Summary
Her præsenterer vi en protokol med hvilken præ-og/eller postsynaptisk calcium kan visualiseres i forbindelse med Drosophila læring og hukommelse. In vivo calcium Imaging ved hjælp af synaptisk lokaliseret calcium sensorer kombineres med en klassisk olfaktoriske conditioning paradigme, således at den synaptiske plasticitet underliggende denne type associative læring kan bestemmes.
Abstract
Årtier af forskning i mange model organismer har ført til den nuværende opfattelse af synaptisk plasticitet underliggende læring og hukommelse dannelse. Lærings-induceret ændringer i synaptisk transmission er ofte fordelt på tværs af mange neuroner og niveauer af behandling i hjernen. Derfor er der behov for metoder til at visualisere indlærings afhængig synaptisk plasticitet på tværs af neuroner. Frugtflue Drosophila melanogaster repræsenterer en særlig gunstig model organisme til at studere neuronal kredsløb underliggende læring. Den protokol, der præsenteres her, viser en måde, hvorpå de processer, der ligger til grund for dannelsen af associative olfaktoriske Memories, nemlig synaptisk aktivitet og deres ændringer, kan overvåges in vivo. Ved hjælp af den brede vifte af genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, er det muligt specifikt at udtrykke genetisk kodet calcium indikatorer i bestemte cellepopulationer og endda enkeltceller. Ved at fastsætte en flue på plads, og åbne hovedet kapsel, er det muligt at visualisere calcium dynamik i disse celler samtidig levere olfaktoriske stimuli. Derudover demonstrerer vi en opsætning, hvor flue kan udsættes for elektrisk stød på kroppen samtidig. Dette giver et system, hvor fluer kan gennemgå klassisk olfaktoriske conditioning-hvorved en tidligere naiv lugt er lært at være forbundet med elektrisk chok straf-på samme tid som repræsentationen af denne lugt (og andre utrænede lugte) er observeret i hjernen via to-foton mikroskopi. Vores laboratorium har tidligere rapporteret om generering af synaptisk lokaliserede calcium sensorer, som gør det muligt at begrænse de fluorescerende calcium signaler til præ-eller postsynaptiske rum. To-foton mikroskopi giver en måde at spatialt løse fine strukturer. Vi eksemplificere dette ved at fokusere på neuroner integrerer information fra champignon kroppen, en højere orden Center af insektet hjernen. Samlet, denne protokol giver en metode til at undersøge de synaptiske forbindelser mellem neuroner, hvis aktivitet er moduleret som følge af olfaktoriske Learning.
Introduction
Dechifrere hvor og hvordan oplysningerne er erhvervet i hjernen gennem læring og efterfølgende lagret som hukommelse udgør en af de mest udfordrende opgaver i neurovidenskab1. Neurovidenskabelig forskning har ført til begrebet en ændring i synaptisk transmission som neuronal substrat, der ligger til grund for indlæring og hukommelse dannelse2,3. Det er en hypotese, at under læring, synaptiske forbindelser mellem neuronal ensembler, der er aktive under opfattelsen af en stimulus bliver modificeret sådan, at deres kombinerede aktivitetsmønster kan hentes under hukommelsen tilbagekaldelse, og dermed instruerede fremtidig adfærdsmæssig handling4. Disse "engram celler" og deres synapser er ofte fordelt på tværs af hjernen regioner og niveauer af behandling, hvilket gør det vanskeligt at tildele observerede ændringer i synaptisk transmission til indlæring af en opgave eller en stimulus. At lokalisere og visualisere de synaptiske ændringer, der er kausalt knyttet til en bestemt lærings opgave man har brug for en passende model system, der giver mulighed for præcist at begrænse disse synapser.
