Summary
El propósito de este protocolo es visualizar la forma de la célula candida albicans y la localización en el tracto gastrointestinal de los mamíferos.
Abstract
Candida albicans es un componente fúngico de la microbiota intestinal en humanos y muchos otros mamíferos. Aunque C. albicans no causa síntomas en la mayoría de los huéspedes colonizados, el reservorio commensal sirve como repositorio de enfermedades infecciosas, y la presencia de altos tetadores fúngicos en el intestino se asocia con la enfermedad inflamatoria intestinal. Aquí, describimos un método para visualizar la morfología y localización celular de C. albicans en un modelo de ratón de colonización gastrointestinal estable. La colonización se establece utilizando una dosis única de C. albicans en animales que han sido tratados con antibióticos orales. Los segmentos de tejido intestinal se fijan de manera que se conserva la arquitectura del contenido luminal (microorganismos y moco) así como la mucosa huésped. Finalmente, la hibridación fluorescente in situ se realiza utilizando sondas contra el ARN de hongos para manchar c. albicans e hifas. Una ventaja clave de este protocolo es que permite la observación simultánea de la morfología celular de C. albicans y su asociación espacial con las estructuras anfitrionas durante la colonización gastrointestinal.
Introduction
Candida albicans es un hongos commensal, así como un patógeno humano oportunista. Esta levadura carece de un nicho ambiental definido y en su lugar se propaga dentro del tracto gastrointestinal (GI), la piel y el tracto genitourinario de los seres humanos y otros mamíferos1. Mientras que las primeras investigaciones sobre C. albicans se centraron principalmente en su potencial de virulencia, varios informes recientes sugieren que los organismos que propagan en el intestino pueden desempeñar un papel importante en la salud normal, incluido el desarrollo inmune del host2,3,4. Para facilitar las investigaciones de C. albicans commensalismo dentro del intestino de los mamíferos, desarrollamos un modelo de ratón de colonización gastrointestinal estable y un método basado en hibridación flúor in situ (FISH) para visualizar células de levadura fúngicas e hifas dentro de las hifas lumen intestinal.
Con algunas excepciones5, ratones criados en laboratorio suelen exhibir resistencia a la colonización fúngica del tracto digestivo. Se cree que la resistencia a la colonización está mediada por especies bacterianas específicas; sin embargo, esto puede ser superado por el tratamiento de los animales con antibióticos6,7 o el uso de una dieta definida químicamente que presumiblemente altera la composición de las especies bacterianascomposición 8,9. Del mismo modo, en los seres humanos, el uso de antibióticos de amplio espectro se ha asociado con el crecimiento excesivo de C. albicans y la diseminación10. Nuestro modelo de colonización murinos utiliza antibióticos de amplio espectro para establecer la colonización de C. albicans de ratones inmunocompetentes, criados convencionalmente. La penicilina y la estreptomicina se proporcionan en el agua potable de los animales durante una semana antes del avano con 108 unidades formadoras de colonias (Unidades formadoras de colonias) de C. albicans. Mientras continúe el agua infundida con antibióticos, C. albicans se propagará a través del tracto gastrointestinal, alcanzando lanzadores fecales de 106x 108 UFC/g. A pesar del alto nivel de colonización de hongos, los animales permanecen sanos y aumentan de peso al mismo ritmo que los controles no infectados. Este modelo se ha utilizado con éxito para detectar y caracterizar múltiples factores de commensalismo de C. albicans 11,12.
Al igual que otros miembros del reino de los hongos, C. albicans es capaz de una enorme plasticidad morfológica13. En condiciones in vitro, se ha demostrado que hace una transición entre al menos seis tipos de células de levadura unicelulares, así como hifas multicelulares y pseudophas. La transición de levadura a hifa es uno de sus atributos de virulencia mejor caracterizados, y las hifas y pseudoplasófias predominan en la mayoría de los modelos de enfermedades de mamíferos, así como en los tejidos humanos infectados. Para determinar la localización de C. albicans y la morfología celular dentro del tracto digestivo murino, desarrollamos una técnica FISH para tindar levaduras e hifas en secciones histológicas fijas. Las sondas consisten en oligonucleótidos de ADN etiquetados fluorescentemente que hibridan al ARN ribosomal 23S fúngico (ARN RRNA), que se distribuye a través del citoplasma fúngico. Debido a que los tejidos huésped se fijan de una manera que preserva la arquitectura tridimensional del intestino, incluyendo la mucosa huésped, el material digestivo, la microbiota bacteriana y la mucosidad dentro del lumen intestinal, esta técnica permite la localización de hongos con respecto a estos puntos de referencia cuando se tiñen. La técnica FISH se compara favorablemente con las manchas histológicas tradicionales para hongos, como el Schiff de ácido periódico (PAS) o la meteramina-plata (GMS) de Gomori, así como los anticuerpos antifúngicos disponibles comercialmente, ya que estos reactivos no son específicos para C. albicans. Por otra parte, los fijadores estándar eliminan la capa de moco y perturban otros contenidos del intestino lumen14,15.
