Syftet med detta protokoll är att visualisera Candida albicans cell form och lokalisering i däggdjurs mag-tarmkanalen.
Candida albicans är en svamp komponent i tarmen bakterieflora hos människor och många andra däggdjur. Även om C. albicans inte orsakar symptom i de flesta koloniserade värdar, den kommensaler reservoaren fungerar som en förvaringsplats för infektionssjukdomar, och närvaron av hög svamp-titrar i tarmen är associerad med inflammatorisk tarmsjukdom. Här beskriver vi en metod för att visualisera C. albicans cellmorfologi och lokalisering i en musmodell av stabil gastrointestinal kolonisering. Koloniseringen är etablerad med hjälp av en engångsdos av C. albicans hos djur som har behandlats med orala antibiotika. Segment av tarm vävnad är fasta på ett sätt som bevarar arkitekturen i luminala innehåll (mikroorganismer och slem) samt värd slemhinnan. Slutligen, fluorescerande in situ hybridisering utförs med hjälp av sonder mot svamp rRNA att färga för C. albicans och hyfer. En viktig fördel med detta protokoll är att det möjliggör samtidig observation av C. albicans cellmorfologi och dess rumsliga Association med värdstrukturer under gastrointestinal kolonisering.
Candida albicans är en svamp kommensaler samt en opportunistisk mänsklig patogen. Denna jäst saknar en definierad miljö nisch och i stället sprider sig inom den gastrointestinala (GI) tarmkanalen, hud, och urogenital tarmkanalen av människor och andra däggdjur1. Den tidiga forskningen om C. albicans fokuserade främst på dess virulenspotential, men flera nya rapporter tyder på att Isaea föröknings organismer i tarmen kan spela viktiga roller vid normal hälsa, inklusive immun utvecklingen hos värd2,3,4. För att underlätta utredningar av C. albicans commensalism inom däggdjurs tarmen, utvecklade vi en musmodell av stabil GI kolonisering och en fluorescens i situ hybridisering (fisk)-baserad metod för att visualisera svampceller jäst och hyfer inom tarm lumen.
Med några undantag5, laboratoriefödde möss uppvisar typiskt resistens mot svamp kolonisering av mag-tarmkanalen. Kolonisering motstånd tros vara förmedlas av specifika bakteriearter; emellertid, detta kan övervinnas genom behandling av djuren med antibiotika6,7 eller användning av en kemiskt definierad diet som förmodligen förändrar bakterieart sammansättning8,9. På samma sätt, hos människor, användning av bredspektrumantibiotika har förknippats med C. albicans överväxt och spridning10. Vår murina kolonisationsmodell använder bredspektrumantibiotika för att etablera C. albicans kolonisering av immunkompetenta, konventionellt uppfödda möss. Penicillin och streptomycin tillhandahålls i djurens dricksvatten i en vecka före sonden med 108 Colony Forming enheter (cfus) av C. albicans. Så länge antibiotikum-infunderas vatten fortsätter, C. albicans kommer att propagera genom magtarmkanalen, nå fekal titrar av 106− 108 cfus/g. Trots den höga nivån av svamp kolonisering, djur förbli friska och få vikt i samma takt som icke-infekterade kontroller. Denna modell har använts framgångsrikt för att skärmen för och karakterisera flera C. albicans commensalism faktorer11,12.
Liksom andra medlemmar av svampens rike, C. albicans klarar av enorma morfologiska plasticitet13. Under in vitro-förhållanden, det har visat sig övergången bland minst sex encelliga jästcelltyper, samt multicellulära hyfer och pseudohyfer. Jästen till hypha övergången är en av dess bäst kännetecknas virulens attribut, och hyfer och pseudohyfer dominerar i de flesta däggdjurs sjukdomar modeller, liksom i infekterade mänskliga vävnader. För att bestämma C. albicans lokalisering och cellmorfologi inom murina mag-tarmkanalen, vi utvecklat en fisk teknik för färgning jäst och hyfer i fasta histologiska sektioner. Sonderna består av Fluorescent märkt DNA oligonukleotides att hybridisera till svamp 23S ribosomal RNA (rRNA), som distribueras i hela svampens cytoplasma. Eftersom värd vävnader är fast på ett sätt som bevarar den tredimensionella arkitekturen i tarmen, inklusive värd slemhinnan, matsmältningsorganen material, bakterieflora, och slem i tarmen lumen, denna teknik tillåter lokalisering av svamp celler med avseende på dessa landmärken när de färgas. FISK tekniken jämförs positivt med traditionella histologiska fläckar för svampar, såsom periodiska acid Schiff (PAS) eller Gomoris Metenamin-Silver (GMS), samt kommersiellt tillgängliga antimykotiska antikroppar, eftersom dessa reagenser inte är specifika för C. albicans. Dessutom, standard fixativ bort slem skiktet och störa andra innehållet i tarmen lumen14,15.
I denna artikel, vi ger detaljerade instruktioner för upprättande av hög kvalitet C. albicans kolonisering av mus GI-tarmkanalen, för dissektion av mag-tarmkanalen från euthanized djur, för vävnadfixering på ett sätt som bevarar luminala och för detektion av C. albicans inom värd vävnader med hjälp av fisk. Förutom vildtyp och muterade stammar av C. albicans, kan sonddage tekniken användas för att leverera andra mikroorganismer. Fixeringstekniken skulle vara användbar för alla studier där konservering av tarminnehåll önskas. FISKEN förfarandet kan slutföras inom en dag och kan användas för att lokalisera flera svamparter med hjälp av flera, differentially märkta sonder.
