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Immunology and Infection

Murine गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में Candida albicans के दृश्य Situ संकरीकरण में फ्लोरोसेंट का उपयोग

Published: November 5, 2019 doi: 10.3791/60283
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, 2Department of Medicine, Division of Infectious Disease, University of California, San Francisco

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य कैंडा albicans सेल आकार और स्तनधारी जठरांत्र संबंधी मार्ग में स्थानीयकरण कल्पना है.

Abstract

Candida albicans मनुष्य और कई अन्य स्तनधारियों में आंत microbiota का एक कवक घटक है. हालांकि सी albicans सबसे उपनिवेश मेजबान में लक्षण का कारण नहीं है, commensal जलाशय संक्रामक रोग के लिए एक भंडार के रूप में सेवा करता है, और पेट में उच्च कवक titers की उपस्थिति सूजन आंत्र रोग के साथ जुड़ा हुआ है. यहाँ, हम स्थिर जठरांत्र उपनिवेशन के एक माउस मॉडल में सी albicans सेल आकृति विज्ञान और स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए एक विधि का वर्णन. उपनिवेशन जानवरों है कि मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया गया है में सी albicans की एक खुराक का उपयोग कर स्थापित किया गया है. आंत के ऊतकों के खंड ों को इस तरह से तय किया जाता है जो चमकदार सामग्री (माइक्रोजीवा और बलगम) के साथ-साथ मेजबान श्लेष्म की वास्तुकला को बरकरार रखता है। अंत में, सिटू संकरीकरण में फ्लोरोसेंट सी albicans और hyphae के लिए दाग के लिए कवक rRNA के खिलाफ जांच का उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह सी albicans सेल आकारिकी और जठरांत्र उपनिवेशन के दौरान मेजबान संरचनाओं के साथ अपने स्थानिक सहयोग के एक साथ अवलोकन के लिए अनुमति देता है.

Introduction

Candida albicans एक कवक commensal के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक अवसरवादी मानव रोगज़नक़ है. इस खमीर एक परिभाषित पर्यावरण आला का अभाव है और इसके बजाय जठरांत्र (जीआई) पथ, त्वचा, और मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों1के genitourinary पथ के भीतर प्रचार. जबकि सी albicans पर प्रारंभिक अनुसंधान मुख्य रूप से अपनी उग्र क्षमता पर ध्यान केंद्रित, कई हाल की रिपोर्टों का सुझाव है कि आम आदमी के भीतर जीवों का प्रचार सामान्य स्वास्थ्य में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, की प्रतिरक्षा विकास सहित मेजबान2,3,4. स्तनधारी आंत के भीतर सी albicans commensalism की जांच की सुविधा के लिए, हम स्थिर जीआई उपनिवेशन के एक माउस मॉडल और situ संकरीकरण में एक फ्लोरोसेंट (फिश) आधारित विधि कवक खमीर कोशिकाओं कल्पना करने के लिए विकसित की है और भीतर hyphae आंत्र लुमेन.

कुछ अपवादों के साथ5, प्रयोगशाला नस्ल चूहों आम तौर पर पाचन तंत्र के कवक उपनिवेशन के लिए प्रतिरोध प्रदर्शन. उपनिवेशन प्रतिरोध को विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों द्वारा मध्यस्थता माना जाता है; हालांकि, यह एंटीबायोटिक दवाओं के साथ जानवरों के उपचार से दूर किया जा सकताहै 6,7 या एक रासायनिक परिभाषित आहार है कि संभवतः जीवाणु प्रजातियों संरचना8,9बदल के उपयोग इसी प्रकार, मनुष्यों में, व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग सी एल्बिकन्स अतिवृद्धि और प्रसार10के साथ जुड़ा हुआ है। हमारे murine उपनिवेशन मॉडल व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करता है सी albicans उपनिवेशन प्रतिरक्षा, पारंपरिक रूप से पाला चूहों की स्थापना के लिए. पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन को सी एल्बिकन्स की 108 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) के साथ गाव से पहले एक सप्ताह के लिए जानवरों के पीने के पानी में प्रदान किया जाता है। जब तक एंटीबायोटिक-संक्रमित पानी जारी रखा जाता है, सी एल्बिकन्स जीआई पथ के माध्यम से प्रचार करेगा, 106के मल titers तक पहुंच जाएगा $ 108 CFUs / कवक उपनिवेशन के उच्च स्तर के बावजूद, जानवरों को स्वस्थ रहते हैं और uninfected नियंत्रण के रूप में एक ही दर पर वजन हासिल. इस मॉडल का सफलतापूर्वक उपयोग कई सी एल्बिकन्स कॉमेन्सलिज्मकारकों 11,12के लिए स्क्रीन और विशेषता के लिए किया गया है .

कवक राज्य के अन्य सदस्यों की तरह, सी albicans विशाल रूपात्मक प्लास्टिक13में सक्षम है. इन विट्रो स्थितियों में, यह कम से कम छह unicellular खमीर सेल प्रकार के बीच संक्रमण के लिए दिखाया गया है, साथ ही साथ multicellular hyphae और pseudohyphae. खमीर-टू-हाइफा संक्रमण इसकी सबसे अच्छी विशेषता उग्रता विशेषताओं में से एक है, और अधिकांश स्तनधारी रोग मॉडल में हाइफे और छद्म हाइफे प्रबल है, साथ ही संक्रमित मानव ऊतकों में भी। Murine पाचन तंत्र के भीतर सी albicans स्थानीयकरण और सेल आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए, हम निश्चित हिस्टोलॉजिकल वर्गों में खमीर और हाइफे धुंधला करने के लिए एक मछली तकनीक विकसित की है। जांच में फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स शामिल होते हैं जो कवक 23एस राइबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) को हाइब्रिड करते हैं, जो फंगल कोशिकाद्रव्य भर में वितरित किया जाता है। क्योंकि मेजबान ऊतकों को एक तरीके से तय किया जाता है जो आंत के तीन आयामी वास्तुकला को बरकरार रखता है, जिसमें मेजबान श्लेष्म, पाचन सामग्री, आंत लुमेन के भीतर बैक्टीरियल माइक्रोबायोटा, और बलगम शामिल हैं, यह तकनीक कवक के स्थानीयकरण की अनुमति देती है इन स्थलों के संबंध में कोशिकाओं जब दाग. FISH तकनीक इस तरह के आवधिक एसिड Schiff (पास) या गोमोरी के Methenamine-सिल्वर (जीएमएस), साथ ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीफंगल एंटीबॉडी के रूप में, के रूप में इस तरह के आवधिक एसिड Schiff (पास) के रूप में पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल दाग के लिए अनुकूल तुलना करता है, क्योंकि इन अभिकर्मकों के लिए विशिष्ट नहीं हैं C. एल्बिकन्स। इसके अलावा, मानक fixatives बलगम परत को हटाने और आंत लुमेन14,15की अन्य सामग्री को बाधित .