For en sådan bestræbelse, Drosophila melanogaster er særligt velegnet, fordi det kombinerer relativ hjernens enkelhed, adfærdsmæssige rigdom, og eksperimentel tilgængelighed. Blandt de veletablerede model organismer, Drosophila er beliggende mellem fyrretræsnematoden C. elegans og genetisk Tractable pattedyr som mus i form af neuronal kompleksitet. Det stereotypiske antal af neuroner (~ 300) og begrænset adfærdsmæssige repertoire er observeret i C. elegans. Pattedyr, på den anden side, har millioner af neuroner og svimlende adfærdsmæssige kompleksitet. Hjernen af frugtflue er, med sin ~ 100.000, neuroner betydeligt mindre end hjernen hos de fleste hvirveldyr, og mange af neuronerne er individuelt identificerbare5. Endnu, Drosophila demonstrere et bredt spektrum af komplekse adfærd, herunder en evne til at udvise robust associative olfaktoriske læring og hukommelse dannelse, først beskrevet over 40 år siden6. I løbet af denne klassiske konditionerings procedure, er grupper af fluer udsat for en lugt som den konditionerede stimulus (CS+), mens de modtager en straffe elektrisk chok som den ukonditionerede STIMULUS (US). En anden lugt (CS-) er derefter præsenteret uden nogen straf. Derved lærer dyrene at undgå lugt i forbindelse med straffen, som kan testes i en efterfølgende valgsituation mellem de to lugte, CS+ og cs-. Arbejde på dissekere neuronal substrat underliggende denne adfærd i Drosophila har identificeret champignon organer (MB) som det primære sted for "engram"7,8,9,10 og derfor er kredsløbet af denne hjerneregion var og er genstand for intens forskning for at afdække den logik, hvormed en hukommelse engram er erhvervet og opbevaret (for nylig revideret i11,12).
Drosophila MB består af ~ 2.000 iboende neuroner (Kenyon celler) pr. halvkugle, organiseret i parallelle axonal projektioner13. Axoner af olfaktoriske projektion neuroner udvides til den laterale protocerebra og til MB calyces, den vigtigste dendritiske input site af MB og modtage olfaktoriske input fra antennal lobes. Den lange, parallelle axoner bundt af Kenyon celler udgør pedonkel og lobes. De fleste Kenyon celler bifurcate danner horisontale β/β'-lapper ved at udvide en sikkerhedsstillelse mod midterlinjen af hjernen, og den lodrette α/α'-lapper ved at forlænge anden sikkerhedsstillelse projicering i rygnings-forreste retning. Den anden gruppe af Kenyon celler danner den horisontale γ-lobes13 af MB, hvor læringsprocessen og efterfølgende korttidshukommelse dannelse kunne være lokaliseret10. MB lapper modtage afferent input og give efferent output, som begge er typisk begrænset til særskilte opdelte sub-regioner langs Kenyon Cell axoner14,15,16. Især, afferent dopaminerge MB input neuroner har vist sig at mægle værdi-baserede, f. eks, straffende, forstærkende effekter i associative olfaktoriske Learning15,17. Stereotypiske og individuelt identificerbare efferent MB output neuroner fra champignon kroppen lapper integrere oplysninger på tværs af et stort antal Kenyon celler, målrette forskellige hjerneområder og bære adfærd-lærerige appetitive eller aversive oplysninger15 . Denne neuronal arkitektur har ført til et koncept for organiseringen af associative engram. Lugte er relativt præcist kodet af tyndt aktiverede ensembler af Kenyon celler. Den coinci Dent aktivitet af disse Kenyon Cell ensembler og frigivelse af dopamin-fremkaldt ved at straffe stimuli-modulerer transmission fra Kenyon Cell presynapses på MB output neuroner sådan, at dyrene efterfølgende vil undgå denne særlige lugt10 ,12. Vi bruger denne ret præcist definerede og lokaliseret engram som et paradigmatisk tilfælde til at illustrere, hvordan disse indlærings afhængige ændringer i synaptisk aktivitet kan bestemmes og overvåges.