En este artículo, proporcionamos instrucciones detalladas para establecer la colonización de alto grado de C. albicans del tracto gastrointestinal del ratón, para la disección del tracto digestivo de animales eutanasiados, para la fijación de tejidos de una manera que preserve arquitectura, y para la detección de C. albicans dentro de los tejidos huésped usando FISH. Además de las cepas de tipo salvaje y mutantes de C. albicans, la técnica de gavage se puede utilizar para entregar otros microorganismos. La técnica de fijación sería útil para cualquier estudio en el que se desee la preservación del contenido intestinal. El procedimiento FISH se puede completar en un día y se puede utilizar para localizar múltiples especies de hongos mediante el uso de múltiples sondas etiquetadas diferencialmente.
Protocol
Los pasos descritos a continuación han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) UCSF.
1. Colonización gastrointestinal de ratones con C. albicans usando Gavage Oral
- Proporcionar alojamiento para ratones masculinos o femeninos de 18 a 21 g (8 a 10 semanas de edad) según lo aprobado por la IACUC local. Utilice alimentos y agua autoclave a partir del primer día.
NOTA: El uso de jaulas esterilizadas, ropa de cama, alimentos y agua reduce el riesgo de contaminación con bacterias ambientales resistentes a los antibióticos que potencialmente pueden desplazar a C. albicans del intestino. Además, dependiendo de la cuestión experimental, se debe considerar la vivienda individual de los animales porque los ratones son coprofágicos y el contenido intestinal se compartirá entre los animales coalojados. - Al día siguiente, reemplace el agua potable autoclave por agua autoclave que contenga 5% de glucosa, 1.500 U/ml de penicilina G y 2 mg/ml de estreptomicina.
- Para mayor comodidad, prepare 200x soluciones de stock antibiótico(Tabla 1) de antemano, filtre el filtro y congele a -20 oC.
- Mantener a los animales con antibióticos durante una semana.
- Los días 3 y 6 después de que se hayan iniciado los antibióticos, evalúe las heces de cada animal para detectar la contaminación con bacterias aeróbicas resistentes a los antibióticos. Sosteniendo un animal con una mano, coloque un tubo de microfuga sin acobardarse cerca del ano y recoja al menos un pellet fecal.
- Resuspenda cada gránulo fecal en 1 ml de agua estéril y placa 100 l sobre caldo de luria (LB), dextnrosa de peptona de extracto de levadura (YEPD) o infusión de corazón cerebral (BHI) más placas de agar en sangre. Incubar las placas durante la noche en una incubadora estándar (no anaeróbica) a 37 oC y evaluar el crecimiento bacteriano.
NOTA: Las placas deben presentar un crecimiento mínimo (0-20 colonias). Si >20 colonias de bacterias se recuperan de animales tratados con penicilina y estreptomicina, entonces es poco probable que se establezca la colonización de alto nivel con C. albicans y se aborte el experimento.
- Tres días antes del gavage, la raya C. albicans de las existencias de glicerol congelado a YEPD + 2% placas de agar e incubar a 30 oC durante 2 días.
- Un día antes del gavage, inocular una colonia de cada cepa de C. albicans para ser probada en 5 mL de YEPD líquido. Incubar a 30oC durante la noche con temblores.
- La mañana de gavage, diluir el cultivo saturado de C. albicans a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de 0,1 en 100 mL de YEPD precalentado a 30 oC. Agitar en un agitador orbital a 200 rpm a 30oC durante entre 4 h y 5 h hasta que OD600 alcance 1 (crecimiento medio del registro).
- Transfiera cada cultivo de 100 ml a dos tubos cónicos de 50 ml y centrífuga a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT).
NOTA: C. albicans se propaga relativamente lentamente en RT. Si se adapta este protocolo para otra especie, es posible que sea necesario mantener la inócula en el hielo para evitar un crecimiento continuo. - Deseche el sobrenadante, resuspenda las células peletizadas en 20 ml de solución salina estéril por 50 ml de cultivo, y ate los gránulos resuspendidos duplicados en tubos cónicos individuales. Centrífuga a 3.000 x g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda en 20 ml de solución salina estéril. Vortex brevemente y retire 20 l para la medición de OD600. Diluir 1:50 en solución salina normal estéril. Centrifugar las celdas resuspendidas restantes a 3.000 x g durante 5 min.
- Descarta el sobrenadante. Para un tamaño de inóculo de 1 x 108 CFU, resuspenda las células peletadas a aproximadamente 5 x 108 UFC/ml en solución salina normal estéril basada en la concentración estimada determinada a partir de la mediciónde 600 OD.
NOTA: Típicamente, una OD600 de 1 corresponde a 1 x 107 células de levadura/ml. Este valor puede variar según el espectrofotómetro y debe verificarse. Si se desea un cambio en la concentración para las infecciones con un microorganismo diferente, planifique un volumen de inóculo de un ratón de 10 l/g para minimizar las molestias al animal. - Verifique la concentración del inóculo contando una dilución de 1:1.000 con un hemocítómetro. Ajuste el volumen de las células a gavaged en función de la concentración determinada utilizando el hemocítómetro.