इस लेख में, हम उच्च ग्रेड सी albicans चूहा जीआई पथ के उपनिवेशकी स्थापना के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करते हैं, euthanized जानवरों से पाचन तंत्र के विच्छेदन के लिए, ऊतक निर्धारण के लिए एक तरीके से है कि luminal को बरकरार रखता है वास्तुकला, और FISH का उपयोग कर मेजबान ऊतकों के भीतर सी albicans का पता लगाने के लिए. सी albicans के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों के अलावा, gavage तकनीक अन्य सूक्ष्मजीवों देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। निर्धारण तकनीक किसी भी अध्ययन में पेट की सामग्री के संरक्षण वांछित है के लिए उपयोगी होगा. FISH प्रक्रिया एक दिन के भीतर पूरा किया जा सकता है और कई कवक प्रजातियों कई, अंतर लेबल जांच का उपयोग करके स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

नीचे वर्णित कदमों को यूसीएसएफ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. सी albicans मौखिक Gavage का उपयोग कर के साथ चूहे की जठरांत्र उपनिवेशन

  1. स्थानीय IACUC द्वारा अनुमोदित के रूप में 18 "21 जी पुरुष या महिला चूहों (8 "10 सप्ताह पुराने) के लिए आवास प्रदान करें. पहले दिन से शुरू होने वाले ऑटोक्लेव्ड भोजन और पानी का उपयोग करें।
    नोट: बाँझ पिंजरों, बिस्तर, भोजन, और पानी का उपयोग एंटीबायोटिक प्रतिरोधी पर्यावरण बैक्टीरिया है कि संभवतः आंत से सी albicans विस्थापित कर सकते हैं के साथ संदूषण का खतरा कम कर देता है. इसके अलावा, प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर, पशुओं के व्यक्तिगत आवास पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि चूहों कोप्रोफैगिक हैं और आंत की सामग्री को कोहाउस जानवरों के बीच साझा किया जाएगा।
  2. अगले दिन, ऑटोक्लेव्ड पीने के पानी को ऑटोक्लेव्ड पानी से बदलें जिसमें 5% ग्लूकोज, 1,500 यू/एमएल पेनिसिलिन जी, और 2 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन शामिल हैं।
  3. सुविधा के लिए, 200x एंटीबायोटिक स्टॉक समाधान तैयार करें (तालिका 1) अग्रिम में, फ़िल्टर बाँझ, और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
  4. एक सप्ताह के लिए एंटीबायोटिक दवाओं पर जानवरों को बनाए रखें।
    1. एंटीबायोटिक दवाओं शुरू होने के बाद दिन 3 और 6 पर, एंटीबायोटिक प्रतिरोधी एरोबिक बैक्टीरिया के साथ संदूषण के लिए प्रत्येक जानवर के मल का आकलन करें। एक हाथ से एक जानवर पकड़े, गुदा के पास एक unapped microfuge ट्यूब जगह है और कम से कम एक मल गोली इकट्ठा.
    2. बाँझ पानी और प्लेट 100 $L के 1 एमएल में प्रत्येक मल गोली को पुन: संचित करें Luria शोरबा (एलबी), खमीर निकालने पेपटोन डेक्सट्रोज (YEPD), या मस्तिष्क दिल जलसेक (BHI) प्लस रक्त आगर प्लेटों पर। प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मानक इनक्यूबेटर (अनरोबिक नहीं) में रात भर इनक्यूबेट करें और जीवाणु विकास का आकलन करें।
      नोट: प्लेट्स को न्यूनतम वृद्धि (0 डिग्री 20 कालोनियों) का प्रदर्शन करना चाहिए। यदि बैक्टीरिया की 20 कालोनियों पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ इलाज जानवरों से बरामद कर रहे हैं, तो यह संभावना नहीं है कि सी albicans के साथ उच्च स्तरीय उपनिवेशन स्थापित किया जाएगा और प्रयोग निरस्त किया जाना चाहिए.
  5. गैवेज से तीन दिन पहले, जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक से YEPD + 2% agar प्लेटें और 2 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट से लकीर सी.
  6. गाव से एक दिन पहले, प्रत्येक सी albicans तनाव के एक कॉलोनी टीका तरल YEPD के 5 एमएल में परीक्षण किया जा करने के लिए. झटकों के साथ रात भर 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  7. गाव की सुबह, YEPD के 100 एमएल में 0.1 की 600 एनएम (ओडी600) पर एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए सी albicans की संतृप्त संस्कृति को पतला 30 डिग्री सेल्सियस के लिए prewarmed. ओ.डी. 600 तक 1 (मध्य-लॉग वृद्धि) तक 4 ज और 5 ज के बीच 30 डिग्री सेल्सियस पर200 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर में हिलाएं।
  8. प्रत्येक 100 एमएल संस्कृति को कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर दो 50 एमएल शंकु ट्यूब और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें।
    नोट: सी albicans RT में अपेक्षाकृत धीरे धीरे प्रचारित करता है. यदि एक और प्रजाति के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन, inocula बर्फ पर रखा जा करने के लिए जारी विकास को रोकने की आवश्यकता हो सकती है.
  9. supernatant छोड़ ें, संस्कृति के 50 एमएल प्रति बाँझ saline के 20 एमएल में गोलीमार कोशिकाओं को फिर से निलंबित, और एकल शंकु ट्यूबों में डुप्लिकेट resuspended छर्रों पूल. 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  10. सुपरनेंट को त्याग दें और 20 एमएल बाँझ नमकीन में फिर से फेंटें। भंवर संक्षेप में और ओडी 600 माप के लिए20 $L निकालें। बाँझ सामान्य लवण में 1:50 पतला. 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर शेष पुन: निलंबित कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  11. महादलित को त्याग दें। 1 x 108 CFU के एक inoculum आकार के लिए, लगभग करने के लिए गोलीमार कोशिकाओं resuspend 5 x 108 CFUs /mL बाँझ सामान्य नमकीन OD600 माप से निर्धारित के आधार पर.
