av xylen i en avfallsbeholder.
- Hell den ferske RT xylen inn i glasset og ruge ved 60 ° c i 10 min. kast den andre xylen vasken.
- Fyll glasset med 100% etanol og ruge ved RT i 5 min. Fjern lysbildene fra glasset og lufttørke.
- Sett hybridisering ovnen til 50 ° c for trinn i avsnitt 4,2.
- Stain C. albicans med fisken sonde.
- Forbered 1 mL fersk hybridisering oppløsning (20 mM Tris – HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl, 0,1% natrium natriumdodecylsulfat sulfat [SDS], 1% formamid i RNase fritt vann). Se tabell 1 for eksempel beregninger.
- Bland sammen 50 μL av hybridisering oppløsning med 1 μL C. albicans probe (5 ' CY3-ACAGCAGAAGCCGTGCC 3 '; 50 μg/ml i RNase vann) for et endelig sonde beløp på 0,5 μg per lysbilde.
Merk: Mange laboratorie-avlet mus ikke inneholder noen sopp blant sine bakterieflora. I dette tilfellet er det mulig å erstatte en panne sopp sonde (5 ' Cy3-CTCTGGCTTCACCCTATTC 3 ') som anerkjenner 23S rRNA av de fleste fungal arter, ikke bare C. albicans. I forfatterens erfaring, gir panfungal sonden lysere farging enn C. albicans-spesifikk sonde. - Beskytt oppløsningen mot lys og prewarm til 50 ° c.
- Bruk en PAP-penn til å tegne en sirkel rundt vevs delen fra avsnitt 4,1.
- Pipetter 50 μL av sonde-inneholdende hybridisering oppløsning på det faste vevet og spres forsiktig over vevs delen med en pipette spiss. Overlapp væsken med en hybridisering dekkglass sørge for å hindre bobler.
- Forsegle lysbildene i et vanntett hybridisering kammer og ruge seksjonene for 3 t ved 50 ° c i mørket i en hybridisering ovn.
- I mellomtiden forbereder 50 mL av fisk vaskeløsning (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl i RNase-fritt vann). Se tabell 1 for eksempel beregninger.
- Flytt vaskeløsningen til 50 ° c til prewarm.
- Etter 3 timer, tilsett vaskeløsningen til en Coplin jar. Deretter forsiktig fjerne dekkglass fra raset med pinsett og plasser raset i vaskeløsningen.
- Dekkglasset med aluminiumsfolie og ruge ved 50 ° c i 20 min.
- Under denne inkubasjons, forberede mucin-kjerner farge løsning (20 ng/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], 1,6 μg/mL fluorescein isothiocyanate [FITC]-Lektiner i PBS). Se tabell 1 for eksempel beregninger. For mage og store tarmen, bruk FITC-Ulex Tiriltunge agglutinin 1 (UEA-1). For liten tarmen og cecum, bruk en kombinasjonen av FITC-UEA-1 og FITC-wheat bakterie agglutinin (WGA).
Merk: Lectins fra forskjellige arter gjenkjenne forskjellige sukker modifikasjoner av glykoproteiner som mucin. De Lektiner kombinasjonene som anbefales her, ble fastslått empirisk for optimal farging av Slim i forskjellige GI-rom. - Vask lysbildene ved å helle av FISH vaskeløsningen og etterfylle glasset med RT PBS. Hell av PBS umiddelbart og refill med PBS. Hell av PBS for totalt 2 vasker.
- Wick bort PBS med en delikat oppgave visker vev og sirkel tarm vevet delen med en PAP penn. Legg lysbildene i en ugjennomsiktig plastbeholder og tilsett 50 μL av mucin til vevs delen. Dekk beholderen med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys. Ruge ved 4 ° c i 45 min.
- Plasser lysbildene i en Coplin jar og vask raskt to ganger i PBS på RT.
- Trykk unna overflødig PBS på et papir håndkle, og deretter isolere bort den endelige dråper PBS med et vev.
- Plasser en dråpe montering medium på hver del og overlegg med et glass dekkglass, forebygge bobler. La festemiddelet spres under hele dekkglass. For umiddelbar bildebehandling, forankre dekkglass på plass med neglelakk i hjørnene. For langtidslagring, forsegle rundt dekkglass med neglelakk.