- Usando una aguja de alimentación animal(Figura 1A), envaina cada animal con el volumen calculado de un inóculo dado. Vea los pasos 1.13.1-1.13.8 para el procedimiento gavage.
NOTA: La formación para el gavage debe obtenerse de un profesional con experiencia, y el procedimiento debe dominarse con antelación. Un procedimiento exitoso para un solo animal normalmente no toma más de 1 min.- Coloque una aguja autoclave para la alimentación de animales en una jeringa de 1 ml y llene la jeringa con un volumen de gavage, eliminando cualquier burbuja de aire para evitar una dosis inexacta. Colocar sobre una superficie estéril.
- Asegure al animal para gavage. Sostenga al animal en la base de la cola con la mano dominante y deslice la mano no dominante hacia la espalda del animal hasta la piel suelta justo detrás de las orejas.
- Usando el dedo índice y el pulgar de la mano no dominante, juntar la piel suelta firmemente; este es el "scruff". Recoger al animal por su dedo pequeño de scruff y bucle de la misma mano (no dominante) alrededor de la cola para inmovilizar al animal contra la palma de la mano. Extiéndase suavemente la cabeza del animal para que su cabeza y cuerpo (y por lo tanto cuello y esófago) estén en línea recta.
NOTA: Intentar un gavage mientras el cuerpo del animal está doblado o retorcido puede resultar en complicaciones tales como perforación esofágica y muerte del animal. - Recoja la jeringa con la mano dominante y sostenga perpendicular al animal, con la aguja curva da hacia abajo(Figura 1B). Usando la bola de la aguja, enganche suavemente una esquina interior de la boca, avance suavemente la aguja a lo largo del lado de la boca hasta la parte posterior de la garganta, y finalmente mueva la aguja hacia el centro.
NOTA: La introducción de la aguja a lo largo de un camino lateral ayuda a evitar la resistencia de los dientes y la lengua del animal. - Una vez que la bola de la aguja está en la parte posterior de la garganta, incline la aguja hacia arriba para que sea paralela a la línea del cuerpo del animal(Figura 1C).
NOTA: En este punto, el animal exhibirá un reflejo de mordaza. Esto es una buena señal que indica que la aguja está colocada correctamente, y el movimiento de mordaza ayuda a guiar la aguja por el esófago. Si no hay reflejo de mordaza, la aguja puede estar en la tráquea en lugar del esófago. Retire suavemente la aguja y vuelva al paso 1.13.1. - Deje que el animal trague el inóculo hasta que sólo unos pocos milímetros permanezcan visibles(Figura 1D). Avance la aguja suavemente.
NOTA: Si la aguja no avanza, evite usar la fuerza, que puede dañar el esófago. A veces avanzar el último medio centímetro requerirá una mordaza extra grande del animal. Si la aguja parece estar atascada, retírela lentamente e inténtelo de nuevo desde el paso 1.13.4. - Compruebe que la bola de aguja se encuentra en la ubicación correcta (estómago) avanzando suavemente el émbolo. Si no hay resistencia, continúe entregando el inóculo. Una vez administrado el inóculo, retire lentamente la aguja.
- Sustituya al animal en su jaula y continúe monitoreando al animal durante 5 a 10 minutos en busca de signos de respiración o angustia laboriosa. Verifique que el animal reanude la actividad normal poco después del gavage.
- Si se utilizará el mismo inóculo con el siguiente animal, limpie la aguja con una toallita con alcohol. Proceda a la etapa 1.13.1. Si se utilizará un inóculo diferente, utilice una aguja nueva y vuelva al paso 1.13.1.
NOTA: Es importante inspeccionar los animales al día siguiente del gavage. Los animales que presenten signos de angustia (por ejemplo, postura encorvada, respiración trabajada) deben ser eutanasiados humanamente, ya que probablemente han sufrido ruptura esofágica, daño a los pulmones u otra lesión interna de la que es poco probable recuperarse.
- Tras el avalado de los animales, diluciones de placas de la inócula para la verificación de la dosis.
- Preparar diluciones seriales de 10 veces hasta 1:105. Placa uno volumen de gavage de la dilución 1:105 en una placa de 100 mm de agar dextrosa Sabouraud.
- Incubar la placa durante 2 días a 30oC. Contar las UFC para confirmar la dosis de inóculo.
2. Preparación de tejidos gastrointestinales para la histología
NOTA: Esta sección del protocolo está adaptada de Johansson y Hansson16.
- Preparar 500 ml de solución de metacarn (60% metanol, 30% cloroformo, 10% ácido acético glacial) en un frasco de plástico de tapa de tornillo grande por cada 2 animales diseccionados.
PRECAUCION: El metanol y el cloroformo son dañinos si se inhalan y deben manipularse en una campana química. El ácido acético glacial puede ser corrosivo y debe manipularse con el equipo de protección personal adecuado. El metanol, el cloroformo y el ácido acético glacial deben desecharse como residuos peligrosos. - En el punto final experimental, eutanasia a los animales humanamente de acuerdo con un protocolo aprobado por la IACUC local.