    नोट: आमतौर पर, 1 का एक OD600 $1 x 107 खमीर कोशिकाओं/ यह मान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा भिन्न हो सकते हैं और सत्यापित किया जाना चाहिए। यदि एकाग्रता में परिवर्तन एक अलग सूक्ष्मजीव के साथ संक्रमण के लिए वांछित है, पशु के लिए परेशानी को कम करने के लिए $ 10 $L/g माउस की एक inoculum मात्रा के लिए योजना.
  12. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ एक 1:1,000 कमजोर पड़ने की गिनती से inoculum की एकाग्रता सत्यापित करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके निर्धारित सांद्रता के आधार पर gavaged किया जा करने के लिए कोशिकाओं की मात्रा समायोजित करें।
  13. एक पशु खिला सुई का उपयोग करना (चित्र 1ए), दिए गए inoculum की गणना मात्रा के साथ प्रत्येक जानवर gavage. gavage प्रक्रिया के लिए चरण 1.13.1 $1.13.8 देखें।
    नोट:     gavage के लिए प्रशिक्षण एक अनुभवी व्यवसायी से प्राप्त किया जाना चाहिए, और प्रक्रिया अग्रिम में महारत हासिल किया जाना चाहिए. एक जानवर के लिए एक सफल प्रक्रिया आम तौर पर 1 मिनट से अधिक नहीं लेता है।
    1. एक 1 एमएल सिरिंज के लिए एक autoclaved पशु खिला सुई संलग्न और एक gavage मात्रा के साथ सिरिंज भरने, किसी भी हवा बुलबुले को हटाने के लिए एक गलत खुराक से बचने के. एक बाँझ सतह पर रखें.
    2. गाव के लिए जानवर को सुरक्षित करें। प्रमुख हाथ के साथ पूंछ के आधार पर जानवर पकड़ो और सिर्फ कान के पीछे ढीली त्वचा के लिए जानवर की पीठ ऊपर nondominant हाथ स्लाइड।
    3. गैर प्रमुख हाथ की तर्जनी और अंगूठे का उपयोग करना, ढीली त्वचा को कसकर इकट्ठा करना; यह "स्क्रफ" है। हाथ की हथेली के खिलाफ जानवर को स्थिर करने के लिए पूंछ के चारों ओर एक ही (गैर प्रमुख) हाथ की अपनी scruff और पाश छोटी उंगली से जानवर उठाओ। धीरे से जानवर के सिर का विस्तार इतना है कि उसके सिर और शरीर (और इसलिए गर्दन और घेघा) एक सीधी रेखा में हैं.
      नोट: एक gavage का प्रयास करते हुए जानवर के शरीर तुला या मुड़ है इस तरह के esophageal वेध और जानवर की मौत के रूप में जटिलताओं में परिणाम हो सकता है.
    4. प्रमुख हाथ से सिरिंज उठाओ और जानवर के लंबवत पकड़, घुमावदार सुई नीचे की ओर इशारा करते हुए के साथ (चित्र 1बी)। सुई की गेंद का उपयोग करना, धीरे मुंह के एक अंदर कोने हुक, धीरे गले के पीछे करने के लिए मुंह के पक्ष के साथ सुई अग्रिम, और अंत में केंद्र के लिए सुई ले जाएँ.
      नोट: एक पार्श्व पथ के साथ सुई का परिचय जानवर के दांत और जीभ से प्रतिरोध से बचने में मदद करता है।
    5. एक बार सुई की गेंद गले के पीछे हो जाने पर सुई को इस प्रकार झुकाएं कि वह जानवर की पिंज़ रेखा के समांतर हो (चित्र 1ग)।
      नोट: इस बिंदु पर, जानवर एक गला पलटा प्रदर्शन करेंगे. यह एक अच्छा संकेत है जो इंगित करता है कि सुई सही ढंग से तैनात है, और गैगिंग गति एसोफैगस नीचे सुई को मार्गदर्शन करने में मदद करती है। यदि कोई गैग पलटा नहीं है, सुई घेघा के बजाय श्वासनली में हो सकती है। धीरे से सुई वापस लेने और कदम 1.13.1 करने के लिए वापस आगे बढ़ना.
    6. जब तक केवल कुछ मिलीमीटर दिखाई नहीं देता तब तक पशु को इनोकुलम को निगलने दें (चित्र 1छ)। सुई को सुचारू रूप से आगे बढ़ाें।
      नोट: यदि सुई आगे नहीं बढ़ती है, तो बल का उपयोग करने से बचें, जो घेघा को नुकसान पहुंचा सकता है। कभी कभी पिछले आधा सेंटीमीटर आगे बढ़ाने के जानवर से एक अतिरिक्त बड़े मजाक की आवश्यकता होगी. यदि सुई अटक जा रही है, धीरे धीरे इसे वापस लेने और चरण 1.13.4 से फिर से प्रयास करें.
    7. परीक्षण है कि सुई की गेंद धीरे प्लंजर आगे बढ़ने से सही स्थान (पेट) में है. यदि कोई प्रतिरोध नहीं है, तो इनोकुलम को वितरित करना जारी रखें। एक बार inoculum प्रशासित किया गया है, धीरे धीरे सुई वापस ले लो.
    8. अपने पिंजरे में जानवर को बदलें और परिश्रम सांस लेने या संकट के संकेत के लिए 5 $10 मिनट के लिए जानवर की निगरानी करने के लिए जारी है। सत्यापित करें कि पशु gavage के बाद जल्द ही सामान्य गतिविधि फिर से शुरू.
    9. यदि एक ही inoculum अगले जानवर के साथ इस्तेमाल किया जाएगा, एक शराब पोंछे के साथ सुई साफ. चरण 1.13.1 पर वापस आगे बढ़ें. यदि किसी भिन्न inoculum का उपयोग किया जाएगा, तो एक नई सुई का उपयोग करें और 1.13.1 चरण पर वापस जाएँ.
      नोट: गाव के बाद दिन में जानवरों का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। संकट के लक्षण प्रदर्शित करने वाले पशु (जैसे, hunched मुद्रा, परिश्रमी श्वास) मानवीय रूप से इच्छामृत्यु होनी चाहिए, क्योंकि उन्हें संभावित रूप से एसोफेजल टूटना, फेफड़ों को नुकसान, या किसी अन्य आंतरिक चोट का सामना करना पड़ा है जिससे वसूली की संभावना नहीं है।
  14. पशुओं की गैवेज के बाद, खुराक सत्यापन के लिए inocula की प्लेट कमजोर पड़ने.
    1. 1:105तक 10 गुना धारावाहिक कमजोर करना तैयार करें। प्लेट 1:105 के एक gavage मात्रा Sabouraud डेक्सट्रोज agar की एक 100 मिमी प्लेट पर.
    2. प्लेट को 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। इनोकुलम खुराक की पुष्टि करने के लिए सीएफयू की गणना करें।

