Summary
Här presenterar vi ett protokoll med vilket pre-och/eller postsynaptiska kalcium kan visualiseras i samband med Drosophila inlärning och minne. In vivo kalcium avbildning med hjälp av synaptically lokaliserade kalcium sensorer kombineras med en klassisk lukt Konditionerings paradigm så att den synaptiska plasticitet som ligger bakom denna typ av associativt lärande kan bestämmas.
Abstract
Årtionden av forskning i många modellorganismer har lett till det nuvarande konceptet av synaptisk plasticitet underliggande inlärning och minnesbildning. Lärande-inducerad förändringar i synaptisk transmission är ofta fördelade över många nervceller och nivåer av behandling i hjärnan. Därför, metoder för att visualisera inlärnings beroende synaptisk plasticitet över nervceller behövs. Frukten flyger Drosophila melanogaster representerar en särskilt gynnsam modell organism för att studera neuronala kretsar underliggande inlärning. Det protokoll som presenteras här visar ett sätt på vilket de processer som ligger till grund för bildandet av associativa lukt minnen, det vill säga synaptisk aktivitet och deras förändringar, kan övervakas in vivo. Med hjälp av det breda spektrum av genetiska verktyg som finns i Drosophilaär det möjligt att uttryckligen uttrycka genetiskt kodade kalcium indikatorer i bestämda cellpopulationer och till och med enstaka celler. Genom att fastställa en fluga på plats, och öppna huvudet kapseln, är det möjligt att visualisera kalciumdynamiken i dessa celler samtidigt leverera lukt stimuli. Dessutom visar vi en uppsättning där flugan kan utsättas, samtidigt, till elektriska stötar till kroppen. Detta ger ett system där flugor kan genomgå klassisk lukt konditionering-varvid en tidigare naiv lukt är lärt sig att förknippas med elektrisk chock straff-samtidigt som representationen av denna lukt (och andra otränade lukter) är observerats i hjärnan via två-Photon mikroskopi. Vårt labb har tidigare rapporterat generering av synaptically lokaliserade kalcium sensorer, vilket gör att man kan begränsa fluorescerande kalcium signaler till pre-eller postsynaptiska fack. Två-Photon mikroskopi ger ett sätt att rumsligt lösa fina strukturer. Vi exemplifierar detta genom att fokusera på nervceller som integrerar information från svamp kroppen, en högre ordningens centrum av insekten hjärnan. Sammantaget ger detta protokoll en metod för att undersöka synaptiska anslutningar mellan nervceller vars aktivitet är modulerad som ett resultat av luktsinnet lärande.
Introduction
Att dechiffrera var och hur informationen förvärvas i hjärnan genom inlärning och därefter lagras som minne utgör en av de mest utmanande uppgifterna i neurovetenskap1. Neurovetenskaplig forskning har lett till begreppet förändring i synaptisk transmission som neuronala substrat som ligger bakom inlärning och minnesbildning2,3. Det är en hypotes om att, under inlärning, synaptiska anslutningar mellan neuronala ensembler som är aktiva under uppfattningen av en stimulans bli modifierad så att deras kombinerade aktivitet mönstret kan hämtas under minne minns, vilket instruerar framtida beteendemässiga åtgärd4. Dessa "engram celler" och deras synapser är ofta fördelade över hjärnans regioner och nivåer av bearbetning, vilket gör det svårt att tilldela observerade förändringar i synaptisk transmission till inlärning av en uppgift eller en stimulans. Att lokalisera och visualisera de synaptiska förändringar som är causally kopplade till en specifik inlärnings uppgift man behöver en lämplig modellsystem som gör det möjligt att exakt begränsa dessa synapser.