NOTA: En animales tratados con antibióticos, la colonización de C. albicans suele oscilar entre 106 UFC/g en el día 5 y 5 x 107 UFC/g para el día 25. - Esterilice las herramientas de disección con un 10% de lejía y enjuague con 70% de etanol.
- Fije a cada animal a una superficie de disección, con el lado ventral hacia arriba. Utilice agujas de 30 G para fijar las extremidades a la superficie de la disección(Figura 2A). Rocíe al animal con 70% de etanol para limpiar el pelaje y minimizar la adherencia a las herramientas.
- Con fórceps contundentes, pellizca una sección de la piel abdominal con la mano no dominante. Usando tijeras con la mano dominante, incise la piel y la fascia subyacente cerca de la base de la pelvis. Extienda la incisión en forma de U a lo largo de cada lado de la cavidad peritoneal y hasta la caja torácica. Levanta la piel del camino.
- Usando un lápiz, preetiquetar casetes de histología para los segmentos de GI que se evaluarán. Por ejemplo, para cada animal, etiquete los casetes separados como "estómago", "intestinos delgados proximales", "intestinos delgados medios", "intestinos delgados distales", "cecum" e "intestinos grandes". Coloque una almohadilla de espuma en la parte inferior de cada cassette(Figura 2A).
NOTA: La Figura 2B describe las secciones sugeridas para colocar en casetes. - Usando fórceps contundentes, extraiga suavemente el cecum de la cavidad peritoneal. Use tijeras para cortar las conexiones entre el cecum y los intestinos pequeños y grandes.
NOTA: El tejido cecal es muy delicado y fácil de romper. Tenga cuidado al manipular. - Coloque todo el cecum en un casete histológico para que quede sin torcer y se aplana plana(Figura 2C). Coloque una segunda almohadilla de espuma en la parte superior y cierre el cassette. Coloque el cassette en un frasco de tapa de tornillo que contenga metacarnes.
- Especiales una sección de los intestinos gruesos que contiene 1 x 2 gránulos fecales, con una longitud inferior a la del cassette.
- Coloque la sección de tejido en el cassette, manteniendo el tejido plano y sin torcer. Superponer con una segunda almohadilla de espuma y cerrar el cassette. Coloque el cassette en metacarn.
- Para cada sección del intestino delgado a tomar muestras, exboe un segmento de 1 x 2 cm que contenga algún material digestivo.
- Coloque el segmento en un casete de histología, manteniendo el tejido plano y sin torcer. Superponer con una segunda almohadilla de espuma y cerrar el cassette. Coloque el cassette en metacarn.
- Para el estómago, cortar las conexiones con el esófago y el intestino delgado. Colocar en un cassette, manteniendo el tejido plano y sin torcer. Superponer con una segunda almohadilla de espuma y cerrar el cassette. Coloque el cassette en metacarn.
- Deje los cassettes en solución de metacarn en RT durante al menos 3 h y menos de 2 semanas.
NOTA: Hay varios puntos durante los cuales los segmentos de indicación geográfica fija se pueden transferir a un servicio de histología comercial. Estos tejidos pueden ser difíciles de seccionar sin interrupción del contenido luminal, y los resultados óptimos serán obtenidos por un técnico experimentado. Si el servicio comercial está dispuesto a realizar lavados antes de incrustar los tejidos en parafina, los casetes se pueden enviar en esta etapa junto con las instrucciones para el paso 2.16. - Comienza a fundir suficiente cera de parafina para cubrir todos los casetes de tejido en un vaso de precipitados grande en un horno de hibridación precalentado de 70 oC.
- Después de la fijación, retire las almohadillas de espuma y devuelva cada sección de tejido intacta a su casete. Lavar los tejidos con las siguientes soluciones a RT con agitación: dos veces durante 35 min en 100% metanol, dos veces por 25 min en 100% etanol, dos veces durante 20 min en xileno.
PRECAUCION: El xileno es inflamable, tóxico y puede causar daños si se inhala. Uso en una campana química con la protección adecuada. Deseche el xileno mediante procedimientos de residuos peligrosos. - Seque los cassettes sobre una toalla de papel y colóquelos en cera de parafina prefundida durante 2 h a 70 oC en un horno de hibridación. Asegúrese de que los cassettes estén llenos de parafina y de que no queden burbujas.
NOTA: Este paso permite que la cera se infiltre en el segmento GI y estabilice el tejido y el contenido. - Retire los cassettes de la cera, deje que el exceso de cera drene y guárdelos en RT hasta que estén incrustados en bloques de cera. Deseche la cera que contiene trazas de xilenos como residuos peligrosos.
