Summary
O objetivo deste protocolo é visualizar candida albicans forma celular e localização no trato gastrointestinal de mamíferos.
Abstract
Candida albicans é um componente fúngico da microbiota intestinal em seres humanos e muitos outros mamíferos. Embora os albicans de C. não causem sintomas em a maioria de anfitriões colonizados, o reservatório do commensal sere como um repositório para a doença infecciosa, e a presença de titers fungosos elevados no intestino é associada com a doença de entranhas inflamatório. Aqui, descrevemos um método para visualizar a morfologia e localização de células c. albicans em um modelo de camundongo de colonização gastrointestinal estável. A colonização é estabelecida usando uma única dose de C. albicans nos animais que foram tratados com os antibióticos orais. Segmentos de tecido intestinal são fixados de uma forma que preserva a arquitetura de conteúdo luminal (microorganismos e muco), bem como a mucosa hospedeira. Finalmente, a hibridização in situ fluorescente é realizada usando sondas contra rRNA fúngico para manchar para C. albicans e hícina. Uma vantagem chave deste protocolo é que permite a observação simultânea da morfologia da pilha de C. albicans e de sua associação espacial com as estruturas do anfitrião durante a colonização gastrintestinal.
Introduction
Candida albicans é um commensal fúngico, bem como um patógeno humano oportunista. Este fermento carece de um nicho ambiental definido e, em vez se propaga dentro do trato gastrointestinal (GI), pele e trato geniturinário de seres humanos e outros mamíferos1. Considerando que as primeiras pesquisas sobre C. albicans se concentraram principalmente em seu potencial de virulência, vários relatórios recentes sugerem que a propagação de organismos commensally dentro do intestino pode desempenhar papéis importantes na saúde normal, incluindo o desenvolvimento imunológico do anfitrião2,3,4. Para facilitar as investigações do commensalismo de C. albicans dentro do intestino de mamíferos, desenvolvemos um modelo de camundongo de colonização gi estável e um método baseado em hibridização de fluorescência in situ (FISH) para visualizar células fúngicas de levedura e hícina dentro do lúmen intestinal.
Com algumas exceções5,os ratos laboratório-produzidos exibem tipicamente a resistência à colonização fungosa do intervalo digestivo. Acredita-se que a resistência à colonização seja mediada por espécies bacterianas específicas; no entanto, isso pode ser superado pelo tratamento dos animais com antibióticos6,7 ou uso de uma dieta quimicamente definida que, presumivelmente, altera a composição de espécies bacterianas8,9. Da mesma forma, em seres humanos, o uso de antibióticos de amplo espectro tem sido associado com c. albicans supercrescimento e disseminação10. Nosso modelo de colonização de urina usa antibióticos de amplo espectro para estabelecer a colonização de camundongos imunocompetentes e criados convencionalmente. Penicilina e estreptomicina são fornecidos na água potável dos animais por uma semana antes do gavage com 108 colônias formando unidades (CFUs) de C. albicans. Enquanto a água infundida com antibióticos for continuada, os c. albicans se propagarão através do trato gastrointestinal, atingindo titers fecais de 106-108 CFUs/g. Apesar do alto nível de colonização fúngica, os animais permanecem saudáveis e ganham peso na mesma taxa que os controles não infectados. Este modelo tem sido usado com sucesso para rastrear e caracterizar vários c. albicans commensalism fatores11,12.
Como outros membros do reino fúngico, C. albicans é capaz de plasticidade morfológica enorme13. condições in vitro, tem sido mostrado para a transição entre pelo menos seis tipos unicelulares de células de levedura, bem como hída multicelular e pseudohída. A transição de levedura para híha é um de seus atributos de virulência mais caracterizados, e a hifenha e pseudohhmeu predominam na maioria dos modelos de doenças de mamíferos, bem como em tecidos humanos infectados. Para determinar a localização de C. albicans e a morfologia celular dentro do trato digestivo murine, desenvolvemos uma técnica de PEIXE para colorir leveduras e hícinas em seções histológicas fixas. As sondas consistem em oligonucleotídeos de DNA com rótulo fluorescente que hibridizam o RNA ribossômico 23S (rRNA), que é distribuído por todo o citoplasma fúngico. Como os tecidos hospedeiros são fixados de uma forma que preserva a arquitetura tridimensional do intestino, incluindo a mucosa hospedeira, material digestivo, a microbiota bacteriana e o muco dentro do lúmen intestinal, esta técnica permite a localização de fungos células com relação a estes marcos quando manchado. A técnica FISH compara favoravelmente às manchas histológicas tradicionais para fungos, como o ácido periódico Schiff (PAS) ou a Methenamina-Prata (GMS) de Gomori, bem como anticorpos antifúngicos comercialmente disponíveis, porque esses reagentes não são específicos para C. albicans. Além disso, os fixativos padrão remover a camada de muco e perturbar outros conteúdos do intestino lumen14,15.
Neste artigo, fornecemos instruções detalhadas para o estabelecimento de alta qualidade C. albicans colonização do trato GI do rato, para dissecação do trato digestivo de animais eutanasiados, para fixação de tecidos de uma forma que preserva luminal arquitetura, e para a detecção de C. albicans dentro de tecidos hospedeiros usando PEIXE. Além do tipo selvagem e cepas mutantes de C. albicans, a técnica de gavage pode ser usada para entregar outros microorganismos. A técnica de fixação seria útil para qualquer estudo em que a preservação do conteúdo intestinal é desejada. O procedimento fish pode ser concluído dentro de um dia e pode ser usado para localizar várias espécies fúngicas usando várias sondas com rótulo diferencial.
Protocol
As etapas descritas abaixo foram aprovadas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UCSF (IACUC).