Værdien af Drosophila som model system er stærkt afhængig af den uovertrufne genetiske værktøjskasse, der gør det muligt at udtrykke transgener til identificering, overvågning og styring af enkelt neuroner i komplekse kredsløb18. Fremkomsten af teknikker til neuronal aktivitet overvågning-såsom calcium Imaging, diskuteret her-har tilladt til bestemmelse af neuronal aktivitet mønstre som reaktion på en specifik stimulus. Ved at kombinere specifikke Gal4-drevet udtryk af genetisk kodede calcium indikatorer (gecis) med olfaktoriske stimulation, kan man visualisere lugt-fremkaldte calcium dynamik af neuroner af interesse19. I denne protokol, er det vist, at ved yderligere at koble denne teknik med en klassisk konditionering paradigme, er det muligt at undersøge disse olfaktoriske svar i forbindelse med læring. Lærings induceret plasticitet kan yderligere dissekteres ved hjælp af GECIs, der ikke kun er lokaliseret til en enkelt specifik Neuron, men også til specifikke underafdelinger af en neuron. Pech et al.20 etableret et udvalg af værktøjer, der tillader netop dette. Ved at målrette GCaMP321 til enten præ-eller postsynapse-via-forbindelsen til hvirveldyr Synaptophysin eller dHomer, henholdsvis20-differentialmodulering af disse steder kan skelnes. Denne lokalisering giver i denne sammenhæng en fordel i forhold til de fleste GECIs, der allestedsnærværende er til stede i hele cytosol-fx GCaMP22, GCaMP321, eller GCaMP623 -fordi det betyder, at præ-og postsynaptiske transienter kan være adskiller sig fra den samlede integrerede calcium tilstrømning, der opstår som følge af neuron aktivering. Dette kan give fingerpeg om placeringen og typer af plasticitet, der opstår som følge af eller at forårsage indlæring og hukommelse dannelse. Som et eksempel, den protokol, der er angivet her viser værdien af dette værktøj i decifrere graduering af MB output neuroner under olfaktoriske associative Learning ved at målrette ekspression af calcium sensor til kun postsynapse. Ved at overvåge, inden for en individuel flyve, lugt-fremkaldt aktivitet før og efter olfaktoriske conditioning en direkte sammenligning kan trækkes mellem en naiv lugt respons og en lært lugt respons. Mens fast i samme billed kammer, fluer er udsat for et udvalg af lugte. Derefter, de modtager en aversive associative conditioning protokol, hvor en af disse lugte er parret med elektrisk stød (at blive CS+) og en anden lugt er præsenteret uden forstærkning (bliver cs-). Endelig er fluerne igen udsat for de samme lugte som i det første trin. Calcium dynamik observeres ved hjælp af to-foton mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transgene frugt fluer, Drosophila melanogaster
- Cross kvindelig jomfru og mandlig fluer (hævet ved 25 ° c i 60% relativ fugtighed på en 12 h lys/mørk cyklus) transporterer den ønskede Gal4 og UAS Konstruer25, henholdsvis at producere fluer, hvor specifikke neuroner af interesse udtrykke en genetisk kodet calcium indikator.
- Alder den kvindelige afkom af ovenstående Kors, indtil de er i intervallet 3-6 dage post-eclosion. Kvindelige fluer er at foretrække på grund af deres lidt større størrelse.
2. fremstilling af frugtflue til in vivo calcium Imaging
- Vælg en enkelt kvindelig flue og anæstetize på is i ikke længere end 5 min.
- Brug fine pincet til at placere flue i billed kammeret (vist i figur 1c). Sørg for, at brystkassen og benene er i kontakt med de elektriske ledninger i bunden af kammeret, og at hovedet er fladt. Fastgør positionen af flue ved hjælp af klare tape.
Bemærk: denne protokol kræver en specialbygget kammer, hvor fluerne er faste, med hoved kapsel tilgængelig for åbning, og fluerne i stand til at modtage både lugt stimuleringer til antennerne og elektriske stød til brystkassen og benene (figur 1). - Ved hjælp af en kirurgisk skalpel klinge fastgjort til skalpel håndtaget (Se tabel over materialer), skæres et vindue i båndet omkring hovedet af flue, forlader antennerne dækket og kun den forreste-mest del af thorax eksponeret.
- Surround siderne og bagsiden af hovedet med blålys hærdende lim, omhyggeligt manipuleret ved hjælp af en insekt stift holdt af konkave-konvekse kæber. Indstil limen ved hjælp af en blå lysemitterende LED-lampe.
- Kontroller, at limen er helt indstillet, og Ryd eventuel resterende uhærdet lim fra flyve hovedets dorsale overflade.