NOTA: El Noble Lab utiliza un servicio de histología comercial para la incrustación y seccionamiento de tejidos. Para la visualización estándar de levaduras de C. albicans e hifas, se utilizan secciones de 4 m. Para evaluar la conectividad de los segmentos hiplócores, que normalmente se extienden a través de varios planos, se pueden utilizar secciones de 8 m. Dependiendo de la capacidad de las sondas FISH para penetrar en la muestra, puede ser posible utilizar secciones aún más gruesas.
3. Validación de sondas de nuevo diseño
NOTA: El siguiente protocolo para validar las sondas C. albicans fue adaptado de Swidsinski et al.17.
- Streak C. albicans SC5314 y especies de comparadores estrechamente relacionadas (por ejemplo, Candida dubliniensis, Candida tropicalis)a YEPD + 2% placas de agar. Incubar durante 1 o 2 días a 30oC.
- Inocular 5 ml de medio líquido YEPD con una sola colonia.
- Pipetear 1 ml de las células suspendidas a un tubo de microcentrífuga y centrífuga a 3.000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
- Resuspenda el gránulo en 100 ml de solución salina con fosfato (PBS).
- Pipetear 5 x 10 l de células resuspendidas y detectar sobre un portaobjetos de vidrio. Seextiende en un círculo más grande y deja secar.
NOTA: Si las células no son adherentes, utilice diapositivas recubiertas de poli-L-lisina. - Círculo del punto de celda con una pluma PAP y cubrir con 50 éL de 2.5% de paraformaldehído (PFA) en PBS. Incubar a RT durante 10 min.
PRECAUCION: La PFA es inflamable y puede causar problemas de salud si se inhala o está en contacto con la piel. Los artículos contaminados con PFA deben desecharse como residuos peligrosos. - Lavar 3x con PBS. Toque el líquido en la toalla de papel y cúbralo con 100 ml de PBS. Repita dos veces. Deseche el lavado final.
-
Prepare diapositivas para almacenamiento de varios días. Si realiza FISH el mismo día, continúe con el paso 3.9 sin los pasos de esta sección.
NOTA: Es preferible realizar la hibridación inmediatamente, pero si tiene poco tiempo, siga el paso 3.8 antes de almacenar. Las diapositivas se pueden almacenar durante varios días a 4 oC.- Cubra el lugar con 60% de etanol. Incubar a RT durante 3 min. Deseche la solución.
- Cubra el lugar con 80% de etanol. Incubar a RT durante 3 min. Deseche la solución.
- Cubra el lugar con 100% de etanol. Incubar a RT durante 3 min. Deseche la solución. Continúe con el paso 3.9.
- Colocar las diapositivas descubiertas en un horno de hibridación a 50oC durante 1 h. Si se siguió el paso 3.8, guarde las diapositivas a 4 oC. Si no, proceda al paso 4.2 para realizar el protocolo de hibridación.
4. FISH Sstaining en los tejidos del tracto gastrointestinal
- Secciones histológicas incrustadas en parafina de dewax.
- En un horno de hibridación, precalienta un frasco de Coplin lleno de xileno a 60oC.
- Inserte las diapositivas en el frasco lleno de xileno. Colocar a 60oC durante 10 min. Deseche el lavado de xileno. Mantenga las diapositivas en el frasco y vierta el xileno en un contenedor de residuos.
- Vierta el xileno FRESCO en el frasco e incubar a 60 oC durante 10 min. Deseche el segundo lavado de xileno.
- Llene el frasco con 100% de etanol e incubar a RT durante 5 min. Retire los portaobjetos del frasco y seque al aire.
- Establezca el horno de hibridación en 50oC para los pasos de la sección 4.2.
- Mancha C. albicans con la sonda FISH.
- Preparar 1 ml de solución de hibridación fresca (20 mM Tris–HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.1% de dodecilo sulfato de sodio [SDS], 1% de formación en agua libre de RNase). Consulte el Cuadro 1 para ver los cálculos de muestra.
- Mezclar 50 l de solución de hibridación con 1 l de sonda C. albicans (5' Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3'; 50 g/mL en agua libre de RNase) para una cantidad final de sonda de 0,5 g por diapositiva.
NOTA: Muchos ratones criados en laboratorio no contienen hongos entre su microbiota. En este caso, es posible sustituir una sonda panfúngica (5' Cy3-CTCTCTCTTCACCCTATTC 3') que reconoce 23S rRNA de la mayoría de las especies de hongos, no sólo C. albicans. En la experiencia de los autores, la sonda panfógica produce una tinción más brillante que la sonda específica de C. albicans. - Proteja la solución de la luz y del precalentamiento a 50 oC.
- Con un bolígrafo PAP, dibuje un círculo alrededor de la sección 4.1.
- Pipetear 50 l de solución de hibridación que contiene sondas sobre el tejido fijo y se extiende suavemente sobre la sección del tejido con una punta de pipeta. Superponga el líquido con un cubreobjetos de hibridación asegurándose de evitar burbujas.
- Selle los portaobjetos en una cámara de hibridación estanca e incubar las secciones durante 3 h a 50oC en la oscuridad en un horno de hibridación.