För en sådan strävan, Drosophila melanogaster är särskilt lämplig eftersom den kombinerar relativ hjärna enkelhet, beteendemässiga rikedom, och experimentell tillgänglighet. Bland de väletablerade modellorganismerna ligger Drosophila mellan Nematoden C. elegans och genetiskt tractable däggdjur som möss när det gäller neuronala komplexitet. Det stereotypic antalet neuroner (~ 300) och begränsad beteendemässiga repertoar observeras i C. elegans. Däggdjur, å andra sidan, har miljontals nervceller och svindlande beteendemässiga komplexitet. Hjärnan av frukten flyga är, med sin ~ 100 000, nervceller betydligt mindre än hjärnan hos de flesta ryggradsdjur, och många av nervceller är individuellt identifierbara5. Ändå visar Drosophila ett brett spektrum av komplexa beteenden, inklusive en förmåga att uppvisa robust associativt lukt lärande och minnesbildning, först beskrev över 40 år sedan6. Under loppet av denna klassiska konditioneringen förfarande, grupper av flugor utsätts för en lukt som den konditionerade stimulus (CS+) medan de får en straffa elektrisk chock som obetingad stimulans (USA). En andra lukt (CS-) presenteras sedan utan bestraffning. Därmed, djuren lär sig att undvika lukten i samband med bestraffning, som kan testas i en senare valsituation mellan de två lukter, CS+ och cs-. Arbetet med att dissekera det neuronala underlaget bakom detta beteende i Drosophila har identifierat svamp kroppar (MB) som den primära platsen för "engram"7,8,9,10 och, därför, kretsen av denna hjärna regionen var och är föremål för intensiv forskning för att avslöja den logik genom vilken ett minne engram förvärvas och lagras (nyligen granskats i11,12).
Den Drosophila MB består av ~ 2 000 inneboende nervceller (Kenyon celler) per halvklotet, organiserade i parallella axonala projektioner13. Axoner av lukt projektion nervceller utvidgas till den laterala protocerebra och till MB calyces, den viktigaste dendritiska inmatnings platsen för MB och få lukt input från på lobes. Den långa, parallella axoner bunt Kenyon celler utgör stjälken och loberna. De flesta Kenyon celler dela bildar horisontella β/β'-lober genom att utvidga en säkerhet mot mittlinjen i hjärnan, och den vertikala α/α'-lobes genom att förlänga andra säkerheter projicering i dorsala-främre riktning. Den andra gruppen av Kenyon celler bildar den horisontella γ-loberna13 i MB där inlärningsprocessen och efterföljande kortsiktiga minnesbildning kan lokaliseras10. Den MB lober få afferenta input och ge efferent utgång, som båda är typiskt begränsad till distinkta compartmental sub-regioner längs Kenyon cellen axoner14,15,16. I synnerhet, afferenta dopaminerga MB input nervceller har visat sig medla värdebaserad, t. ex., straffande, förstärkande effekter i associativt lukt lärande15,17. Stereotypic och individuellt identifierbar efferent MB utgång nervceller från svampen kroppen lober integrera information över ett stort antal Kenyon celler, mål olika hjärnområden och bära beteende-Instruktiv aptitretande eller aversiva information15 . Denna neuronala arkitektur har lett till ett koncept för organisationen av associativa engram. Lukter är relativt exakt kodade av glest aktiverade ensembler av Kenyon celler. Den sammanfallande aktiviteten av dessa Kenyon cell ensembler och frisättning av dopamin-framkallat genom att straffa stimuli-modulerar överföring från Kenyon cell presynapses på MB utgång nervceller så att djuren kommer därefter att undvika denna lukt10 ,12. Vi använder detta ganska exakt definierade och lokaliserade engram som ett paradigmatisk fall för att illustrera hur dessa lärande-beroende förändringar i synaptisk aktivitet kan bestämmas och övervakas.