1. Colonização gastrointestinal de camundongos com c. albicans usando gavage oral
- Fornecer moradia para camundongos machos ou fêmeas de 18 a 21 g (8 a 10 semanas de idade), conforme aprovado pelo IACUC local. Use comida autocllavada e água a partir do primeiro dia.
Nota: O uso de gaiolas esterilizadas, cama, alimentos e água reduz o risco de contaminação com bactérias ambientais resistentes a antibióticos que podem potencialmente deslocar c. albicans do intestino. Além disso, dependendo da questão experimental, a habitação individual dos animais deve ser considerada porque os ratos são coprofafagos e o conteúdo intestinal será partilhado entre os animais coalojados. - No dia seguinte, substitua a água potável autocllavada por água autocllavada contendo 5% de glicose, 1.500 U/mL penicilina G e 2 mg/mL de estreptomicina.
- Por conveniência, prepare soluções de estoque de antibióticos 200x(Tabela 1) com antecedência, filtre esterilizar e congelar a -20 °C.
- Manter animais em antibióticos por uma semana.
- Nos dias 3 e 6 após o início dos antibióticos, avalie as fezes de cada animal quanto à contaminação por bactérias aeróbicas resistentes a antibióticos. Segurando um animal com uma mão, coloque um tubo de microfúgio sem tampa perto do ânus e recolher pelo menos uma pelota fecal.
- Resuspende cada pelota fecal em 1 mL de água estéril e placa 100 μL em caldo de Luria (LB), extrato de levedura peptone dextrose (YEPD), ou infusão cardíaca cerebral (BHI) além de placas de ágar de sangue. Incubar as placas durante a noite em uma incubadora padrão (não anaeróbica) a 37 °C e avaliar para o crescimento bacteriano.
Nota: As placas devem apresentar um crescimento mínimo (0 a 20 colônias). Se as colônias de bactérias forem recuperadas de animais tratados com penicilina e estreptomicina, então é improvável que a colonização de alto nível com c. albicans seja estabelecida e o experimento seja abortado.
- Três dias antes do gavage, raia C. albicans de estoques congelados de glicerol para YEPD + 2% placas de ágar e incubado a 30 °C por 2 dias.
- Um dia antes do gavage, inocular uma colônia de cada cepa c. albicans a ser testado em 5 mL de YEPD líquido. Incubar a 30 °C durante a noite com agitação.
- Na manhã do gavage, diluir a cultura saturada de C. albicans a uma densidade óptica em 600 nm (OD600)de 0,1 em 100 mL de YEPD pré-aquecido a 30 °C. Agite em um agitador orbital em 200 rpm em 30 °C para entre 4 h e 5 h até OD600 atinge 1 (crescimento mid-log).
- Transfira cada cultura de 100 mL para dois tubos cônicos de 50 mL e centrífuga a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT).
NOTA: C. albicans propaga relativamente lentamente em RT. Se adaptar este protocolo para outra espécie, o inocula pode precisar ser mantido no gelo para evitar o crescimento contínuo. - Descarte o supernatant, resuspenda as pilhas pelleted em 20 mL do soro fisiológico estéril por 50 mL da cultura, e adreça as pelotas resuspended duplicadas em únicos tubos cónicos. Centrífuga a 3.000 x g por 5 min.
- Descarte o supernatant e resuspenda em 20 mL de sosseo estéril. Vortex brevemente e remover 20 μL para a medição od600. Diluir 1:50 em sisino normal estéril. Centrífuga as células resuspensas restantes a 3.000 x g por 5 min.
- Descarte o supernatant. Para um tamanho inoculum de 1 x 108 CFU, resuspenda as células pelleted para aproximadamente 5 x 108 CFUs/mL em soro soro normal estéril com base na concentração estimada determinada a partir da medição de OD600.
Nota: Normalmente, um OD600 de 1 corresponde a ~ 1 x 107 células de levedura/mL. Esse valor pode variar de acordo com o espectrômetro e deve ser verificado. Se uma mudança na concentração é desejada para infecções com um microorganismo diferente, planeie para um volume do inoculum de ≤10 μL/g rato para minimizar o incómodo ao animal. - Verifique a concentração do inóculo contando uma diluição de 1:1.000 com um hemocytometer. Ajuste o volume de células para ser gavaged com base na concentração determinada usando o hemocytometer.
- Usando uma agulha de alimentação animal (Figura 1A), gavage cada animal com o volume calculado de um inóculo dado. Veja os passos 1.13.1-1.13.8 para o procedimento de gavage.
NOTA: O treinamento para gavage deve ser obtido de um médico experiente, e o procedimento deve ser dominado com antecedência. Um procedimento bem sucedido para um único animal normalmente não leva mais do que 1 minuto.- Anexe uma agulha autocllavada de alimentação animal a uma seringa de 1 mL e encha a seringa com um volume de gavage, removendo quaisquer bolhas de ar para evitar uma dose imprecisa. Coloque em uma superfície estéril.
- Proteger o animal para gavage. Segure o animal na base da cauda com a mão dominante e deslize mão não dominante até as costas do animal para a pele solta logo atrás das orelhas.
- Usando o indicador e o polegar da mão não dominante, reúna a pele solta firmemente; esta é a "nuca". Pegue o animal por sua nuca e loop pequeno dedo da mesma mão (não dominante) ao redor da cauda para imobilizar o animal contra a palma da mão. Gentilmente estender a cabeça do animal para que sua cabeça e corpo (e, portanto, pescoço e esôfago) estão em linha reta.
Nota: Tentar um gavage quando o corpo do animal for dobrado ou torcido pode conduzir às complicações tais como a perforation e a morte eosfêticas do animal. - Pegue a seringa com a mão dominante e segure perpendicular ao animal, com a agulha curva apontando para baixo (Figura 1B). Usando a bola da agulha, gentilmente gancho um canto interior da boca, avançar suavemente a agulha ao longo do lado da boca para a parte de trás da garganta, e, finalmente, mover a agulha para o centro.