Den metod som beskrivs här tillåter visualisering av C. albicans jäst och hyfer i GI skrifter av Isaea koloniserade möss av alla kön eller stam. FISKEN sonden hybridizes till 23S rRNA, som distribueras i hela svampen cytoplasma. Vår metod har anpassats från ett tidigare rapporterat protokoll för visualisering av tarmbakterier20. Eftersom C. albicans ändrar sin morfologi inom värden, metoden är användbar för att övervaka svamp cell form samt lokalisering. Till exempel har vi använt denna metod för att motbevisa hypotesen att jäst dominerar hela mag-tarmkanalen, och att exponera avvikelser mellan in vivo och in vitro fenotyper av vissa “filamentation-defekta” mutanter12.
Flera musmodeller finns för C. albicans kommensaler Colonization. Bakterieflora av laboratoriemöss och människor är distinkta och, i möss, användning av antibiotika eller en specialiserad diet krävs för att etablera stabila kolonisering. Behandling med antibiotika ökar också C. albicans kolonisering av människor och är en viktig riskfaktor för disseminerad sjukdom10. De antibiotika som används i denna studie är relativt billiga och ger tillförlitliga minskningar i bakterieflora. Observera att antibiotika används för att minska bördan av antagonistiska bakteriearter, inte för att eliminera alla bakterier från djuren. Om forskare vill studera C. albicans-värd interaktioner i avsaknad av bakterier eller för att undvika användning av antibiotika eller en särskild diet, bakteriefria djur kan ersätta konventionellt uppfödda djur; men, gnotobiotiska möss uppvisar vissa immun-och anatomiska avvikelser och därför kanske inte lämpar sig för alla ändamål.
Flera steg är viktiga för lyckad fisk färgning: den rekommenderade fixeringsmetoden är avgörande för att bevara den strukturella integriteten hos GI-vävnader, särskilt det ömtåliga innehållet i tarmlumen, såsom slem skiktet och den tredimensionella organisering av svampar och bakterier16. Observera att många vanligt förekommande fixeringslösningar som innehåller vatten är mycket skadliga för luminala-arkitekturen. Fixeringsmedel och lösningar för tvättningar efter fixering som rekommenderas i detta protokoll innehåller inte vatten, och det är viktigt att undvika kontaminering med vatten. Ett annat kritiskt steg är hybridiserings steget, där det är viktigt att undvika avdunstning av hybridiserings lösningen under inkubering av rutschkanor i hybridiseringsugnen. Vi föreslår att du placerar diabilderna i en vattentät behållare för att undvika detta problem. Alternativt kan man använda vattentäta hybridiserings kammare som de som ursprungligen användes för hybridisering av Microarrays.
En C. albicans-specifik fisksond beskrivs i detta protokoll. Men eftersom många laboratorie uppfödda möss inte innehåller C. albicans eller andra svampar som en del av deras naturliga tarmbiota, en panfungal sond kan specifikt färga C. albicans i experimentellt koloniserade djur. Substitution av en panfungal sond kan vara önskvärt på grund av dess överlägsna hybridisering egenskaper och högre signal-brus-förhållande. Om panfungal sonden används som en pseudospecifik sond för C. albicans, det är viktigt att dokumentera en brist på färgning i icke-infekterade djur (dvs., behandlas med antibiotika men inte C. albicans). Färgning av en noncolonized kontrolldjur är också användbart för att bedöma bakgrunds färgning som kan resultera från vidhäftning av fisk sonder till matpartiklar. Övergripande, användning av fisk sonder erbjuder förbättrad specificitet över de flesta andra metoder för färgning svampar, såsom calcofluor vit (som fläckar Chitin, en cell vägg komponent som kan variera mellan celltyper), GMS, eller kommersiellt tillgängliga svampdödande antikroppar. Dessutom tillåter fisk färgning av flera organismer som använder differentially märkta fisk sonder till artspecifika rRNAs.
En varning för denna teknik är att vissa C. albicans jästcell typer verkar mycket lika av fisk (till exempel, den OGENOMSKINLIG och Gut celltyper). För att skilja mellan dessa celltyper, skulle det vara bra att utveckla hybridisering sonder till celltyp-specifik svamp mRNAs. Ändå, i sin nuvarande form, har fisk tekniken redan avslöjat överraskande avvikelser mellan in vivo och in vitro beteenden av C. albicans mutanter utvärderas under båda villkoren12, indikerar komplexa interaktioner i naturliga kommensaler miljö som inte är tillräckligt efterhärmade av befintliga in vitro-analyser. Ytterligare studier av olika C. albicans fläckar i ytterligare vild typ och Mutant värdar kommer sannolikt att ge ytterligare insikter i svamp-värd interaktioner. I synnerhet kommer det att vara lärorikt att profilera C. albicans i modeller av inflammatorisk tarmsjukdom, som är förknippad med höga titrar av c. albicans hos människor21, och andra modeller av c. albicans överväxt och sjukdom. FISK tekniken kan också kombineras med immunohistokemi för att fläcka specifika värdceller. Sammantaget ger den metod som presenteras här ett rimligt snabbt och tillförlitligt sätt att bestämma C. albicans lokalisering och morfologi inom DÄGGDJURS-GI-tarmkanalen.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka Carolina Tropini, Katharine ng, Justin Sonnenburg och KC Huang för vägledning i utvecklingen av fisk tekniken. Teresa o ‘ Meara gav hjälpsamma kommentarer om manuskriptet, och Miriam Levy hjälpte till med fotografering. Detta arbete stöddes av NIH Grants R01AI108992, R01DK113788, och en Burroughs Welcome Award i patogenesen för infektionssjukdomar.
1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
LB | can be substituted from any vendor | ||
Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
YEPD | can be substituted from any vendor |