2. ऊतक विज्ञान के लिए गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ऊतकों की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल का यह भाग जोहानसन और हैन्सन16से अनुकूलित है .

  1. मेथाकार्न घोल (60% मेथनॉल, 30% क्लोरोफॉर्म, 10% हिमनदीय ऐसीटिक एसिड) के 500 एमएल को हर 2 जानवरों के लिए एक बड़े पेंच कैप प्लास्टिक जार में तैयार करें।
    चेतावनी: मेथेनोल और क्लोरोफॉर्म हानिकारक हैं यदि साँस लिया जाता है और रासायनिक हुड में हेरफेर किया जाना चाहिए। ग्लेशियल एसिटिक एसिड संक्षारक हो सकता है और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए। मेथेनोल, क्लोरोफॉर्म, और हिमनदीय ऐसीटिक एसिड खतरनाक कचरे के रूप में खारिज कर दिया जाना चाहिए।
  2. प्रयोगात्मक समापन बिंदु पर, स्थानीय IACUC द्वारा अनुमोदित एक प्रोटोकॉल के अनुसार मानवीय रूप से जानवरों की इच्छा।
    नोट: एंटीबायोटिक उपचारित पशुओं में, C. albicans उपनिवेशन आम तौर पर से लेकर $106 CFUs/g दिन पर 5 अप करने के लिए $5 x 107 CFUs/
  3. 10% ब्लीच के साथ विच्छेदन उपकरण बाँझ और 70% इथेनॉल के साथ कुल्ला.
  4. एक विच्छेदन सतह के लिए प्रत्येक जानवर को सुरक्षित, अधर पक्ष का सामना करना पड़ के साथ. अंगों को विच्छेदन सतह पर सुरक्षित करने के लिए 30 जी सुइयों का प्रयोग करें (चित्र 2क) फर साफ और उपकरणों से चिपके कम करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पशु स्प्रे।
  5. कुंद समाप्त forceps का उपयोग करना, nondominant हाथ के साथ पेट की त्वचा के एक वर्ग चुटकी. प्रमुख हाथ के साथ कैंची का उपयोग करना, श्रोणि के आधार के पास त्वचा और अंतर्निहित फासिया को छेदना। पेरिटोनल गुहा के प्रत्येक पक्ष के साथ और रिब पिंजरे तक एक यू आकार में चीरा बढ़ाएं। त्वचा को रास्ते से बाहर उठाएं।
  6. एक पेंसिल का उपयोग करते हुए, जीआई क्षेत्रों के लिए ऊतक विज्ञान कैसेट का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्रत्येक जानवर के लिए, अलग कैसेट को "मुख" के रूप में लेबल करें, "आसन्न छोटी आंतों," "मध्य छोटी आंतों," "छोटी आंतों," "सीकम," और "बड़ी आंतों"। प्रत्येक कैसेट के तल पर एक फोम पैड रखें (चित्र 2क)
    नोट: चित्र ााााःखरूपरेखा सुझाई गई अनुभागों को कैसेटमें रखीं.
  7. कुंद एंडेड संदंश का उपयोग करना, धीरे से पर्टोनल गुहा से सीकम निकालें। सीकम और छोटी और बड़ी आंतों के बीच कनेक्शन तोड़ने के लिए कैंची का उपयोग करें।
    नोट: सीकल ऊतक बहुत नाजुक और टूटना करने के लिए आसान है। हेरफेर करते समय ध्यान रखें।
  8. पूरे सीकम को हिस्टोलॉजी कैसेट में रखें ताकि यह अनियंत्रित हो जाए और सपाट हो जाए (चित्र 2ग) । शीर्ष पर एक दूसरे फोम पैड प्लेस और कैसेट बंद करो. मेथाकारन युक्त एक पेंच टोपी जार में कैसेट प्लेस.
  9. बड़ी आंतों के एक वर्ग को उत्पादित करें जिसमें 1 "2 मल छर्रों होते हैं, जिसकी लंबाई कैसेट की तुलना में कम होती है।
  10. कैसेट में ऊतक अनुभाग रखें, ऊतक फ्लैट और untwisted रखते हुए. एक दूसरे फोम पैड के साथ ओवरले और कैसेट बंद. कैसेट को मेथाकरन में रखें।
  11. छोटी आंतों के प्रत्येक खंड के लिए नमूना लिया जा करने के लिए, एक 1 "2 सेमी खंड है कि कुछ पाचन सामग्री शामिल excise.
  12. एक ऊतक कैसेट में खंड प्लेस, ऊतक फ्लैट और untwisted रखते हुए. एक दूसरे फोम पैड के साथ ओवरले और कैसेट बंद. कैसेट को मेथाकरन में रखें।
  13. पेट के लिए, घेघा और छोटी आंतों के लिए कनेक्शन तोड़. एक कैसेट में रखें, ऊतक फ्लैट और untwisted रखते हुए. एक दूसरे फोम पैड के साथ ओवरले और कैसेट बंद. कैसेट को मेथाकरन में रखें।
  14. कम से कम 3 एच और कम से कम 2 सप्ताह के लिए आरटी में methacarn समाधान में कैसेट छोड़ दें.
    नोट: ऐसे कई बिंदु हैं जिनके दौरान निश्चित जीआई खंडों को वाणिज्यिक ऊतक विज्ञान सेवा में स्थानांतरित किया जा सकता है। इन ऊतकों luminal सामग्री के विघटन के बिना अनुभाग के लिए मुश्किल हो सकता है, और इष्टतम परिणाम एक अनुभवी तकनीशियन द्वारा प्राप्त किया जाएगा. यदि वाणिज्यिक सेवा के लिए पैराफिन में ऊतकों embedding से पहले washes प्रदर्शन करने के लिए तैयार है, कैसेट कदम 2.16 के लिए निर्देश के साथ इस स्तर पर भेजा जा सकता है.
  15. एक preheated 70 डिग्री सेल्सियस संकरीकरण ओवन में एक बड़े बीकर में सभी ऊतक कैसेट को कवर करने के लिए पर्याप्त पैराफिन मोम पिघलने शुरू करते हैं।
  16. निर्धारण के बाद, फोम पैड को हटाने और प्रत्येक बरकरार ऊतक अनुभाग वापस अपने कैसेट में वापसी. मिलाते हुए के साथ आरटी में निम्नलिखित समाधान के साथ ऊतकों को धोएं: 100% मेथनॉल में 35 मिनट के लिए दो बार, 100% इथेनॉल में 25 मिनट के लिए दो बार, दो बार 20 मिनट के लिए जाइलीन में।
    चेतावनी: Xylene ज्वलनशील, विषाक्त है, और अगर साँस नुकसान हो सकता है. उचित संरक्षण के साथ एक रासायनिक हुड में प्रयोग करें. खतरनाक अपशिष्ट प्रक्रियाओं के माध्यम से xylene के निपटान.
  17. पैट कैसेट एक कागज तौलिया पर सूखी और एक संकरीकरण ओवन में 70 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए premelted पैराफिन मोम में जगह है. सुनिश्चित करें कि कैसेट पैराफिन से भर रहे हैं और कोई बुलबुले रहते हैं.
    नोट: यह चरण मोम जीआई खंड घुसपैठ करने के लिए और ऊतक और सामग्री को स्थिर करने के लिए अनुमति देता है।
  18. मोम से कैसेट निकालें, अतिरिक्त मोम नाली की अनुमति है, और आरटी पर दुकान जब तक वे मोम ब्लॉकों में एम्बेडेड हैं. खतरनाक अपशिष्ट के रूप में xylenes का पता लगाने मात्रा युक्त मोम छोड़ें.
    नोट: नोबल लैब ऊतकों को एम्बेड करने और अनुभागीकरण के लिए एक वाणिज्यिक ऊतक विज्ञान सेवा का उपयोग करता है। C. albicans खमीर और हाइफ़े के मानक दृश्य के लिए, 4 डिग्री मीटर वर्गों का उपयोग किया जाता है। हाइफ़ल खंडों की कनेक्टिविटी का मूल्यांकन करने के लिए, जो आम तौर पर कई विमानों के माध्यम से विस्तार करते हैं, 8 डिग्री मीटर वर्गों का उपयोग किया जा सकता है। नमूने में प्रवेश करने के लिए FISH जांच की क्षमता पर निर्भर करता है, यह भी मोटा वर्गों का उपयोग करने के लिए संभव हो सकता है.

3. नए डिजाइन की जांच का सत्यापन

नोट: सी albicans जांच मान्य करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल Swidsinski एट अल से अनुकूलित किया गया था17.