Nota: Introduzir a agulha ao longo de um caminho lateral ajuda a evitar a resistência dos dentes e da língua do animal. - Uma vez que a bola da agulha está na parte de trás da garganta, incline a agulha para cima para que seja paralelo com a linha do corpo do animal(Figura 1C).
Nota: Neste ponto, o animal vai exibir um reflexo de vômito. Este é um bom sinal que indica que a agulha está posicionada corretamente, e o movimento de engasgos ajuda a guiar a agulha para baixo do esôfago. Se não houver reflexo de vômito, a agulha pode estar na traqueia em vez do esôfago. Retire suavemente a agulha e volte ao passo 1.13.1. - Permita que o animal engula o inóculo até que apenas alguns milímetros permaneçam visíveis(Figura 1D). Avance a agulha sem problemas.
Nota: Se a agulha não avançar, evite usar a força, o que pode danificar o esôfago. Às vezes, avançando o centímetro último meio vai exigir uma mordaça extra-grande do animal. Se a agulha parece estar preso, retire-a lentamente e tente novamente a partir do passo 1.13.4. - Teste que a bola de agulha está no local correto (estômago) por avançar suavemente o desentupidor. Se não houver resistência, continue entregando o inóculo. Uma vez que o inóculo foi administrado, retire lentamente a agulha.
- Substitua o animal em sua gaiola e continue a monitorar o animal por 5 a 10 min em busca de sinais de respiração ou angústia trabalhada. Verifique se o animal retoma a atividade normal logo após gavage.
- Se o mesmo inóculo será usado com o próximo animal, limpe a agulha com uma limpeza de álcool. Volte ao passo 1.13.1. Se um inóculo diferente será usado, use uma agulha nova e prossiga para trás à etapa 1.13.1.
Nota: É importante inspecionar animais no dia seguinte ao gavage. Os animais que exibem sinais de angústia (por exemplo, postura curvada, respiração laboriosa) devem ser sacrificados humanamente, pois provavelmente sofreram ruptura esôfaga, danos nos pulmões ou outra lesão interna da qual a recuperação é improvável.
- Após o gavage dos animais, diluições da placa do inocula para a verificação da dose.
- Prepare diluições em série de 10 vezes até 1:105. Placa um volume de gavage da diluição de 1:105 em uma placa de 100 mm de Sabouraud dextrose agar.
- Incubar a placa por 2 dias a 30 °C. Conte CFUs para confirmar a dose de inóculo.
2. Preparação de tecidos gastrointestinais para histologia
Nota: Esta seção do protocolo é adaptada de Johansson e Hansson16.
- Prepare 500 mL de solução de metacarn (60% metanol, 30% clorofórmio, 10% ácido acético glacial) em um frasco de plástico de grande tampa de rosca para cada 2 animais dissecados.
CUIDADO: O metanol e o clorofórmio são prejudiciais se inalados e devem ser manipulados em uma capa química. O ácido acético glacial pode ser corrosivo e deve ser manuseado com o equipamento de proteção pessoal adequado. O metanol, o clorofórmio e o ácido acético glacial devem ser descartados como resíduos perigosos. - No ponto final experimental, eutanasiar os animais humanamente de acordo com um protocolo aprovado pela IACUC local.
Nota: Em animais tratados com antibióticos, a colonização de C. albicans normalmente varia de ~106 CFUs/g no dia 5 até ~5 x 107 CFUs/g até o dia 25. - Esterilizar ferramentas de dissecação com 10% de lixívia e enxaguar com 70% de etanol.
- Fixe cada animal a uma superfície da dissecação, com o lado ventral que enfrenta acima. Use 30 agulhas G para proteger os membros da superfície da dissecação(Figura 2A). Pulverizar o animal com 70% de etanol para limpar a pele e minimizar a degola para as ferramentas.
- Usando fórceps contundentes, beliscar uma seção da pele abdominal com a mão não dominante. Usando tesoura com mão dominante, incisar a pele e fascia subjacente perto da base da pelve. Estender a incisão em forma de U ao longo de cada lado da cavidade peritoneal e até a caixa torácica. Retire a pele do caminho.
- Usando um lápis, de histologia pré-rotular para os segmentos gi a ser avaliado. Por exemplo, para cada animal, rotular separadas como estômago, intestino delgado proximal, intestino delgado médio, intestino delgado distal, cécum e intestino grosso. Coloque uma almofada de espuma na parte inferior de cada (Figura 2A).
NOTA: Figura 2B descreve seções sugeridas para colocar em. - Usando fórceps contundentes, extrai suavemente o cecum da cavidade peritoneal. Use uma tesoura para cortar conexões entre o cécum e os intestinos delgados e grossos.
Nota: O tecido cecal é muito delicado e fácil de romper. Tome cuidado ao manipular. - Coloque todo o em uma histológica para que ele seja destorcido e fica plano(Figura 2C). Coloque uma segunda almofada de espuma por cima e feche o. Coloque a fita em um frasco de tampa de rosca contendo methacarn.
- Excise uma seção dos intestinos grossos que contem 1-2 pelotas fecais, com um comprimento menos do que aquele da gaveta.
- Coloque a seção de tecido na fita, mantendo o tecido plano e destorcido. Sobreposição com uma segunda almofada de espuma e feche o. Coloque a fita em methacarn.
- Para que cada seção do intestino delgado seja amostrada, excise um segmento de 1 a 2 cm que contenha algum material digestivo.
- Coloque o segmento em uma fita histológica, mantendo o tecido plano e destorcido. Sobreposição com uma segunda almofada de espuma e feche o. Coloque a fita em methacarn.