- Mientras tanto, prepare 50 ml de solución de lavado FISH (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 M NaCl en agua libre de RNase). Consulte el Cuadro 1 para ver los cálculos de muestra.
- Mueva la solución de lavado a 50 oC al precalentamiento.
- Después de las 3 h, agregue la solución de lavado a un frasco de Coplin. A continuación, retire cuidadosamente el cubreobjetos de la corredera con fórceps y coloque el portaobjetos en la solución de lavado.
- Cubrir el frasco con papel de aluminio e incubar a 50oC durante 20 min.
- Durante esta incubación, preparar la solución de tinción de mucina-nuclei (20 ng/ml 4o,6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI], 1,6 g/ml de fluoresceína isotiocianato [FITC]-lectina en PBS). Consulte el Cuadro 1 para ver los cálculos de muestra. Para el estómago y los intestinos gruesos, utilice FITC-Ulex europaeus aglutinina 1 (UEA-1). Para los intestinos delgados y el cecum, utilice una combinación de aglutinina de germina germinal de trigo FITC-UEA-1 y FITC(WGA).
NOTA: Las lectinas de diferentes especies reconocen diferentes modificaciones del azúcar de las glicoproteínas como la mucina. Las combinaciones de lectina recomendadas aquí se determinaron empíricamente para la tinción óptima de moco en diferentes compartimentos gastrointestinales. - Lave los portaobjetos vertiendo la solución de lavado FISH y rellenando el frasco con RT PBS. Vierta el PBS inmediatamente y rellene con PBS. Vierta el PBS para un total de 2 lavados.
- Extraiga el PBS con un delicado tejido limpiaparabrisas y circule la sección del tejido intestinal con una pluma PAP. Coloque las diapositivas en un recipiente de plástico opaco y agregue 50 ml de solución de tinción de mucina-nuclei a la sección de tejido. Cubra el recipiente con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Incubar a 4oC durante 45 min.
- Coloque las diapositivas en un frasco de Coplin y lávelas rápidamente dos veces en PBS en RT.
- Toque el exceso de PBS en una toalla de papel y, a continuación, reseque las gotas finales de PBS con un pañuelo.
- Coloque una gota de medio de montaje en cada sección y superponga con un cubreobjetos de vidrio, evitando burbujas. Deje que el medio de montaje se extienda por debajo de toda la cubierta. Para obtener imágenes inmediatas, ancle el cubreobjetos en su lugar con esmalte de uñas en las esquinas. Para el almacenamiento a largo plazo, cierre alrededor de la cubierta con esmalte de uñas.
- Imagen de las diapositivas con un microscopio fluorescente.
Representative Results
Siguiendo las instrucciones proporcionadas, el resultado de esta técnica será el etiquetado fluorescente de los núcleos en el epitelio del huésped, moco y C. albicans en los tejidos GI seccionados. Las células de Candida albicans de tipo salvaje deben aparecer como células de levadura redondas y unicelulares o hifas multicelulares altamente alargadas, a veces ramificadas (las divisiones celulares no serán evidentes en las hifas). Los mutantes de C. albicans pueden aparecer además como levaduras "grises" más pequeñas y ligeramente alargadas o como levaduras "GUT" (transición inducida por el gastrointestinal) o "opacas" más grandes y ligeramente alargadas.
La Figura 1 representa la aguja de alimentación utilizada para el gavage oral, así como las posiciones clave de la aguja durante el procedimiento de gavage. La Figura 2 proporciona una configuración típica utilizada para la disección de órganos y la aparición de segmentos GI del ratón.
La Figura 3 muestra la tinción FISH de diferentes tipos de células C. albicans después de la propagación in vitro y dentro del modelo de ratón. La Figura 3A muestra imágenes de fluorescencia y fase de hifas fijas, permeabilizadas e in vitro. La formación de hifas fue inducida con líquido Lee's medium18 con 2% N-acetilglucosamina, pH 6.8 a 37 oC. La Figura 3B muestra imágenes de fluorescencia y fase de células de levadura fijas, permeabilizadas e in vitro. La Figura 3C,D muestra células GUT fijas, permeabilizadas, in vitro y células opacas, respectivamente. Los tipos de células opacas y GUT son morfológicamente indistinguibles, excepto cuando se visualizan mediante la exploración de microscopía electrónica. Tenga en cuenta que la tinción FISH de células in vitro-propagadas será subóptima si las células no están bien permeabilizadas. En la Figura 3Cse muestra un ejemplo de tinción débil y difusa. Para obtener mejores resultados, las condiciones de fijación y permeabilización celular deben determinarse empíricamente para cada tipo de célula y especie a investigar. Afortunadamente, el protocolo recomendado para visualizar C. albicans en tejidos seccionados produce una permeabilización más consistente.