Värdet av Drosophila som modellsystem förlitar sig starkt på den oöverträffade genetiska verktygslådan som tillåter en att uttrycka transgener för att identifiera, övervaka och kontrollera enstaka neuroner inom komplexa kretsar18. Tillkomsten av tekniker för neuronala aktivitet övervakning-såsom kalcium avbildning, diskuteras här-har tillåtit för bestämning av neuronala aktivitetsmönster som svar på en viss stimulans. Genom att kombinera specifika Gal4-driven uttryck av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) med lukt stimulering, kan man visualisera lukt-framkallade kalciumdynamiken i neuroner av intresse19. I detta protokoll visas att genom att ytterligare koppla denna teknik med en klassisk konditionering paradigm, är det möjligt att undersöka dessa lukt svar i samband med inlärning. Inlärningsinducerad plasticitet kan ytterligare dissekeras med hjälp av GECIs som inte bara är lokaliserade till en enda specifik neuron, men också till specifika underavdelningar av en neuron. Pech et al.20 har etablerat ett urval av verktyg som tillåter just detta. Genom att rikta GCaMP321 till antingen pre-eller postsynapse-via länkning till ryggradsdjur Synaptophysin eller dHomer, respektive20-differentiell modulering av dessa platser kan särskiljas. Denna lokalisering ger i detta sammanhang en fördel framför de flesta GECIs som är ubiquitously närvarande i hela Cytosol-t. ex.,GCaMP GCaMP321, eller GCaMP623 -eftersom det innebär att pre-och postsynaptiska transienter kan vara skiljas från den totala integrerade kalcium tillströmningen som uppstår som ett resultat av neuron aktivering. Detta kan ge ledtrådar om platsen och typer av plasticitet som uppstår till följd av eller som orsakar inlärning och minnesbildning. Som ett exempel, det protokoll som här visar värdet av detta verktyg i dechiffrera modulering av MB utdata neuroner under lukt associativt lärande genom att rikta uttrycket av kalcium sensorn endast postsynapsen. Genom att övervaka, inom en individuell fluga, lukt-framkallat aktivitet före och efter luktsinnet konditionering en direkt jämförelse kan dras mellan en naiv lukt svar och en lärd lukt svar. Medan fast i samma bild kammaren, flugor utsätts för ett urval av lukter. Sedan får de en aversiva associativa Conditioning Protocol där en av dessa lukter är ihopkopplad med elektriska stötar (blir cs+) och en annan lukt presenteras utan förstärkning (blir cs-). Slutligen är flugorna återigen utsätts för samma lukt som i det första steget. Kalciumdynamik observeras med hjälp av två-Photon mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transgena fruktflugor, Drosophila melanogaster
- Cross kvinnlig jungfru och manliga flugor (upphöjd vid 25 ° c i 60% relativ luftfuktighet på en 12 h ljus/mörker cykel) som transporterar önskad Gal4 och UAS konstruerar25, respektive, att producera flugor där specifika nervceller av intresse uttrycker en genetiskt kodad kalcium indikatorn.
- Ålder den kvinnliga avkomman av ovanstående kors tills de är i intervallet 3-6 dagar efter eclosion. Kvinnliga flugor är att föredra på grund av sin något större storlek.
2. beredning av bananfluga för in vivo kalcium avbildning
- Välj en enda kvinnlig fluga och söva på is inte längre än 5 min.
- Med hjälp av finpincett, placera flugan i bild kammaren (visas i figur 1c). Se till att bröstkorgen och benen är i kontakt med de elektriska kablarna i botten av kammaren och att huvudet lägger platt. Fixera positionen för flugan med hjälp av klar tejp.
Obs: detta protokoll kräver en specialbyggd kammare där flugorna är fasta, med huvud kapseln tillgänglig för öppning, och flugorna kan ta emot både lukt stimuleringar till antenner och elektriska stötar till bröstkorgen och benen (figur 1). - Med hjälp av en kirurgisk skalpell blad fast till skalpell handtaget (se tabell över material), klippa ett fönster i tejpen runt huvudet av flugan, lämnar antennerna täckt och endast den främre-mest delen av bröstkorgen exponeras.
- Omger sidorna och baksidan av huvudet med blått ljus härdnings lim, omsorgsfullt manipulerade med hjälp av en insekt stift som innehas av konkava-konvexa käkar. Ställ in limmet med en blå lampa som avger LED-lampa.
- Kontrollera att limmet är helt inställd och rensa eventuella kvarvarande ohärdat lim från dorsala ytan av fluga huvudet.
- Applicera en droppe av Ringers lösning24 (se tabell över material) för att täcka den exponerade nagelbanden av huvudet.