- Påfør en dråbe Ringer's Solution24 (Se tabel over materialer) til at dække den udsatte neglebånd af hovedet.
- Ved hjælp af en meget fin-bladed stikke kniv, skåret gennem neglebånd. For at den mest effektive fjernelse af neglebånd, først skæres over posterior af hovedet ved hjælp af ocelli som udgangspunkt. Derefter skæres hver side, mediale til øjnene, at danne en flap af neglebånd, der let kan rives af ved hjælp af pincet.
- Fjern enhver overskydende neglebånd, der kan blokere hjernen region af interesse.
- Fjern forsigtigt den dorsale overflade af enhver luftrør ved hjælp af fine pincet, undgå afbrydelse af hjernens væv selv. Fjern og Genopfrisk Ringer's Solution24 (Se tabel over materialer) efter behov for at rydde området af vævs rester.
- Placer den hypodermiske lugt i position, ca. 1 cm fra spidsen af flue. Sørg for, at der ikke er noget, der kan hindre lugt levering til antennerne.
- Ved mikroskopet tilsluttes billed kammeret til lugt-leveringssystemet via den hypodermiske lugt.
- For at give flyve til fuldt ud at inddrive fra anæstesi og kirurgi, og til at tilpasse sig luftstrømmen, gennemføre en 10 min hvileperiode på dette stadium.
3. in vivo calcium Imaging
- Brug et multifoton mikroskop udstyret med en infrarød laser og et vandnedsænknings formål (Se tabel over materialer), der er installeret på et vibrations isoleret bord. For visualisering af GFP-baserede calcium indikatorer, tune laseren til en excitation bølgelængde på 920 nm og installere en GFP band-pass filter.
- Ved hjælp af den grove Z justeringsknap, scanne gennem Z-aksen af hjernen og lokalisere hjernen regionen af interesse. Brug funktionen Beskær til kun at fokusere scanning på dette område for at minimere scanningstiden og for at rotere scanningsvisningen, så den forreste af hovedet vender nedad.
- Juster rammestørrelsen til 512 x 512 px, scanningshastigheden til > 4 Hz og scanningsområdet (i Y-dimensionen), så de neuroner, der er af interesse, dækkes.
4. visualisering af lugt-fremkaldte calcium transienter gennem olfaktoriske conditioning
- Brug en lugt Delivery System19,26 der kan levere flere lugt stimuli på en timeligt præcis måde.
- Brug en ekstra computer til at styreenheden, og til at kommunikere med Imaging mikroskop software til at koordinere lugt stimuleringer med billedoptagelse under eksperimenter.
- Start en forprogrammeret makro pakke, der er i stand til at forbinde billed anskaffelsesoftwaren og lugt-leveringsprogrammet (f. eks. en VBA-makro pakke, som er installeret i mikroskop Control-softwaren, se tabel over materialer), som reagerer på en ekstern indgang udløses ved initiering af en lugt-leverings protokol i et separat program).
- Start målingen ved at overvåge "pre-Training"/naiv lugt-fremkaldte calcium transienter ved en opløsning på 512 x 512 px og en frame rate på 4 Hz. levere en 2,5 s lugt stimulus flankeret af yderligere billede erhvervelse for 6,25 s forudgående lugt debut (for at etablere en F 0 oprindelig værdi) og 12,5 s efter lugt forskydning. Gentag dette med en anden odoranten og derefter med en tredje lugt.
- Fortsæt 3 min efter denne måling med klassisk konditionering ("træning") flue.
- Vælg en af de lugte, der præsenteres i fasen "pre-Training", for at blive cs+ lugt og en anden for at blive cs- lugt. Præsenter cs+ lugt ved hjælp af det computerstyrede lugt-Levér system til 60 s ved siden af 12 90 V elektriske stød.
- Efter en 60 s pause, præsentere cs- lugt alene for 60 s. brug som odoranter 4-methylcyclohexanol og 3-octanol. Du må ikke præsentere den tredje lugt (f. eks. 1-octen-3-OL) under denne træning, da den kun anvendes som kontrol før (trin 4,2.) og efter (trin 4,4) Trænings fasen.