- Bilde lysbildene ved hjelp av et fluorescerende mikroskop.
Representative Results
Etter instruksjonene, vil utfallet av denne teknikken være fluorescerende merking av kjerner i verten epitel, mucus, og C. albicans i delt gi vev. Wild type Candida albicans celler skal vises som enten runde, encellede gjærceller eller svært langstrakt, noen ganger forgrening, flercellede hyfer (celle-celle divisjoner vil ikke være synlig i hyfer). Mutanter av C. albicans kan i tillegg vises som mindre, litt langstrakt "grå" gjær eller som større, litt LANGSTRAKT "gut" (gastrointestinal-indusert overgang) eller "ugjennomsiktig" gjær.
Figur 1 viser fôrings nålen som brukes til oral gavage, i tillegg til nøkkel posisjonene til nålen under gavage prosedyren. Figur 2 gir et typisk oppsett som brukes for orgel disseksjon og UTSEENDET til gi-segmenter av musen.
Figur 3 viser fisk farging av forskjellige C. albicans celletyper etter forplantning in vitro og innenfor muse modellen. Figur 3A viser fluorescens og fase bilder av faste, permeabilized, in vitro-spredte hyfer. Hypha formasjon ble indusert med flytende Lee ' s medium18 med 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8 ved 37 ° c. Figur 3B viser fluorescens og fase bilder av faste, permeabilized, in vitro-spredte gjærceller. Figur 3C, D viser faste, permeabilized, in vitro-spredte gut celler og ugjennomsiktige celler, henholdsvis. GUT og ugjennomsiktige celletyper er morfologisk umulig å skille bortsett fra når det vises ved å skanne elektron mikroskopi. Vær oppmerksom på at FISH farging av in vitro-spredte celler vil bli suboptimal hvis cellene ikke er godt permeabilized. Et eksempel på svake og diffuse flekker er vist i Figur 3C. For best resultat, bør celle fiksering og permeabilization forhold bestemmes empirisk for hver celle type og arter som skal undersøkes. Heldigvis, den anbefalte protokollen for å visualisere C. albicans i delt vev produserer mer konsistent permeabilization.
Figur 3e-G avbilder C. albicans i mus stort tarmen, beiset med C. albicans-spesifikk sonde (Figur 3E) eller panfungal sonden (Figur 3F, G). C. albicans vises rødt i disse bildene, vert cellekjerner er blå, og mucus laget er grønt. Både rund gjær og svært langstrakt hyfer (hvit pilspisser) forekommer i det store tarmen. Vær oppmerksom på at farging er lysere med panfungal sonde. Figur 3G skildrer en ume6 mutant i samme kupé, beiset med panfungal sonde. ume6 koder en transkripsjon faktor som er nødvendig for hypha formasjon under in vitro forhold19 . Interessant nok er det gjær-låste fenotype som vises av denne mutant under in vitro forhold ikke sammenfattet i tarmen, noe som tyder på at en redundant faktor må aktiveres innenfor verten12. Figur 4 viser utseendet av vill type C. albicans i ulike segmenter av murine gi-kanalen, inkludert regionene umiddelbart tilstøtende til verten mucosa og mer sentrale områder av tarmen lumen.