Figura 3E-G representa C. albicans en los intestinos gruesos del ratón, manchado con la sonda específica De C. albicans (Figura3E) o la sonda panfógica ( Figura3F, G). C. albicans aparece rojo en estas imágenes, los núcleos de células anfitrionas son azules y la capa de moco es verde. Tanto las levaduras redondas como las hifas muy alargadas (puntas de flecha blancas) ocurren en los intestinos gruesos. Tenga en cuenta que la tinción es más brillante con la sonda panfógica. La Figura 3G representa a un mutante ume6 en el mismo compartimiento, manchado con la sonda panfúngica. Ume6 codifica un factor de transcripción que se requiere para la formación de hifas en condiciones in vitro19 . Curiosamente, el fenotipo con cadena de levadura mostrado por este mutante en condiciones in vitro no se recapitula dentro del intestino, lo que sugiere que un factor redundante debe activarse dentro del host12. La Figura 4 representa la aparición de comodines tipo C. albicans en diferentes segmentos del tracto gastrointestinal murino, incluyendo las regiones inmediatamente adyacentes a la mucosa huésped y regiones más centrales del lumen intestinal.
Figura 1: Clave de alimentación de las posiciones de la aguja durante el gavage. (A) Aguja de alimentación. (B) Alimentación de la bola de aguja insertada al lado de la lengua. (C) Aguja de alimentación en posición vertical con inserción en el esófago. (D) Aguja de alimentación insertada en el estómago con unos pocos milímetros visibles por encima de la nariz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplo de diseño de disección. (A) Almohadilla de disección y herramientas. (B) Tracto de indicaciones geográficas con impuestos. Secciones proximales (esófago) a distal (ano): I. Estómago. II. Intestinos proximales. III. Intestinos delgados mediales. IV. Intestinos intestinales distales. V. Cecum. VI. Intestino grueso. Las cajas de borde discontinuas rosas indican los tejidos que se deben fijar. (C) Tejidos colocados en casetes. Los números romanos son los mismos que en el panel B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas de C. albicans teñido sofocans.( A) FISH de C. hifas albicans cultivadas en medios líquidos de Lee18 con 2% de N-acetilglucosamina, pH 6.8. (B) FISH de C. albicans células de levadura redondas cultivadas en YEPD + 2% placas de agar. (C) FISH de células DE GUT C. albicans (ySN1045) cultivadas en YEPD + 2% placas de agar. (D) FISH de C. albicans células opacas cultivadas en YEPD + 2% placas de agar. (E) Tipo salvaje C. albicans (ySN250) en intestinos gruesos, teñido con la sonda específica C. albicans. (F) Tipo salvaje C. albicans en intestino grueso, manchado con la sonda panfúngica. (G) Ume6 mutante (ySN1479) en intestinogruesos, manchado con la sonda panfúngica: rojo es C. albicans, azul es núcleoepal huésped, y verde es mucina. Las puntas de flecha indican hifas. Las flechas indican levadura. Las barras de escala de 20 m. Las imágenes F y G están adaptadas de Witchley et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Apariencia de C. albicans teñido de FISH en diferentes compartimentos intestinales. El tipo salvaje C. albicans se muestra en los segmentos indicados del tracto gastrointestinal del ratón. Dentro de cada compartimiento, las imágenes representan el área adyacente a la mucosa anfitriona y la región central del lumen intestinal. La tinción se realizó con la sonda panfógica. La barra de escala es de 20 m. Las imágenes están adaptadas de Witchley et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reservas de antibióticos (200x) | |||
| Penicilina G | 181 mg/ml | ||
| Estreptomicina | 400 mg/L | ||
| Methacarn | |||
| Acción | Concentración final | Volumen | Unidades |
| Metanol | 60% | 300 | Ml |
| Cloroformo | 30% | 150 | Ml |
| Acido acético glacial | 10% | 50 | Ml |
| Solución de hibridación | |||
| Acción | Concentración final | Volumen | Unidades |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 20 | Μl |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 180 | Μl |
| 10% SDS | 0.10% | 10 | Μl |
| 100% formamida | 1.00% | 10 | L (mantenido en pequeñas alícuotas a -20 oC entre usos) |
| Agua libre de RNase | 780 | Μl | |
| Solución de lavado FISH | |||
| 1 M Tris-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M NaCl | 0,9 M | 9 | Ml |
| Agua libre de RNase | 40 | Ml | |
| Solución de tinción de Mucin-nuclei | |||
| DAPI, 10 g/ml | 20 ng/mL | 2 | Μl |
| lectina, 40 g/ml | 1.6 g/ml | 40 | Μl |
| PBS, pH 7.4 | 958 | Μl | |
Tabla 1: Volúmenes y concentraciones típicos de las soluciones utilizadas en este protocolo.
Discussion
El método descrito aquí permite la visualización de levaduras de C. albicans e hifas en los tratados gastrointestinales de ratones colonizados comensales de cualquier sexo o cepa. La sonda FISH hibrida a 23S rRNA, que se distribuye a través del citoplasma fúngico. Nuestro método fue adaptado de un protocolo previamente reportado para visualizar bacterias intestinales20. Debido a que C. albicans cambia su morfología dentro del huésped, el método es útil para monitorear la forma de las células fúngicas, así como la localización. Por ejemplo, hemos utilizado este método para refutar la hipótesis de que las levaduras predominan en todo el tracto digestivo, y para exponer las discrepancias entre los fenotipos in vivo e in vitro de ciertos mutantes "filamentación-defectuosos"12.