  1. स्ट्रीक सी albicans SC5314 और बारीकी से संबंधित तुलनक प्रजातियों (उदा., Candida dubliniensis, Candida उष्णकटिबंधीय) YEPD + 2% agar प्लेटें करने के लिए। 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 डिग्री 2 दिनों के लिए इनक्यूबेट।
  2. एक ही कॉलोनी के साथ तरल YEPD माध्यम के 5 एमएल टीका।
  3. पिपेट 1 एमएल निलंबित कोशिकाओं को एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और 5 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र को छोड़ें।
  4. फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) के 100 डिग्री एल में गोली को पुन: निलंबित करें।
  5. पिपेट 5 [10 डिग्री सेल्सियस की पुन: निलंबित कोशिकाओं और एक गिलास स्लाइड पर हाजिर. एक बड़े चक्र में बिखरा हुआ है और सूखने की अनुमति दें।
    नोट: यदि कक्ष अनुलग्न नहीं हैं, तो पॉली-एल-लीज्या लेपित स्लाइड्स का उपयोग करें.
  6. एक पीएपी पेन के साथ सेल स्पॉट सर्कल और पीबीएस में 2.5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 50 डिग्री एल के साथ कवर। 10 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
    चेतावनी: पीएफए ज्वलनशील है और स्वास्थ्य समस्याओं का कारण बन सकता है अगर साँस या त्वचा के साथ संपर्क में. पीएफए से दूषित वस्तुओं को खतरनाक कचरे के रूप में छोड़ दिया जाना चाहिए।
  7. पीबीएस के साथ 3x धो लें। कागज तौलिया पर बंद तरल टैप करें और पीबीएस के 100 डिग्री एल के साथ कवर। दो बार दोहराएँ. अंतिम धोने छोड़ें.
  8. बहुदिन के भंडारण के लिए स्लाइड्स तैयार करें. एक ही दिन FISH प्रदर्शन करते हैं, तो इस खंड में चरणों के बिना 3.9 चरण के लिए आगे बढ़ें।
    नोट:     यह तुरंत संकरीकरण प्रदर्शन करने के लिए बेहतर है, लेकिन अगर समय पर कम चरण का पालन करें 3.8 भंडारण से पहले. स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
    1. 60% इथेनॉल के साथ जगह कवर. 3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, समाधान को छोड़ दें।
    2. 80% इथेनॉल के साथ जगह कवर. 3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, समाधान को छोड़ दें।
    3. 100% इथेनॉल के साथ जगह कवर. 3 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें, समाधान को छोड़ दें। चरण 3.9 पर आगे बढ़ें.
  9. 1 एच के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एक संकरीकरण ओवन में खुला स्लाइड प्लेस। यदि चरण 3.8 का अनुसरण किया गया था, तो स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें. यदि नहीं, तो हाइब्रिडेशन प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए चरण 4.2 पर आगे बढ़ें.

4. जीआई ट्रैक्ट ऊतकों में मछली की कमी

  1. Dewax पैराफिन-एम्बेडेड हिस्टोलॉजिकल वर्गों.
    1. एक संकरीकरण ओवन में, एक कोपलिन जार का प्रीवार्म जो xylene से 60 डिग्री सेल्सियस तक भरा होता है।
    2. स्लाइड्स को xylene से भरे जार में सम्मिलित करें. 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें। xylene धोने को छोड़ दें। जार में स्लाइड रखें और एक अपशिष्ट कंटेनर में xylene बंद डालना.
    3. जार में ताजा आरटी xylene डालो और 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट. दूसरी xylene धोने छोड़ दें.
    4. 5 मिनट के लिए आरटी में 100% इथेनॉल और इनक्यूबेट के साथ जार भरें। जार और हवा सूखी से स्लाइड निकालें।
    5. हाइब्रिडेशन ओवन को अनुभाग 4.2 में चरणों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. FISH जांच के साथ दाग सी albicans.
    1. ताजा संकरीकरण समाधान के 1 एमएल तैयार (20 एमएम Tris-HCl, पीएच 7.4, 0.9 एम NaCl, 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस], RNase मुक्त पानी में 1% formamide). नमूना परिकलनों के लिए तालिका 1 देखें.
    2. सी albicans जांच के 1 $L के साथ संकरण समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस एक साथ मिलाएं (5' Cy3- ACAGAAGCCGTGCC 3'; RNase-मुक्त पानी में 50 g/mL) 0.5 ग्राम प्रति स्लाइड की अंतिम जांच राशि के लिए।
      नोट: कई प्रयोगशाला नस्ल चूहों उनके microbiota के बीच किसी भी कवक शामिल नहीं है. इस मामले में, यह एक पैन कवक जांच स्थानापन्न करने के लिए संभव है (5' Cy3-CTCTCTCCCATTCATC 3') कि सबसे कवक प्रजातियों के 23S rRNA पहचानता है, न सिर्फ सी albicans. लेखकों के अनुभव में, पैनफंगल जांच सी एल्बिकन्स-विशिष्टजांच की तुलना में उज्जवल धुंधला पैदावार देती है।
    3. प्रकाश और prewarm से 50 डिग्री सेल्सियस के लिए समाधान को सुरक्षित रखें।
    4. एक पीएपी कलम का उपयोग करना, अनुभाग 4.1 से ऊतक अनुभाग के चारों ओर एक चक्र आकर्षित.
    5. पिपेट 50 डिग्री जांच युक्त संकरीकरण समाधान को निश्चित ऊतक पर और धीरे से एक पिपेट टिप के साथ ऊतक अनुभाग पर फैल गया। बुलबुले को रोकने के लिए सुनिश्चित करें कि एक संकरीकरण coverslip के साथ तरल ओवरले।
    6. एक watertight संकरीकरण कक्ष में सील स्लाइड और एक संकर ओवन में अंधेरे में 50 डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए वर्गों इनक्यूबेट।
    7. इस बीच, 50 एमएल फिश वॉशिंग सोल्यूशन (20 एमएम ट्रास-एचसीएल, पीएच 7.4, 0.9 एम एनसीएल आरएनसे-मुक्त पानी) तैयार करें। नमूना परिकलनों के लिए तालिका 1 देखें.
    8. प्रीवार्म के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के लिए धोने के समाधान ले जाएँ।
    9. 3 ज के बाद, एक Coplin जार करने के लिए धोने समाधान जोड़ें. फिर, सावधानी से संदंश के साथ स्लाइड से कवरस्लिप निकालें और स्लाइड को धोने के समाधान में रखें।
    10. 20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और इनक्यूबेट के साथ जार को कवर करें।
    11. इस ऊष्मायन के दौरान, म्यूसिन-न्यूक्लिय धुंधला समाधान तैयार करें (20 एनजी/एमएल 4],6-diamidino-2-फेनिलिनोडोल [डीएपीआई], 1.6 ग्राम/एमएल फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइन [एफआईटीसी]-पीबीएस में। नमूना परिकलनों के लिए तालिका 1 देखें. पेट और बड़ी आंतों के लिए, FITC-Ulex यूरोपियस एग्लूटिनिन 1 (UEA-1) का उपयोग करें। छोटी आंतों और सीकम के लिए, FITC-UEA-1 और FITC-Wheat रोगाणु एग्लूटिनिन (डब्ल्यूजीए) के संयोजन का उपयोग करें।
      नोट: विभिन्न प्रजातियों से Lectins ऐसे mucin के रूप में ग्लाइकोप्रोटीन के विभिन्न चीनी संशोधनों को पहचान. यहां अनुशंसित लैक्टिन संयोजन विभिन्न जीआई डिब्बों में बलगम के इष्टतम धुंधला के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किए गए थे।
    12. FISH धोने समाधान डालने और आरटी पीबीएस के साथ जार refilling द्वारा स्लाइड धो लें. पीबीएस तुरंत डालो और पीबीएस के साथ फिर से भरना. कुल 2 washes के लिए पीबीएस बंद डालो.
    13. एक नाजुक कार्य वाइपर ऊतक के साथ पीबीएस दूर विक और एक पीएपी कलम के साथ आंतों के ऊतक अनुभाग चक्र. स्लाइड को अपारदर्शी प्लास्टिक के कंटेनर में रखें और ऊतक अनुभाग में म्यूसिन-न्यूक्लिय धुंधला समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कंटेनर को कवर करें। 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    14. एक Coplin जार में स्लाइड प्लेस और आरटी पर पीबीएस में जल्दी से दो बार धो लो.
    15. एक कागज तौलिया पर अतिरिक्त पीबीएस दूर ठोकर, और फिर दूर एक ऊतक के साथ पीबीएस के अंतिम बूँदें बात.
    16. प्रत्येक अनुभाग पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद रखें और एक गिलास कवरस्लिप के साथ ओवरले, बुलबुले को रोकने। बढ़ते माध्यम को पूरे कवरस्लिप के नीचे फैलाने दें। तत्काल इमेजिंग के लिए, कोनों पर नेल पॉलिश के साथ जगह में कवरस्लिप लंगर। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के आसपास सील करें।
    17. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर स्लाइड छवि।