- Mål "efteruddannelse" lugt-fremkaldte calcium transienter igen ved at gentage "pre-Training" lugt stimulation protokol (trin 4,2.) 3 min efter endt træning fase (trin 4,3).
Bemærk: tidspunktet for dette trin bør afspejle den tid af interesse efter hukommelse dannelse (f. eks udføre dette trin 3-4 min efter konditionering skridt til at undersøge korttidshukommelsen). Typisk, fluer kan overleve i flere timer i denne forberedelse. - Gem billedfiler i et passende format (f. eks. TIFF) til senere billedanalyse.
5. billedanalyse
- At analysere billeder, åbne TIFF (eller lignende) filer i billedanalyse software såsom Fiji27.
- Juster stablerne ved hjælp af en algoritme til bevægelses korrektion for at sikre minimal bevægelse i X-og Y-retningen. Kassér alle optagelser, der viser stærk bevægelse i Z-aksen.
- Vælg værktøjet til den software, der bruges til at markere et interesseområde (ROI) omkring det område, der skal undersøges. Dette bør være så præcist som muligt for at begrænse indflydelsen af baggrunds fluorescens.
- Brug det respektive værktøj af softwaren til at udtrække temporale fluorescens intensitet data som datafiler fra den valgte ROI, således at en værdi genereres for hver frame i optagelsen.
- Åbn dataene ved hjælp af et dataanalyse program for at beregne δf/f0 -værdierne for hver lugt-sporing. F0 = gennemsnitlig fluorescens i de 2 s før lugt debut. ΔF = forskellen mellem den rå fluorescens i en given ramme og F0. Ud fra disse værdier beregnes en ΔF/F0 -værdi for hver ramme, som kan afbildes med tiden, så den afspejler relativ fluorescens i hele lugt-stimulus-perioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på billeder erhvervet med ovenstående protokol kan ses i figur 2. d Homer-GCaMP3 udtrykkes i en MB output Neuron, hvis dendritter inderverer rummet 1 af MB γ-lap (neuron kaldes MVP228,29) og er genetisk målrettet ved hjælp af Split-Gal4 linje MB112C16. Også, demonstreret er forskellen i den subcellulære lokalisering af en cytosolisk og post-synaptisk lokaliseret calcium indikator. Når man sammenligner figur 2a og figur 2F, kan man tydeligt observere den specifikke, opdelte ekspression af dhomer-GCaMP3-sensoren14 -uden udtryk i neuronets axonale rum og et præget signal synligt i det dendritiske rum. Klar-selv om den lavere amplitude-lugt svar kan ses i fluer udtrykker dHomer-GCaMP3 (figur 2, lavere paneler), sammenlignet med fluer udtrykker cytosolisk GCaMP6f23 (figur 2, øvre paneler). Dette viser, at værktøjet er effektivt til visualisering af olfaktoriske svar på niveauet af postsynapse, og derfor giver en yderligere specificitet til undersøgelse af de neurale kredsløb underliggende, i dette tilfælde, lugt kodning og olfaktoriske Learning.
Et eksempel på sidstnævnte kan ses i figur 3. I dette eksperiment, dHomer-GCaMP3 udtrykkes som i figur 2 -i champignon krop output neuron MVP2. Dette er en neuron kendt for at være moduleret gennem olfaktoriske læring sådan, at præsynaptisk depression som følge af aversive olfaktoriske conditioning afspejles i en afdød postsynaptiske svar til den uddannede lugt28,29 og her en bekræftelse af dette resultat er vist ved hjælp af denne in vivo calcium Imaging Protocol. De calcium spor, der er vist i figur 3 , repræsenterer eksemplariske data fra en enkelt flue. Bemærk, at støjniveauet og amplituden kan variere mellem de enkelte præparater (f. eks. Sammenlign figur 2E og figur 3c-e). Derfor er en sammenligning inden for dyr af præ-vs. efteruddannelse giver en måde at højde for interindividuelle variabilitet. Selvfølgelig er protokollen egnet til at blive overført til billeddannelse af andre neuroner af interesse.