Figur 1: tast fôring nål posisjoner under gavage. (A) fôring nål. (B) fôring nål ball inn på siden av tungen. (C) fôring nål i oppreist stilling med innsetting i spiserøret. (D) fôring nål inn i magen med noen få millimeter synlig over nesen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: eksempel disseksjon oppsett. (A) disseksjon pad og verktøy. (B) excised gi luftveiene. Proksimale (spiserør) for å (anus) seksjoner: I. mage. II. proksimale små tarmer. III. midtre liten tarmen. IV. hånd i små tarmen. V. cecum. VI. tykktarmen. Rosa stiplede grense bokser angir at vevet skal fikses. (C) vev plassert i kassetter. Romertall er de samme som i panel B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative bilder av fisk-farget c. albicans. (A) fisk av C. albicans hyfer dyrket i flytende Lee ' s Media18 med 2% N-acetylglucosamine, pH 6,8. (B) fisk av C. albicans runde gjærceller dyrket på YEPD + 2% agar plater. (C) fisk av C. albicans gut celler (YSN1045) dyrket på YEPD + 2% agar plater. (D) fisk av C. albicans UGJENNOMSIKTIG celler dyrket på YEPD + 2% agar plater. (E) vill type C. albicans (ySN250) i store tarmen, beiset med C. albicans-spesifikk sonde. (F) vill type C. albicans i stort tarmen, beiset med panfungal sonde. (G) Ume6 mutant (ySN1479) i stort tarmen, farget med panfungal sonde: rødt er C. albicans, blå er vert epitel kjerner, og grønt er mucin. Pilspisser angir hyfer. Piler indikere gjær. Skala bars = 20 μm. bilder F og G er tilpasset fra Witchley et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: utseende av fiske-farget C. albicans i forskjellige tarm rom. Wild type C. albicans er vist i de indikerte segmenter av musen gi luftveiene. Innenfor hvert rom, bilder avbilder området ved siden av verten mucosa og den sentrale regionen i tarmen lumen. Farging ble utført med panfungal sonde. Scale bar = 20 μm. bildene er tilpasset fra Witchley et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Antibiotika aksjer (200x) | |||
| Penicillin G | 181 mg/mL | ||
| Streptomycin | 400 mg/μL | ||
| Methacarn | |||
| Lager | Endelig konsentrasjon | Volum | Enheter |
| Metanol | 60 prosent | 300 | Ml |
| Kloroform | 30 | 150 | Ml |
| Bre eddiksyre | 10 | 50 | Ml |
| Hybridisering løsning | |||
| Lager | Endelig konsentrasjon | Volum | Enheter |
| 1 M Tris-HCl, pH 7,4 | 20 mM | 20 | μL |
| 5 M NaCl | 0,9 til 5m | 180 | μL |
| 10% SDS | 0,10 prosent | 10 | μL |
| 100% formamid | 1,00 prosent | 10 | μL (oppbevares i små alikvoter ved-20 ° c mellom bruk) |
| RNase-fritt vann | 780 | μL | |
| FISK vaskeløsning | |||
| 1 M Tris-HCl, pH 7,4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M NaCl | 0,9 til 5m | 9 | Ml |
| RNase-fritt vann | 40 | Ml | |
| Mucin-kjerner farging løsning | |||
| DAPI, 10 μg/mL | 20 ng/mL | 2 | μL |
| Lektiner, 40 μg/mL | 1,6 μg/mL | 40 | μL |
| PBS, pH 7,4 | 958 | μL | |
Tabell 1: typiske volumer og konsentrasjoner av løsninger som brukes i denne protokollen.
Discussion
Metoden beskrevet her kan for visualisering av C. albicans gjær og HYFER i gi traktater av commensally kolonisert mus av noe kjønn eller belastning. FISKEN sonde hybridizes til 23S rRNA, som er fordelt gjennom fungal cytoplasma. Vår metode var tilpasset fra en tidligere rapportert protokoll for å visualisere gut bakterier20. Fordi C. albicans endrer sin morfologi i verten, er metoden nyttig å overvåke sopp celle form og lokalisering. For eksempel har vi brukt denne metoden for å motbevise hypotesen om at gjær dominerer gjennom fordøyelseskanalen, og for å avdekke avvik mellom in vivo og in vitro fenotyper av visse "filamentation-defekt" mutanter12.
Flere musemodeller finnes for C. albicans Commensal kolonisering. Bakterieflora av laboratoriet mus og mennesker er distinkte, og i mus, bruk av antibiotika eller en spesialisert diett er nødvendig for å etablere stabil kolonisering. Behandling med antibiotika også forbedrer C. albicans kolonisering av mennesker og er en stor risikofaktor for spres sykdom10. Antibiotika som brukes i denne studien er relativt billig og gir pålitelig nedgang i bakteriell bakterieflora. Merk at antibiotika brukes til å redusere byrden av fiendtlige bakterielle arter, for ikke å eliminere alle bakterier fra dyrene. Hvis forskerne ønsker å studere C. albicans-vert interaksjoner i fravær av bakterier eller for å unngå bruk av antibiotika eller en spesiell diett, bakterie-frie dyr kan erstatte konvensjonelt oppdratt dyr; men gnotobiotic mus viser visse immun-og anatomiske misdannelser, og er derfor kanskje ikke egnet for alle formål.