Representative Results

दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए, इस तकनीक का परिणाम अनुभागीकृत जीआई ऊतकों में मेजबान उपकला, बलगम, और सी एल्बिकन्स में नाभिक का फ्लोरोसेंट लेबलिंग होगा। जंगली प्रकार Candida albicans कोशिकाओं या तो दौर के रूप में दिखाई देना चाहिए, unicellular खमीर कोशिकाओं या अत्यधिक लम्बी, कभी कभी शाखाओं, multicellular hyphae (सेल सेल डिवीजनों हाइफे में स्पष्ट नहीं होगा). सी albicans के उत्परिवर्ती अतिरिक्त छोटे के रूप में प्रकट हो सकता है, थोड़ा लम्बी "ग्रे" खमीर या के रूप में बड़ा, थोड़ा लम्बी "GUT" (गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रेरित संक्रमण) या "ओपेक" खमीर.

चित्र 1 मौखिक गैवेज के लिए प्रयुक्त फीडिंग सुई को दर्शाया गया है, साथ ही गैवेज प्रक्रिया के दौरान सुई की प्रमुख स्थितियों को दर्शाया गया है। चित्र 2 अंग विच्छेदन और माउस के GI खंडों की उपस्थिति के लिए इस्तेमाल किया एक विशिष्ट सेटअप प्रदान करता है.

चित्र 3 विभिन्न C. albicans सेल प्रकार के FISH धुंधला इन विट्रो में और माउस मॉडल के भीतर प्रचार निम्नलिखित प्रदर्शित करता है. चित्र 3क में, विट्रो-प्रोपेक्त हाइफे में स्थिर, परिमेयीकृत की फ्लोरोसेंट और प्रावस्था छवियों को दिखाया गया है। Hypha गठन तरल ली के माध्यम के साथ प्रेरित किया गया था18 2% एन-ऐसीटिलग्लूकोसामाइन के साथ, पीएच 6.8 पर 37 डिग्री सेल्सियस. चित्र 3ठ में विट्रो-प्रोपेक्षित खमीर कोशिकाओं में स्थिर, परिमेयीकृत की फ्लोरोसेंट और प्रावस्था छवियों को दिखाया गया है। चित्र 3ं,घ में क्रमशः स्थिर, परमीबिलीकृत, इन विट्रो-प्रोपेगेट्ड GUT कोशिकाओं और अपारदर्शी कोशिकाओं को दिखाया गया है। GUT और अपारदर्शी सेल प्रकार morphologically अभेद्य हैं सिवाय जब इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग द्वारा कल्पना की. कृपया ध्यान दें कि इन विट्रो-प्रोपेगेट्ड कोशिकाओं के FISH धुंधला suboptimal हो जाएगा अगर कोशिकाओं को अच्छी तरह से permebilized नहीं कर रहे हैं. कमजोर और विसरित दाग का एक उदाहरण चित्र 3गमें दिखाया गया है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सेल निर्धारण और permebilization शर्तों अनुभवजन्य प्रत्येक सेल प्रकार और प्रजातियों की जांच के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. सौभाग्य से, अनुभागित ऊतकों में सी albicans visualizing के लिए सिफारिश की प्रोटोकॉल और अधिक सुसंगत permebilization पैदा करता है.

चित्र 3ई-जी माउस बड़ी आंतों में सी एल्बिकन्स को चित्रित करता है, जो C. एल्बिकन्स-विशिष्ट जांच से दागा जाता है (चित्र 3ई) या पैनफंगल जांच (चित्र 3च, G)। C. albicans इन छवियों में लाल दिखाई देता है, मेजबान सेल नाभिक नीले हैं, और बलगम परत हरे रंग की है. दोनों दौर खमीर और अत्यधिक लम्बी हायफे (सफेद arrowheads) बड़ी आंतों में होते हैं. कृपया ध्यान दें कि धुंधला पैनफंगल जांच के साथ उज्जवल है। चित्र 3जी एक ही डिब्बे में एक ume6 उत्परिवर्ती दर्शाया गया है, panfungal जांच के साथ दाग. Ume6 एक प्रतिलेखन कारक है कि इन विट्रो शर्तों में के तहत hypa गठन के लिए आवश्यक है encodes19 . दिलचस्प है, इन विट्रो स्थितियों में इस उत्परिवर्ती द्वारा प्रदर्शित खमीर बंद phenotype आंत के भीतर recapitulated नहीं है, सुझाव है कि एक अनावश्यक कारक मेजबान12के भीतर सक्रिय किया जाना चाहिए. चित्र 4 में म्यूरीन जीआई पथ के विभिन्न खंडों में जंगली प्रकार सी एल्बिकन्स की उपस्थिति को दर्शाया गया है, जिसमें मेजबान श्लेष्म और आंत लुमेन के अधिक केंद्रीय क्षेत्रों के निकट के क्षेत्र शामिल हैं।

Figure 1
चित्र 1: gavage के दौरान कुंजी खिला सुई पदों. (ए) दूध पिलाने की सुई। (बी) खिला सुई गेंद जीभ के पक्ष में डाला. (ग) घेघा में प्रविष्टि के साथ सीधे स्थिति में सुई खिलाना। (घ)नाक के ऊपर कुछ मिलीमीटर के साथ पेट में डाली गई सुई खिलाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उदाहरण विच्छेदन लेआउट. (ए) विच्छेदन पैड और उपकरण. (B) एक्साइज्ड जीआई पथ। Proximal (एसोफैगस) को दूर करने के लिए (anus) वर्गों: I. पेट. II. समीपस्थ छोटी आंतें. III. मध्य छोटी आंतों. IV. छोटी आंतों को दूर करना. वी सेकम. VI. बड़ी आंत. गुलाबी डैश्ड बॉर्डर बॉक्स ऊतकों को ठीक करने का संकेत देते हैं। ()कैसेट में तैनात ऊतक। रोमन अंकों पैनल बी में के रूप में ही कर रहे हैं कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