- Para o estômago, cortar as conexões com o esôfago e intestino delgado. Coloque em uma fita, mantendo o tecido plano e destorcido. Sobreposição com uma segunda almofada de espuma e feche o. Coloque a fita em methacarn.
- Deixe as em solução de metacarn em RT por pelo menos 3 h e menos de 2 semanas.
Nota: Existem vários pontos durante os quais os segmentos de IG fixos podem ser transferidos para um serviço de histologia comercial. Estes tecidos podem ser difíceis de seção sem interrupção do conteúdo luminal, e os resultados ideais serão obtidos por um técnico experiente. Se o serviço comercial está disposto a realizar lavagens antes de incorporar os tecidos em parafina, as podem ser enviadas nesta fase, juntamente com instruções para o passo 2.16. - Comece a derreter cera de parafina suficiente para cobrir todas as de tecido em um copo grande em um forno de hibridização pré-aquecido de 70 °C.
- Após a fixação, retire as almofadas de espuma e devolva cada seção intacta do tecido de volta em sua gaveta. Lave os tecidos com as seguintes soluções no RT com agitação: duas vezes por 35 min em 100% metanol, duas vezes por 25 min em 100% de etanol, duas vezes por 20 min em xileno.
CUIDADO: Xileno é inflamável, tóxico, e pode causar danos se inalado. Use em uma capa química com proteção apropriada. Descarte de xileno através de procedimentos de resíduos perigosos. - Pat as seca em uma toalha de papel e coloque em cera de parafina pré-derretido por 2 h a 70 ° C em um forno de hibridização. Certifique-se de que as fitas estão cheias de parafina e não restam bolhas.
Nota: Esta etapa permite que a cera se infiltre no segmento gi e para estabilizar o tecido e o conteúdo. - Retire as fitas de cera, permitir que o excesso de cera para drenar, e armazenar em RT até que estejam incorporados em blocos de cera. Descarte a cera contendo vestígios de xilenos como resíduos perigosos.
Nota: O Noble Lab usa um serviço de histologia comercial para incorporar e secionar de tecidos. Para visualização padrão de leveduras e híteros c. albicans, 4 seções μm são usadas. Para avaliar a conectividade dos segmentos de hílgol, que normalmente se estendem por vários planos, 8 seções de μm podem ser usadas. Dependendo da capacidade das sondas FISH para penetrar no espécime, pode ser possível usar seções ainda mais espessas.
3. Validação de sondas recém-concebidas
Nota: O seguinte protocolo para validar sondas c. albicans foi adaptado de Swidsinski et al.17.
- Streak C. albicans SC5314 e espécies de comparação intimamente relacionadas (por exemplo, Candida dubliniensis, Candida tropicalis) a YEPD + 2% placas de ágar. Incubar por 1-2 dias a 30 °C.
- Inocular 5 mL de yepd líquido médio com uma única colônia.
- Pipeta 1 mL das células suspensas para um tubo de microcentrífuga e centrífuga a 3.000 x g por 5 min. Descarte supernatant.
- Resuspenda a pelota em 100 μL de soro soro para os soro e isológico amortecida pelo fosfato (PBS).
- Pipeta 5-10 μL de células resuspensas e local em um slide de vidro. Espalhe em um círculo maior e deixe secar.
Nota: Se as células não forem aderentes, use slides revestidos de poli-l-lisina. - Circule o ponto celular com caneta PAP e cubra com 50 μL de 2,5% de paraformaldeído (PFA) na PBS. Incubar em RT por 10 min.
CUIDADO: Pfa é inflamável e pode causar problemas de saúde se inalado ou em contato com a pele. Os itens contaminados com PFA devem ser descartados como resíduos perigosos. - Lave 3x com PBS. Toque líquido fora na toalha de papel e cubra com 100 μL de PBS. Repita duas vezes. Descarte a lavagem final.
-
Prepare slides para armazenamento de vários dias. Se realizar PEIXE no mesmo dia, prossiga para a etapa 3.9 sem as etapas nesta seção.
NOTA: É preferível realizar a hibridação imediatamente, mas se curto no tempo siga o passo 3.8 antes de armazenar. Os slides podem ser armazenados por vários dias a 4 °C.- Cubra o local com 60% de etanol. Incubar na RT por 3 min. Descarte a solução.
- Cubra o local com 80% de etanol. Incubar na RT por 3 min. Descarte a solução.
- Cubra o local com 100% de etanol. Incubar na RT por 3 min. Descarte a solução. Vá para o passo 3.9.
- Coloque os slides descobertos em um forno de hibridização a 50 °C por 1 h. Se o passo 3.8 foi seguido, armazenar os slides em 4 °C. Se não, proceder ao passo 4.2 para executar o protocolo de hibridização.
4. Peixe sstaining em tecidos do intervalo do GI
- Seções histológicas incorporadas à parafina de cera.
- Em um forno de hibridização, prewarm um frasco Coplin preenchido com xileno a 60 °C.
- Insira os slides no frasco cheio de xileno. Coloque a 60 °C por 10 min. Descarte a lavagem de xileno. Mantenha os slides no frasco e despeje o xileno em um recipiente de resíduos.
- Despeje xileno RT fresco no frasco e incubar a 60 °C por 10 min. Descarte a segunda lavagem de xileno.
- Encha o frasco com 100% de etanol e incubar em RT por 5 min. Retire os slides do frasco e ar seco.
- Defina o forno de hibridização para 50 °C para etapas na seção 4.2.
- Mancha C. albicans com a ponta de prova dos PEIXES.
- Prepare 1 mL de solução de hibridização fresca (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.1% sulfato dodcyl de sódio [SDS], 1% formamide em água livre de RNase). Veja a Tabela 1 para cálculos de amostras.