Figur 1: opførelse af et monterings kammer og forberedelse af en flue til billeddannelse. a) trin til opførelse af flyve monterings kammeret. Basen er dannet af en standard mikroskop slide (1) dækket med en fin plastik mesh (2). To elektriske ledninger, der transporterer modsatrettede ladninger (3), klæbes fast til diaset på hver side. Ledningerne er strippet og bøjet til at krydse diaset (4) kører parallelt med hinanden, men ikke i kontakt. Lag af klar tape (5) tilsættes, indtil de når højden af en flue (ca. 1 mm). En kanal skæres gennem båndet lodret (6), ca. 1 mm bred for at passe til bredden af en flue. En forhøjet platform lavet af klar tape (7) er bygget lige over de elektriske ledninger til at danne en pude til fluens hoved, mens thorax er på toppen af ledningerne. (b) skematisk illustration af den flue, som er placeret under to foton mikroskop. Lugt stimulation opnås gennem en hypodermic nål placeret foran flue hovedet (indsat gennem kanalen i båndet (6) og på toppen af platformen (7) for at dirigere lugte til antennerne). (c)-(h) fastgørelse og åbning af flyve hovedet. (c) en flue fastgjort inde i billed kammeret, inde i kanalen (skala bar = 1 mm) og holdes på plads af en frisk stykke klar tape over hele flue. (d) forstørret visning af flue i position. Scale bar = 0,1 mm. (e) et vindue skæres i båndet omkring hovedet af flue. (f) hovedet er yderligere fastgjort med blå lys-hærdende lim. g) hoved kapslen er dækket af ringer's opløsning og åbnes. h) afsluttet forberedelse af hjernen med overskydende væv og luftrør (hvidt væv, som er synligt i (g) fjernet). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Postsynaptisk lokaliseret calcium visualiseret ved hjælp af dHomer-GCaMP3. (a) Konfokal mikroskopi billeder, der viser ekspression af Cytogenisk lokaliseret GCaMP6f (i) og postsynaptisk lokaliseret dHomer-GCaMP3 (II) i MB output neuron MVP2. Grøn pil indikerer γ1 subregion af MB γ-lap. Skala stænger = 15 μm. (b)-(d) billeder taget ved hjælp af to-foton excitation mikroskopi af Geno typerne ovenfor, der viser in vivo fluorescens af de respektive calcium sensorer. (b) F0 (baseline fluorescens) billeder, demonstreret som en gennemsnitlig intensitet projektion af de 2 s før lugt debut. Skala stænger = 10 μm. (c) Flugt -billeder (Fluorescens under lugt stimulering), påvist som en gennemsnitlig intensitets projektion over lugt-respons perioden (2,5 s). (d) δf-billeder genereret ved at fratrække f0 -billede fra flugt -billede for at vise det faktiske lugt-respons signal. e) δf/f0 spor fra ovennævnte fluer af de respektive genotyper gennem en lugt stimulering (Grey bar). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: lærings induceret postsynaptisk plasticitet visualiseret via dHomer-GCaMP3. a) skematiske konditionerings protokoller, der anvendes i disse eksperimenter. Naive lugt reaktioner, før konditionering ("pre") måles først. Så hver flyve oplever en af tre mulige konditionerings protokoller: "parret", hvor en lugt (CS+) er parret med elektriske stød (US) og en anden (CS-) er ikke forstærket; "Lugt kun", hvor kun lugte er præsenteret, både uden forstærkning, til at kontrollere for lugt eksponering effekter; og "chok kun", hvor kun elektriske stød er præsenteret uden lugt stimuli, at styre for chok eksponering effekter. Efter denne konditionering fase, er fluer derefter udsat for "pre" lugte igen for at teste for ændret lugt-fremkaldt aktivitet ("post"). b) et eksempel på lugt respons graduering som følge af den parrede lugt/chok-præsentation. Kraftig undertrykkelse af responsen på cs+ lugt kan ses i γ1 subregion (punkteret linje). (c)-(e) lugt respons spor fra samme flyve som i (b), der viser, at denne undertrykkelses effekt kun observeres i tilfælde af den uddannede lugt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissektion af neurale kredsløb underliggende læring og hukommelse er et fremtrædende