Figure 3
चित्र 3: FISH-seded C. albicansके प्रतिनिधि छवियों. (एक) C. albicans हाइफ़ा के प्रतिनिधि छवियों तरल ली के मीडिया18 में 2% N-acetylglucosamine, पीएच 6.8 के साथ हो. (ब) सी एल्बिकन्स गोल खमीर कोशिकाओं की मछली जो YEPD + 2% agar प्लेटों पर उगाई जाती है। (ग) सी एल्बिकन्स GUT कोशिकाओं (ySN1045) की मछली YEPD + 2% agar प्लेटों पर उगाया गया। (छ) येपीडी + 2% आगर प्लेटों पर उगाई जाने वाली अपारदर्शी कोशिकाओं की फिश। (ई)बड़ी आंतों में जंगली प्रकार सी एल्बिकन्स (ySN250), सी एल्बिकंस-विशिष्टजांच के साथ दाग। (च)बड़ी आंतों में जंगली प्रकार सी. (जी) बड़ी आंतों में Ume6 उत्परिवर्ती (ySN1479), panfungal जांच के साथ दाग: लाल सी albicansहै, नीले मेजबान उपकला नाभिक है, और हरी mucin है. ऐरोहेड्स हाइफा का संकेत देते हैं। तीर खमीर का संकेत मिलता है. स्केल बार्स ] 20 डिग्री मी. छविएफ और जी Witchley एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं12. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: विभिन्न आंत डिब्बों में FISH-सना हुआ सी albicans की उपस्थिति. जंगली प्रकार C. albicans माउस जीआई पथ के संकेत खंडों में दिखाया गया है। प्रत्येक डिब्बे के भीतर, छवियों मेजबान mucosa और आंत लुमेन के केंद्रीय क्षेत्र के निकट क्षेत्र को दर्शाती है. पैनफंगल जांच के साथ दाग दारन किया गया था। स्केल बार ] 20 डिग्री मी. छवियाँ Witchley एट अल से अनुकूलित कर रहेहैं. 12. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एंटीबायोटिक स्टॉक (200x)
पेनिसिलिन जी 181 मिलीग्राम/एमएल
स्ट्रेप्टोमाइसिन 400 मिलीग्राम/
मेथाकार्न
भंडार अंतिम एकाग्रता आयतन इकाइयों
मेथनॉल 60% 300 मिलीलीटर
क्लोरोफॉर्म 30% 150 मिलीलीटर
ग्लेशियल ऐसीटिक अम्ल 10% 50 मिलीलीटर
हाइब्रिडीकरण समाधान
भंडार अंतिम एकाग्रता आयतन इकाइयों
1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4 20 एमएम 20 जेडएल
5 एम NaCl 0.9 एम 180 जेडएल
10% एसडीएस 0.10% 10 जेडएल
100% फॉर्मामाइड 1.00% 10 $L (उपयोगों के बीच -20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे alicots में रखा)
RNase मुक्त पानी 780 जेडएल
FISH धोने समाधान
1 एम ट्रिस-एचसीएल, पीएच 7.4 20 एमएम 1 मिलीलीटर
5 एम NaCl 0.9 एम 9 मिलीलीटर
RNase मुक्त पानी 40 मिलीलीटर
मुसिन-न्यूक्लिई अभिरंजन विलयन
डीएपीआई, 10 ग्राम/ 20 एनजी/ 2 जेडएल
लैक्टिन, 40 ग्राम/ 1.6 ग्राम/ 40 जेडएल
पीबीएस, पीएच 7.4 958 जेडएल

तालिका 1: विशिष्ट मात्रा और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए समाधानों की सांद्रता।

Discussion

यहाँ वर्णित विधि किसी भी सेक्स या तनाव के जीआई ट्रैक्ट में सी एल्बिकन्स खमीर और हाइफे के दृश्य के लिए अनुमति देता है। FISH जांच 23S rRNA, जो कवक कोशिका द्रव्य भर में वितरित किया जाता है संकर. हमारी विधि आंत बैक्टीरिया20visualizing के लिए एक पहले की सूचना प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया था . क्योंकि C. albicans मेजबान के भीतर अपनी आकृति विज्ञान में परिवर्तन, विधि कवक सेल आकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्थानीयकरण की निगरानी के लिए उपयोगी है. उदाहरण के लिए, हमने इस विधि का उपयोग इस परिकल्पना को साबित करने के लिए किया है कि यीस्ट पाचन तंत्र में हावी है, और विवो में और कुछ "फिलामेंटेशन-दोषपूर्ण" म्यूटेंट12के विट्रो फीनोटाइप के बीच विसंगतियों को उजागर करने के लिए।

कई माउस मॉडल सी albicans commensal उपनिवेशन के लिए मौजूद हैं. प्रयोगशाला चूहों और मनुष्यों के microbiota अलग हैं और, चूहों में, एंटीबायोटिक दवाओं या एक विशेष आहार के उपयोग के लिए स्थिर उपनिवेशन स्थापित करने की आवश्यकता है. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार भी मनुष्य के सी एल्बिकन्स उपनिवेशन को बढ़ाता है और प्रसारित रोग10के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है . इस अध्ययन में इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं अपेक्षाकृत सस्ती हैं और बैक्टीरियल माइक्रोबायोटा में विश्वसनीय कम हो जाती है। ध्यान दें कि एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग विरोधी जीवाणु प्रजातियों के बोझ को कम करने के लिए किया जाता है, जानवरों से सभी बैक्टीरिया को खत्म करने के लिए नहीं। यदि शोधकर्ताओं ने बैक्टीरिया की अनुपस्थिति में सी albicans-मेजबान बातचीत का अध्ययन करना चाहते हैं या एंटीबायोटिक दवाओं या एक विशेष आहार के उपयोग से बचने के लिए, रोगाणु मुक्त जानवरों पारंपरिक रूप से पाले जानवरों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है; हालांकि, gnotobiotic चूहों कुछ प्रतिरक्षा और शारीरिक असामान्यताओं का प्रदर्शन और इसलिए सभी प्रयोजनों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है.