Existen varios modelos de ratón para la colonización commensal de C. albicans. La microbiota de ratones de laboratorio y humanos es distinta y, en ratones, se requiere el uso de antibióticos o una dieta especializada para establecer una colonización estable. El tratamiento con antibióticos también mejora la colonización de seres humanos de C. albicans y es un factor de riesgo importante para la enfermedad diseminada10. Los antibióticos utilizados en este estudio son relativamente baratos y producen disminuciones confiables en la microbiota bacteriana. Tenga en cuenta que los antibióticos se utilizan para disminuir la carga de especies bacterianas antagónicas, no para eliminar todas las bacterias de los animales. Si los investigadores desean estudiar C. albicans-las interacciones del huésped en ausencia de bacterias o para evitar el uso de antibióticos o una dieta especial, los animales libres de gérmenes pueden ser sustituidos por animales criados convencionalmente; sin embargo, los ratones gnotobióticos presentan ciertas anomalías inmunitarias y anatómicas y, por lo tanto, pueden no ser adecuados para todos los fines.
Varios pasos son importantes para el éxito de la tinción FISH: El método de fijación recomendado es fundamental para preservar la integridad estructural de los tejidos gastrointestinales, particularmente el contenido frágil del lumen intestinal, como la capa de moco y la tridimensional organización de hongos y bacterias16. Tenga en cuenta que muchas soluciones de fijación de uso común que contienen agua son altamente perjudiciales para la arquitectura luminal. Los fijadores y soluciones para lavados post-fijación recomendados en este protocolo no contienen agua, y es importante evitar la contaminación con agua. Otro paso crítico es el paso de hibridación, donde es importante evitar la evaporación de la solución de hibridación durante la incubación de diapositivas en el horno de hibridación. Sugerimos colocar los portaobjetos en un recipiente estanco para evitar este problema. Alternativamente, se pueden utilizar cámaras de hibridación estancas como las utilizadas originalmente para la hibridación de microarrays.
En este protocolo se describe una sonda FISH específica de C. albicans. Sin embargo, debido a que muchos ratones criados en laboratorio no contienen C. albicans u otros hongos como parte de su microbiota intestinal natural, una sonda panfógica puede manchar específicamente C. albicans en animales colonizados experimentalmente. La sustitución de una sonda panfúngica puede ser deseable debido a sus características superiores de hibridación y una mayor relación señal-ruido. Si la sonda panfúngica se utiliza como sonda pseudoespecífica para C. albicans,es importante documentar la falta de tinción en animales no infectados (es decir, tratados con antibióticos pero no con C. albicans). La tinción de un animal de control no colonizado también es útil para evaluar la tinción de fondo que puede resultar de la adherencia de las sondas FISH a las partículas de alimentos. En general, el uso de sondas FISH ofrece una mayor especificidad sobre la mayoría de los otros métodos de tinción de hongos, como el blanco calcofluor (que mancha la quitina, un componente de pared celular que puede variar entre los tipos de células), GMS o anticuerpos antifúngicos disponibles comercialmente. Además, la tinción FISH permite la costarinación de múltiples organismos utilizando sondas FISH etiquetadas diferencialmente a rRNA específicas de cada especie.
Una advertencia de esta técnica es que ciertos tipos de células de levadura C. albicans parecen muy similares por FISH (por ejemplo, los tipos de células opacas y GUT). Para distinguir entre estos tipos de células, sería útil desarrollar sondas de hibridación a ARNM de hongos específicos del tipo de célula. Sin embargo, en su forma actual, la técnica FISH ya ha revelado sorprendentes discrepancias entre los comportamientos in vivo e in vitro de los mutantes de C. albicans evaluados en ambas condiciones12,lo que indica interacciones complejas en el ambiente comensal natural que no son adecuadamente imitados por los ensayos in vitro existentes. Es probable que otros estudios de diferentes manchas de C. albicans en tipo salvaje adicional y huéspedes mutantes produzcan información adicional sobre las interacciones entre hongos y huésped. En particular, será instructivo perfilar C. albicans en modelos de enfermedad inflamatoria intestinal, que se asocia con altos tituladores de C. albicans en los seres humanos21,y otros modelos de C. albicans sobrecrecimiento y enfermedad. La técnica FISH también se puede combinar con inmunohistoquímica para manchar células huésped específicas. En general, el método presentado aquí proporciona un medio razonablemente rápido y confiable para determinar la localización y morfología de C. albicans dentro del tracto gastrointestinal de mamíferos.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg y KC Huang por su orientación en el desarrollo de la técnica FISH. Teresa O'Meara proporcionó comentarios útiles sobre el manuscrito, y Miriam Levy ayudó con la fotografía. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones De NIH R01AI108992, R01DK113788, y un Premio de Bienvenida Burroughs en la Patogénesis de Enfermedades Infecciosas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).