mål inden for neurovidenskab. Den genetiske tilgængelighed af Drosophila og bredden og lethed af adfærdsmæssige test gør dette til et ideelt værktøj til at undersøge sådanne fænomener. Her præsenteres en metode, som det er muligt at visualisere, inden for individuelle fluer, den graduering, der opstår på et subcellulært niveau som følge af olfaktoriske conditioning. Ved at udføre både præ-uddannelse og efteruddannelse visualisering af lugt-fremkaldt calcium dynamik, først fastlagt af vores gruppe17, er det muligt at drage en direkte, inden for dyr sammenligning mellem naive og lærte lugt reaktioner og derfor Undersøg plasticiteten af neuroner af interesse. Dette giver en fordel til denne protokol over en masse vurderinger (anvendes i klassisk olfaktoriske conditioning), fordi præ-og post-uddannelse stater kan kvantitativt vurderes for enkeltpersoner, som gør det muligt at bestemme Inter-individuelle Variation. Desuden er den Trænings procedure, der udføres direkte under mikroskopet, stort set ækvivalent med det klassiske olfaktoriske conditioning-paradigme, der typisk anvendes i adfærdsmæssige eksperimenter og ikke involverer kunstig optogenetisk stimulering af neuroner. Selvfølgelig kræver håndtering af de små fluer og forsigtigt åbning af hoved kapslen uden at beskadige hjernevæv, samtidig med at de sensoriske organer forbliver intakt, et niveau af ekspertise, som kan opnås ved omhyggelig og gentagen træning, ikke i modsætning til det omfang, der ses i fysiologiske vurderinger såsom Elektrofysiologi.
Desuden, potentialet til at bruge lokaliserede calcium indikatorer til at undersøge plasticitet på det enkelte neuron niveau er påvist-at tilføje større præcision til neuronal kredsløb Dissection. Dette er eksemplificeret ved at vise en indlærings induceret depression af en postsynaptisk respons i en velundersøgt MB output neuron28,29. Drosophila stammer udtrykker en række synaptisk lokaliseret fluorescens sensorer under UAS kontrol er tilgængelige, f. eks, udtrykker den præsynaptisk lokaliseret sensor synaptophysin-GCaMP3 eller den røde fluorescerende sensor af synaptisk overførsel Synaptophysin-pHTomato20. Selvfølgelig kan de forskellige fluorescens sensor proteiner implementeres ved hjælp af den protokol, der er beskrevet ovenfor.
Optiske billedbehandlings teknikker er generelt begrænset af den tidsmæssige og rumlige opløsning af det mikroskopiske billedanskaffelses system (f. eks. et to-foton mikroskop) og den tidsmæssige opløsning af selve sensoren (f. eks. calcium sensorens kinetik). Elektrofysiologiske optagelser, fx ved hjælp af patch clamp Elektrofysiologi fra somata af neuroner i Drosophila hjernen, stadig tilbyde en uovertruffen tidsmæssig opløsning, men uden at give nogen rumlig præcision. På grund af specificiteten af genekspression i neuroner af interesse kombineret med den subcellulære lokalisering af sensoren, kan optiske billeddiagnostiske teknikker potentielt supplere elektrofysiologiske teknikker til at afdække neuronal plasticitet underliggende indlæring og hukommelse dannelse. De kontinuerlige fremskridt i udviklingen af fluorescens sensorer vil måske give mulighed for at smelte sensor proteiner med hurtigere kinetik eller højere signal-støj-forhold (f. eks. GCaMP6 varianter23) med synaptisk lokaliseret proteiner ligesom dHomer. Desuden vil de seneste fremskridt i etableringen af mikroskopiske teknikker med hurtigere anskaffelses procenter eller højere geografisk opløsning vise sig at være uvurderlige i en yderligere finjustering af vores tilgang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det tyske Forskningsråd gennem det kollaborative forsknings Center SFB 889 "mekanismer for sensorisk behandling" og Forskningsenheden FOR 2705 "dissektion af et hjerne kredsløb: struktur, plasticitet og adfærdsmæssige funktion af Drosophila champignon krop ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