कई कदम सफल FISH धुंधला के लिए महत्वपूर्ण हैं: जीआई ऊतकों की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए अनुशंसित निर्धारण विधि महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से आंत लुमेन की नाजुक सामग्री, जैसे बलगम परत और तीन आयामी कवक और बैक्टीरिया का संगठन16| कृपया ध्यान दें कि कई आमतौर पर इस्तेमाल किया निर्धारण समाधान है कि पानी होते हैं अत्यधिक luminal वास्तुकला के लिए हानिकारक हैं. इस प्रोटोकॉल में अनुशंसित पोस्ट-फिक्सेशन washes के लिए फिक्सेटिव और समाधान में पानी नहीं होता है, और पानी के साथ संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। एक अन्य महत्वपूर्ण कदम संकरीकरण कदम है, जहां हाइब्रिडाइजेशन ओवन में स्लाइड्स के ऊष्मायन के दौरान हाइब्रिडाइजेशन समाधान के वाष्पीकरण से बचना महत्वपूर्ण है। हम इस समस्या से बचने के लिए स्लाइड को एक वाटरटाइट कंटेनर में रखने का सुझाव देते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक ऐसे मूल रूप से microarrays के संकरीकरण के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में watertight संकरीकरण कक्षों का उपयोग कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल में सी एल्बिकन्स-विशिष्ट फिश जांच का वर्णन किया गया है. हालांकि, क्योंकि कई प्रयोगशाला reared चूहों सी albicans या उनके प्राकृतिक आंत microbiota के भाग के रूप में अन्य कवक शामिल नहीं है, एक panfungal जांच विशेष रूप से प्रयोगात्मक उपनिवेशित जानवरों में सी albicans दाग हो सकता है. एक पैनफंगल जांच का प्रतिस्थापन इसकी बेहतर संकरण विशेषताओं और उच्च संकेत-से-शोर अनुपात के कारण वांछनीय हो सकता है। यदि पैनफंगल जांच का उपयोग सी एल्बिकन्सके लिए एक छद्म विशिष्ट जांच के रूप में किया जाता है , तो यह असंक्रमित जानवरों में दाग की कमी का दस्तावेजीकरण करना महत्वपूर्ण है (यानी , एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जाता है लेकिन सी एल्बिकननहीं ). एक noncolonized नियंत्रण जानवर के दाग भी पृष्ठभूमि धुंधला है कि खाद्य कण के लिए FISH जांच के पालन से परिणाम हो सकता है का आकलन करने के लिए उपयोगी है. कुल मिलाकर, FISH जांच का उपयोग दाग कवक के अधिकांश अन्य तरीकों पर बढ़ाया विशिष्टता प्रदान करता है, ऐसे Calcofluor सफेद के रूप में (जो चिटिन दाग, एक सेल दीवार घटक है कि सेल प्रकार के बीच भिन्न हो सकते हैं), जीएमएस, या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीफंगल एंटीबॉडी. इसके अलावा, FISH धुंधला प्रजातियों-विशिष्ट RRNAs के लिए अंतर लेबल FISH जांच का उपयोग कर कई जीवों के costaining के लिए अनुमति देता है.

इस तकनीक का एक चेतावनी यह है कि कुछ सी albicans खमीर सेल प्रकार FISH द्वारा बहुत समान दिखाई देते हैं (उदाहरण के लिए, अपारदर्शी और GUT सेल प्रकार). इन सेल प्रकारों के बीच भेद करने के लिए, सेल प्रकार-विशिष्ट कवक MRNAs के लिए हाइब्रिडाइजेशन जांच विकसित करने के लिए उपयोगी होगा। फिर भी, अपने वर्तमान रूप में, FISH तकनीक पहले से ही दोनों स्थितियों12के तहत मूल्यांकन सी albicans उत्परिवर्ती के विट्रो व्यवहार में विवो और इन विट्रो व्यवहार के बीच आश्चर्य की बात विसंगतियों का पता चला है, में जटिल बातचीत का संकेत प्राकृतिक commensal वातावरण है कि पर्याप्त रूप से इन विट्रो परख में मौजूदा द्वारा नकल नहीं कर रहे हैं. अतिरिक्त जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती मेजबान में विभिन्न सी albicans दाग के आगे के अध्ययन कवक मेजबान बातचीत में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि उपज की संभावना है. विशेष रूप से, यह सूजन आंत्र रोग के मॉडल में सी albicans प्रोफ़ाइल करने के लिए शिक्षाप्रद हो जाएगा, जो मनुष्यों में सी albicans के उच्च titers के साथ जुड़ा हुआ है21, और सी albicans अतिवृद्धि और रोग के अन्य मॉडल. FISH तकनीक भी विशिष्ट मेजबान कोशिकाओं दाग करने के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ जोड़ा जा सकता है। कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत विधि स्तनधारी सैनिक पथ के भीतर सी albicans स्थानीयकरण और आकृति विज्ञान निर्धारित करने के लिए एक काफी जल्दी और विश्वसनीय साधन प्रदान करता है.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों के लिए कैरोलिना Tropini, Katharine एनजी, जस्टिन Sonnenburg, और केसी Huang FISH तकनीक के विकास में मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. टेरेसा O'Meara पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी प्रदान की है, और मरियम लेवी फोटोग्राफी के साथ सहायता प्रदान की. यह काम NIH अनुदान R01AI108992, R01DK113788, और संक्रामक रोग के रोगजनन में एक Burroughs स्वागत पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe BD 309659 can be substituted from any vendor
BHI blood agar can be substituted from any vendor
C. albicans FISH probe IDT DNA Technologies custom order
Chamber for hybridization incubation watertight chamber meant to reduce evaporation
Chloroform Sigma C2432 >=99.5%
DAPI Roche 10236276001 can be substituted from any vendor
Delicate task wiper tissues Kimberley-Clark 34256CT Kimwipes
D-glucose Sigma G7021-5KG can be substituted from any vendor
Ethanol Sigma E7023 molecular biology grade
Feeding needles Cadence, Inc. 7910 metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize
FITC-UEA-1 Sigma L9006-1MG other fluorophores available
FITC-WGA Sigma L4895-2MG other fluorophores available
Foam pads Fisher 22038221 Order foam pads that will fit within cassettes
Formamide Sigma 47671 molecular biology grade
Glacial acetic acid Macron Fine Chemicals MK881746 ACS reagent, >=99.5%
Glass Coplin jar Fisher 08-815 hold up to 10 slides back to back
Histology cassettes Simport M512 Deep cassettes so cecum is not squished
Hybridization coverslips Sigma GBL712222 RNase-free
Hybridization oven can be substituted from any vendor
LB can be substituted from any vendor
Lee's media prepared as described in Lee et al. 1975
Methanol Sigma 179337 ACS reagent, >=99.8%
Mice Charles River Laboratories 028 adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks)
Paraformaldehyde Fisher 50-980-487 16% solution
Parrafin wax Sigma P3558-1KG Paraplast for tissue embedding
PBS, pH 7.4 UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit CCFAL003 calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor
Penicillin G Sigma PENNA-100MU
Sabouraud dextrose agar can be substituted from any vendor
Saline Baxter 2F7123 sterile, can be substituted from any vendor
Sodium chloride (NaCl) Sigma S3014 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma L3771 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Streptomycin Sigma S9137-100G
Super PAP pen Life Technologies 8899 can be substituted from any vendor
Tris-HCl Sigma T3253 can be substituted from any vendor; maintain RNase-free
Vectashield Vector Laboratories H-1000 does not contain DAPI
Xylenes Sigma 214736 reagent grade
YEPD can be substituted from any vendor

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 153 कैंडिडा एल्बिकन्स,आंत कोमेन्सल सीटू हाइब्रिडाइजेशन (फिश) श्लेष्म स्थानीयकरण आकारिकी में फ्लोरोसेंट
Murine गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में <em>Candida albicans</em> के दृश्य Situ संकरीकरण में फ्लोरोसेंट का उपयोग
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Witchley, J. N., Penumetcha, P. M.,… More

Witchley, J. N., Penumetcha, P. M., Noble, S. M. Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (153), e60283, doi:10.3791/60283 (2019).

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