- Misture 50 μL de solução de hibridização com 1 μL de sonda C. albicans (5' Cy3- ACAGCAGAAGCCGTGCC 3'; 50 μg/mL em água livre de RNase) para uma quantidade final de sonda de 0,5 μg por slide.
Nota: Muitos ratos de raça laboratorial não contêm fungos entre suas microbiotas. Neste caso, é possível substituir uma sonda panfúngica (5' Cy3-CTCTCTCTCTTCACCCTATTC 3') que reconhece 23S rRNA da maioria das espécies fúngicas, não apenas c. albicans. Na experiência dos autores, a sonda panfúngica produz uma coloração mais brilhante do que a sonda c. albicans-específica. - Proteger a solução da luz e pré-morno a 50 °C.
- Usando uma caneta PAP, desenhar um círculo em torno da seção de tecido da seção 4.1.
- Pipete 50 μL de solução de hibridização contendo sonda para o tecido fixo e espalhou suavemente sobre a seção de tecido com uma ponta de pipeta. Sobreponha o líquido com um coverslip de hibridização certificando-se de evitar bolhas.
- Selar slides em uma câmara de hibridização à prova d'água e incubar as seções para 3 h a 50 °C no escuro em um forno de hibridização.
- Enquanto isso, prepare 50 mL de solução de lavagem de PEIXE (20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.9 M NaCl em água livre de RNase). Veja a Tabela 1 para cálculos de amostras.
- Mova a solução de lavagem para 50 °C para pré-aquecer.
- Após 3 h, adicione a solução de lavagem a um frasco de Coplin. Em seguida, retire cuidadosamente o coverslip do slide com fórceps e coloque o slide na solução de lavagem.
- Cubra o frasco com papel alumínio e incubada a 50 °C por 20 min.
- Durante esta incubação, prepare a solução de coloração mucin-nuclei (20 ng/mL 4′,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI], 1,6 μg/mL fluorescein isothiociaanate [FITC]-lectina na PBS). Veja a Tabela 1 para cálculos de amostras. Para o estômago e intestinogrosso, use FITC-Ulex europaeus agglutinina 1 (UEA-1). Para intestinos delgados e cécum, use uma combinação de FITC-UEA-1 e FITC-trigo germinina (WGA).
Nota: Lectinas de diferentes espécies reconhecem diferentes modificações de açúcar de glicoproteínas, como a mucina. As combinações de lectina recomendadas aqui foram determinadas empiricamente para coloração ideal de muco em diferentes compartimentos gi. - Lave os slides derramando fora da solução de lavagem peixe e reencher o frasco com RT PBS. Despeje fora do PBS imediatamente e reabastecer com PBS. Despeje fora do PBS para um total de 2 laves.
- Wick afastado o PBS com um tecido delicado limpador de tarefas e circunda a seção de tecido intestinal com uma caneta PAP. Coloque os slides em um recipiente de plástico opaco e adicione 50 μL de mucin-nuclei solução de coloração para a seção de tecido. Cubra o recipiente com papel alumínio para proteger da luz. Incubar a 4 °C por 45 min.
- Coloque os slides em um frasco Coplin e lave rapidamente duas vezes na PBS em RT.
- Toque afastado o PBS adicional em uma toalha de papel, e pavio então afastado as gotas finais de PBS com um tecido.
- Coloque uma gota de montagem média em cada seção e sobreposição com um coverslip de vidro, evitando bolhas. Deixe o meio de montagem espalhar todo o deslizamento de cobertura. Para imagens imediatas, ancorar o coverslip no lugar com esmalte nos cantos. Para armazenamento a longo prazo, selar em torno do coverslip com esmalte.
- Imagem dos slides usando um microscópio fluorescente.
Representative Results
Seguindo as instruções fornecidas, o resultado desta técnica será a rotulagem fluorescente dos núcleos no epitélio hospedeiro, muco e c. albicans em tecidos gastrointestinados seccionados. As células abicans candida do tipo selvagem devem aparecer como células de levedura redondas e unicelulares ou células de levedura altamente alongadas, às vezes ramificadas, de hídinas multicelulares (divisões célula-célula não será aparente na pasta). Mutantes de C. albicans podem adicionalmente aparecer como leveduras "cinzentas" menores, ligeiramente alongadas ou tão maiores, ligeiramente alongadas "GUT" (transição induzida por gastrointestinais) ou leveduras "opacas".
Figura 1 retrata a agulha de alimentação usada para gavage oral, bem como posições-chave da agulha durante o procedimento gavage. A figura 2 fornece uma configuração típica usada para a dissecação do órgão e a aparência de segmentos do GI do rato.
A figura 3 exibe coloração de PEIXE de diferentes tipos de células c. albicans após propagação in vitro e dentro do modelo do mouse. A Figura 3A mostra fluorescência e imagens de fase de pasta fixa, permeabilizada e propagada in vitro. A formação de hídvais foi induzida com o líquido de Lee médio18 com 2% N-acetilglucosamina, pH 6,8 a 37 °C. A Figura 3B mostra fluorescência e imagens de fase de células de levedura fixas, permeabilizadas e in vitro. A Figura 3C,D mostra células INTESTInais fixas, permeabilizadas, in vitro e células opacas, respectivamente. Intestino e tipos de células opacas são morfologicamente indistinguíveis, exceto quando visualizados pela microscopia eletrônica de varredura. Por favor, note que a coloração de peixede células in vitro propagadas será subótima se as células não estiverem bem permeabilizadas. Um exemplo de coloração fraca e difusa é mostrado na Figura 3C. Para obter melhores resultados, as condições de fixação celular e permeabilização devem ser determinadas empiricamente para que cada tipo de célula e espécie seja investigada. Felizmente, o protocolo recomendado para visualizar c. albicans em tecidos seccionados produz permeabilização mais consistente.