Flere trinn er viktig for vellykket fisk farging: den anbefalte fiksering metoden er avgjørende for å bevare den strukturelle integriteten til GI vev, spesielt den skjøre innholdet i tarmen lumen, slik som mucus laget og de tre-dimensjonale organisering av sopp og bakterier16. Vær oppmerksom på at mange ofte brukte fiksering løsninger som inneholder vann er svært skadelig for luminal arkitektur. Fiksativene og løsningene for etter fikserings vasker som anbefales i denne protokollen, inneholder ikke vann, og det er viktig å unngå forurensning med vann. Et annet kritisk trinn er hybridisering trinnet, der det er viktig å unngå fordamping av hybridisering løsningen under inkubasjons av lysbildene i hybridisering ovnen. Vi anbefaler at du plasserer lysbildene i en vanntett beholder for å unngå dette problemet. Alternativt kan man bruke vanntette hybridisering kamre som de som opprinnelig ble brukt til hybridisering av Microarrays.
En C. albicans-spesifikk Fish probe er beskrevet i denne protokollen. Men fordi mange laboratorie-reist mus ikke inneholder C. albicans eller andre sopp som en del av deres naturlige gut bakterieflora, en panfungal sonde kan spesielt flekken C. albicans i eksperimentelt kolonisert dyr. Substitusjon av en panfungal sonde kan være ønskelig på grunn av sin overlegne hybridisering egenskaper og høyere signal-til-støy-forhold. Hvis panfungal sonden brukes som en pseudospecific sonde for C. albicans, er det viktig å dokumentere en mangel på flekker i friske dyr (dvs. behandlet med antibiotika, men ikke C. albicans). Farging av en noncolonized kontroll dyr er også nyttig å vurdere bakgrunnen flekker som kan oppstå fra overholdelse av fisk sonder til mat partikler. Samlet sett tilbyr bruk av fisk sonder forbedret spesifisitet over de fleste andre metoder for farging sopp, for eksempel Calcofluor hvit (som flekker kitin, en cellevegg komponent som kan variere mellom celletyper), GMS, eller kommersielt tilgjengelige soppdrepende antistoffer. Dess, FISH flekker gjør det mulig for costaining av flere organismer bruker differensielt merket FISH sonder til arter-spesifikke rRNAs.
En påminnelse om denne teknikken er at enkelte C. albicans gjær celletyper vises svært like av fisk (for eksempel den UGJENNOMSIKTIGE og gut celletyper). For å skille mellom disse celletyper, ville det være nyttig å utvikle hybridisering sonder til celle type-spesifikke fungal mRNAs. Likevel, i sin nåværende form, har FISKEN teknikken allerede avdekket overraskende avvik mellom in vivo og in vitro atferd av C. albicans mutanter evaluert under begge forhold12, noe som indikerer komplekse interaksjoner i naturlig Commensal miljø som ikke er tilstrekkelig etterlignet av eksisterende in vitro-analyser. Videre studier av forskjellige C. albicans flekker i flere vill-type og mutant verter vil trolig gi ytterligere innsikt i fungal-Host interaksjoner. Spesielt vil det være lærerikt å profil C. albicans i modeller av inflammatorisk tarmsykdom, som er forbundet med høy titers av c. albicans hos mennesker21, og andre modeller av c. albicans overvekst og sykdom. FISKEN teknikken kanskje likeledes være kombinert med immunhistokjemi å flekk spesifikk vert celler. Samlet, metoden som presenteres her gir en rimelig rask og pålitelig måte å fastslå C. albicans lokalisering og morfologi i pattedyr gi-tarmkanalen.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Carolina Tropini, Sonnenburg, Justin, og KC Huang for veiledning i utviklingen av FISH teknikken. Teresa O ' meara gitt nyttige kommentarer på manuskriptet, og Miriam Levy assistert med fotografering. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R01AI108992, R01DK113788, og en Burroughs velkommen Award i patogenesen av smittsomme sykdommer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al.