Figura 3E-G retratam C. albicans em intestinos grossos do rato, manchados com o C. albicans-sonda específica(Figura 3E)ou a sonda panfúngica(Figura 3F,G). C. albicans aparece vermelho nestas imagens, os núcleos da pilha do anfitrião são azuis, e a camada do muco é verde. Tanto as leveduras redondas quanto a pasta altamente alongada (pontas de flechas brancas) ocorrem no intestino grosso. Por favor, note que a coloração é mais brilhante com a sonda panfúngica. Figura 3G retrata um mutante ume6 no mesmo compartimento, manchado com a sonda panfúngica. Ume6 codifica um fator de transcrição que é necessário para a formação de hídvais em condições in vitro19 . Curiosamente, o fenótipo de fermento bloqueado exibido por este mutante em condições in vitro não é recapitulado dentro do intestino, sugerindo que um fator redundante deve ser ativado dentro do host12. Figura 4 retrata a aparência do tipo selvagem C. albicans em diferentes segmentos do trato gastrointestinal murine, incluindo as regiões imediatamente adjacentes à mucosa hospedeiro e regiões mais centrais do intestino lumen.
Figura 1: Principais posições de agulha de alimentação durante gavage. (A)Agulha de alimentação. (B)Alimentação agulha bola inserida para o lado da língua. (C)Agulha de alimentação na posição vertical com inserção no esôfago. (D)Agulha de alimentação inserida no estômago com alguns milímetros visíveis acima do nariz. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Exemplo layout de dissecação. (A)Bloco de dissecação e ferramentas. (B) Trato GI extiruque. Proximal (esôfago) para seções distal (ânus): I. Estômago. II. Intestinos delgados proximal. III. Intestinos delgados mediais. Intestinos delgados distal. V. Cecum. VI. Intestino grosso. As caixas de beira tracejadas cor-de-rosa indicam os tecidos a ser reparados. (C)Tecidos posicionados em. Algarismos romanos são os mesmos que no painel B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de C. albicans manchadosdePEIXE. (A)PEIXE de C. albicans hyphae cultivados na mídia líquida de Lee18 com 2% n-acetilglucosamina, pH 6.8. (B) PEIXE de C. albicans células de levedura redondas cultivadas em YEPD + 2% placas de ágar. (C)PEIXE de C. albicans células GUT (ySN1045) cultivadas em Placas De YEPD + 2% ágar. (D)PEIXE de C. albicans células opacas cultivadas em YEPD + 2% placas de ágar. (E)Wild tipo C. albicans (ySN250) no intestino grosso, manchado com o C. albicans-sonda específica. (F)Wild tipo C. albicans no intestino grosso, manchado com a sonda panfúngica. (G) Ume6 mutante (ySN1479) no intestino grosso, manchado com a sonda panfúngica: vermelho é C. albicans,azul é núcleos epiteliais hospedeiros, e verde é mucin. As pontas das flechas indicam hifa. Flechas indicam levedura. Barras de escala = 20 μm. Imagens F e G são adaptadas de Witchley et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Aparência de C. albicans FISH-manchados em compartimentos diferentes do intestino. O tipo selvagem C. albicans é mostrado nos segmentos indicados do trato do GI do rato. Dentro de cada compartimento, as imagens retratam a área adjacente à mucosa hospedeira e à região central do intestino. A coloração foi executada com a ponta de prova panfungal. Barra de escala = 20 μm. As imagens são adaptadas de Witchley et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Estoques de antibióticos (200x) | |||
| Penicilina G | 181 mg/mL | ||
| Estreptomicina | 400 mg/μL | ||
| Methacarn Methacarn | |||
| Estoque | Concentração final | Volume | Unidades |
| Metanol | 60% | 300 | Ml |
| Clorofórmio | 30% | 150 | Ml |
| Ácido acético glacial | 10% | 50 | Ml |
| Solução de hibridização | |||
| Estoque | Concentração final | Volume | Unidades |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 20 | Μl |
| 5 M Nacl (M) | 0,9 m | 180 | Μl |
| 10% SDS | 0.10% | 10 | Μl |
| 100% formamida | 1.00% | 10 | μL (mantido em pequenos alíquos a -20 °C entre os usos) |
| Água livre de RNase | 780 | Μl | |
| Solução de lavagem de PEIXES | |||
| 1 M Tris-HCl, pH 7.4 | 20 mM | 1 | Ml |
| 5 M Nacl (M) | 0,9 m | 9 | Ml |
| Água livre de RNase | 40 | Ml | |
| Solução de coloração mucin-núcleos | |||
| DAPI, 10 μg/mL | 20 ng/mL 20 ng/mL | 2 | Μl |
| lectina, 40 μg/mL | 1,6 μg/mL | 40 | Μl |
| PBS, pH 7.4 PBS, pH 7,4 | 958 | Μl | |
Tabela 1: Volumes típicos e concentrações de soluções utilizadas neste protocolo.
Discussion
O método descrito aqui permite a visualização de c. albicans leveduras e híteros nos tratos GI de camundongos colonizados commensally de qualquer sexo ou tensão. A sonda FISH hibridiza para 23S rRNA, que é distribuído por todo o citoplasma fúngico. Nosso método foi adaptado de um protocolo previamente relatado para visualizar as bactérias do intestino20. Como os c. albicans alteram sua morfologia dentro do hospedeiro, o método é útil para monitorar a forma das células fúngicas, bem como a localização. Por exemplo, usamos este método para refutar a hipótese de que as leveduras predominam em todo o trato digestivo, e para expor discrepâncias entre os fenótipos in vivo e in vitro de certos mutantes "defeituosos de filamento"12.
Existem vários modelos de camundongos para a colonização c. albicans commensal. A microbiota de camundongos e humanos de laboratório é distinta e, em camundongos, o uso de antibióticos ou uma dieta especializada é necessário para estabelecer a colonização estável. O tratamento com antibióticos também melhora a colonização de seres humanos em C. albicans e é um importante fator de risco para a doença10disseminada. Os antibióticos utilizados neste estudo são relativamente baratos e produzem diminuições confiáveis na microbiota bacteriana. Note-se que os antibióticos são usados para diminuir a carga de espécies bacterianas antagônicas, não para eliminar todas as bactérias dos animais. Se os pesquisadores desejam estudar c. albicans-host interações na ausência de bactérias ou para evitar o uso de antibióticos ou uma dieta especial, animais livres de germes podem ser substituídos por animais criados convencionalmente; no entanto, camundongos gnotobióticos exibem certas anormalidades imunes e anatômicas e, portanto, podem não ser adequados para todos os fins.
Várias etapas são importantes para a coloração bem sucedida de PEIXES: O método de fixação recomendado é fundamental para preservar a integridade estrutural dos tecidos GI, particularmente o conteúdo frágil do lúmen do intestino, como a camada de muco e o tridimensional organização de fungos e bactérias16. Por favor, note que muitas soluções de fixação comumente usadas que contêm água são altamente prejudiciais para a arquitetura luminal. Os fixativos e soluções para lavandes pós-fixação recomendados neste protocolo não contêm água, e é importante evitar a contaminação com água. Outro passo crítico é o passo de hibridização, onde é importante evitar a evaporação da solução de hibridização durante a incubação de slides no forno de hibridização. Sugerimos colocar os slides em um recipiente à prova d'água para evitar esse problema. Alternativamente, pode-se usar câmaras de hibridização estanques, como as originalmente usadas para hibridização de microarrays.
Uma sonda DE PEIXEs específica c. albicansé descrita nesteprotocolo. No entanto, como muitos camundongos criados em laboratório não contêm c. albicans ou outros fungos como parte de sua microbiota intestinal natural, uma sonda panfúngica pode especificamente manchar c. albicans em animais experimentalmente colonizados. A substituição de uma sonda panfúngica pode ser desejável devido às suas características superiores de hibridação e maior proporção de sinal/ruído. Se a sonda panfúngica é usada como uma sonda pseudoespecífica para C. albicans,é importante documentar a falta de coloração em animais não infectados (ou seja, tratados com antibióticos, mas não c. albicans). A coloração de um animal de controle não colonizado também é útil para avaliar a coloração de fundo que pode resultar da adesão de sondas DE PEIXE a partículas alimentares. No geral, o uso de sondas FISH oferece maior especificidade sobre a maioria dos outros métodos de coloração de fungos, como o branco Calcofluor (que mancha a quitina, um componente de parede celular que pode variar entre tipos de células), GMS ou anticorpos antifúngicos comercialmente disponíveis. Além disso, a coloração de PEIXEs permite a costaining de organismos múltiplos usando sondas FISH diferencialmente rotuladas para rRNAs específicos de espécies.
Uma ressalva desta técnica é que certos tipos de células de levedura c. albicans parecem muito semelhantes por PEIXE (por exemplo, os tipos opacos e de células GUT). Para distinguir entre esses tipos de células, seria útil desenvolver sondas de hibridização para mRNAs fúngicos específicos do tipo celular. No entanto, em sua forma atual, a técnica FISH já revelou discrepâncias surpreendentes entre os comportamentos in vivo e in vitro dos mutantes de C. albicans avaliados em ambas as condições12,indicando interações complexas no ambiente natural comensal que não são adequadamente imitados por ensaios in vitro existentes. Mais estudos de diferentes manchas de C. albicans em tipos selvagens adicionais e hospedeiros mutantes provavelmente produzirão insights adicionais sobre interações fúngicas-hospedeiros. Em particular, será instrutivo para o perfil C. albicans em modelos de doença inflamatória intestinal, que está associado com alto titers de C. albicans em seres humanos21, e outros modelos de C. albicans crescimento excessivo e doença. A técnica fish também pode ser combinada com imunohistoquímica para manchar células hospedeiras específicas. No geral, o método apresentado aqui fornece um meio razoavelmente rápido e confiável para determinar a localização e morfologia de C. albicans dentro do trato gastrointestinal de mamíferos.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer carolina Tropini, Katharine Ng, Justin Sonnenburg, e KC Huang para a orientação em desenvolver a técnica do PEIXE. Teresa O'Meara forneceu comentários úteis sobre o manuscrito, e Miriam Levy ajudou com a fotografia. Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede R01AI108992, R01DK113788, e um Burroughs Welcome Award na Patogênese de Doenças Infecciosas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | can be substituted from any vendor |
| BHI blood agar | can be substituted from any vendor | ||
| C. albicans FISH probe | IDT DNA Technologies | custom order | |
| Chamber for hybridization incubation | watertight chamber meant to reduce evaporation | ||
| Chloroform | Sigma | C2432 | >=99.5% |
| DAPI | Roche | 10236276001 | can be substituted from any vendor |
| Delicate task wiper tissues | Kimberley-Clark | 34256CT | Kimwipes |
| D-glucose | Sigma | G7021-5KG | can be substituted from any vendor |
| Ethanol | Sigma | E7023 | molecular biology grade |
| Feeding needles | Cadence, Inc. | 7910 | metal; 20 X1-1/2" W/2-1/4; can be autoclaved to sterilize |
| FITC-UEA-1 | Sigma | L9006-1MG | other fluorophores available |
| FITC-WGA | Sigma | L4895-2MG | other fluorophores available |
| Foam pads | Fisher | 22038221 | Order foam pads that will fit within cassettes |
| Formamide | Sigma | 47671 | molecular biology grade |
| Glacial acetic acid | Macron Fine Chemicals | MK881746 | ACS reagent, >=99.5% |
| Glass Coplin jar | Fisher | 08-815 | hold up to 10 slides back to back |
| Histology cassettes | Simport | M512 | Deep cassettes so cecum is not squished |
| Hybridization coverslips | Sigma | GBL712222 | RNase-free |
| Hybridization oven | can be substituted from any vendor | ||
| LB | can be substituted from any vendor | ||
| Lee's media | prepared as described in Lee et al. 1975 | ||
| Methanol | Sigma | 179337 | ACS reagent, >=99.8% |
| Mice | Charles River Laboratories | 028 | adult BALB/c; 18-21 grams (8-10 weeks) |
| Paraformaldehyde | Fisher | 50-980-487 | 16% solution |
| Parrafin wax | Sigma | P3558-1KG | Paraplast for tissue embedding |
| PBS, pH 7.4 | UCSF Cell Culture Facility Media Production Unit | CCFAL003 | calcium, magnesium-free; can be substituted from any vendor |
| Penicillin G | Sigma | PENNA-100MU | |
| Sabouraud dextrose agar | can be substituted from any vendor | ||
| Saline | Baxter | 2F7123 | sterile, can be substituted from any vendor |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S3014 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Streptomycin | Sigma | S9137-100G | |
| Super PAP pen | Life Technologies | 8899 | can be substituted from any vendor |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | can be substituted from any vendor; maintain RNase-free |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | does not contain DAPI |
| Xylenes | Sigma | 214736 | reagent grade |
| YEPD | can be substituted from any vendor |
References
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Bacher, P., et al. Human Anti-fungal Th17 Immunity and Pathology Rely on Cross-Reactivity against Candida albicans. Cell. 176 (6), 1340-1355 (2019).
- Shao, T. Y., et al. Commensal Candida albicans Positively Calibrates Systemic Th17 Immunological Responses. Cell Host and Microbe. 25 (3), 404-417 (2019).
- Jiang, T. T., et al. Commensal Fungi Recapitulate the Protective Benefits of Intestinal Bacteria. Cell Host and Microbe. 22 (6), 809-816 (2017).
- Iliev, I. D., et al. Interactions Between Commensal Fungi and the C-Type Lectin Receptor Dectin-1 Influence Colitis. Science. 336 (6086), 1314-1317 (2012).
- Fan, D., et al. Activation of HIF-1 alpha and LL-37 by Commensal Bacteria Inhibits Candida Albicans Colonization. Nature Medicine. 21 (7), 808-814 (2015).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal Damage and Neutropenia Are Required for Candida Albicans Dissemination. PLoS Pathogens. 4 (2), e35 (2008).
- Yamaguchi, N., et al. Gastric Colonization of Candida Albicans Differs in Mice Fed Commercial and Purified Diets. Journal of Nutrition. 135 (1), 109-115 (2005).
- Kadosh, D., et al. Effect of Antifungal Treatment in a Diet-Based Murine Model of Disseminated Candidiasis Acquired via the Gastrointestinal Tract. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6703-6708 (2016).
- Perlroth, J., Choi, B., Spellberg, B. Nosocomial Fungal Infections: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment. Medical Mycology. 45 (4), 321-346 (2007).
- Pande, K., Chen, C., Noble, S. M. Passage Through the Mammalian Gut Triggers a Phenotypic Switch That Promotes Candida Albicans Commensalism. Nature Genetics. 45 (9), 1088-1091 (2013).
- Witchley, J. N., et al. Candida Albicans Morphogenesis Programs Control the Balance between Gut Commensalism and Invasive Infection. Cell Host and Microbe. 25 (3), 432-443 (2019).
- Noble, S. M., Gianetti, B. A., Witchley, J. N. Candida Albicans Cell-Type Switching and Functional Plasticity in the Mammalian Host. Nature Reviews in Microbiology. 15 (2), 96-108 (2017).
- Balish, E., Filutowicz, H., Oberley, T. D. Correlates of Cell-Mediated Immunity in Candida Albicans-Colonized Gnotobiotic Mice. Infection and Immunity. 58 (1), 107-113 (1990).
- Guarner, J., Brandt, M. E. Histopathologic Diagnosis of Fungal Infections in the 21st Century. Clinical Microbiology Reviews. 24 (2), (2011).
- Johansson, M. E., Hansson, G. C. Preservation of Mucus in Histological Sections, Immunostaining of Mucins in Fixed Tissue, and Localization of Bacteria with FISH. Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).
- Swidsinski, A., Weber, J., Loening-Baucke, V., Hale, L. P., Lochs, H. Spatial Organization and Composition of the Mucosal Flora in Patients with Inflammatory Bowel Disease. Journal of Clinical Microbiology. 43 (7), 3380-3389 (2005).
- Lee, K. L., Buckley, H. R., Campbell, C. C. An Amino Acid Liquid Synthetic Medium for the Development of Mycelial and Yeast Forms of Candida Albicans. Sabouraudia. 13 (2), 148-153 (1975).
- Banerjee, M., et al. UME6, a Novel Filament-Specific Regulator of Candida Albicans Hyphal Extension and Virulence. Molecular Biology of the Cell. 19 (4), 1354-1365 (2008).
- Earle, K. A., et al. Quantitative Imaging of Gut Microbiota Spatial Organization. Cell Host and Microbe. 18 (4), 478-488 (2015).
- Sokol, H., et al. Fungal Microbiota Dysbiosis in IBD. Gut. 66 (6), 1039-1048 (2017).