- Med en mycket finbladig kniv, skär genom nagelbanden. För den mest effektiva avlägsnande av nagelbanden, först skära över den bakre delen av huvudet med hjälp av Ocelli som utgångspunkt. Sedan, skära upp varje sida, medial till ögonen, att bilda en flik av nagelbanden som lätt kan rivas av med hjälp av tång.
- Ta bort överflödig nagelband som kan blockera hjärnregionen av intresse.
- Noggrant rensa dorsala ytan av någon luftstrupe med fin tång, undvika störningar i hjärnvävnaden själv. Ta bort och uppdatera Ringers lösning24 (se tabell över material) som krävs för att rensa området av vävnads skräp.
- Placera Hypodermic lukt leverans nål i läge, cirka 1 cm från huvudet av flugan. Se till att det inte finns något som kan hindra lukt leverans till antennerna.
- Vid Mikroskop, Anslut Imaging kammaren till lukt-leveranssystemet via Hypodermic lukt leverans nål.
- För att låta flugan till fullo återhämta sig från anestesi och kirurgi, och att anpassa sig till luftflödet, genomföra en 10 min viloperiod i detta skede.
3. in vivo kalcium avbildning
- Använd en multiphoton Mikroskop utrustad med en infraröd laser och ett vatten nedsänkning mål (se tabell över material), installeras på en vibrations-isolerad tabell. För visualisering av GFP-baserade kalcium indikatorer, trimma lasern till en excitation våglängd på 920 nm och installera ett GFP band-pass filter.
- Med hjälp av den grova Z-justeringsvredet, scanna genom Z-axeln i hjärnan och lokalisera hjärnregionen av intresse. Använd beskärningsfunktionen för att fokusera skanningen på endast detta område för att minimera skanningstiden, och för att rotera skannervyn så att den främre av huvudet är vänd nedåt.
- Justera ramstorleken till 512 x 512 px, skanningshastighet till > 4 Hz, och skanna region (i Y-dimensionen) så att nervceller av intresse täcks.
4. visualisering av lukt-framkallade kalcium transienter genom lukt konditionering
- Använd en lukt leveranssystem19,26 som kan leverera flera lukt stimuli i ett temporally exakt sätt.
- Använd en extra dator för att styra enheten och för att kommunicera med programvaran Imaging Mikroskop för att samordna lukt stimuleringar med bildfångst under experiment.
- Initiera ett förprogrammerat makropaket som kan länka programvaran och lukt leveransprogrammet (t. ex. ett VBA-makropaket som är installerat i programvaran för Mikroskop styrning, se tabell över material) som reagerar på en extern ingång utlöses av initiering av ett lukt leverans protokoll i ett separat program).
- Starta mätningen genom att övervaka "pre-Training"/naiv lukt-evoked kalcium transienter med en upplösning på 512 x 512 px och en bildhastighet på 4 Hz. leverera en 2,5 s lukt stimulus flankerad av ytterligare bild förvärv för 6,25 s föregående lukt debut (för att etablera en F 0 baseline-värde) och 12,5 s efter lukt förskjutning. Upprepa detta med en andra lukt och sedan med en tredje lukt.
- Fortsätt 3 min efter denna mätning med klassisk konditionering ("utbildning") flugan.
- Välj en av de lukter som presenteras i "pre-utbildning" fas för att bli CS+ lukt och en annan att bli cs- lukt. Presentera CS+ lukt med hjälp av datorstyrd lukt-leverera system för 60 s tillsammans med 12 90 V elektriska stötar.
- Efter en 60 s paus, presentera CS- lukt ensam för 60 s. Använd som luktämnen 4-metylcyklohexanol och 3-oktanol. Inte presentera den tredje lukt (t. ex., 1-octen-3-OL) under denna utbildning som den används som kontroll endast före (steg 4,2.) och efter (steg 4,4) utbildning fas.
- Mät "efter träningen" lukt-evoked kalcium transienter igen genom att upprepa "pre-utbildning" lukt stimulering protokoll (steg 4,2.) 3 min efter avslutad utbildning fas (steg 4,3).
Obs: tidpunkten för detta steg bör återspegla den tid av intresse efter minnesbildning (t. ex. utföra detta steg 3-4 min efter konditioneringen steg för att undersöka korttidsminne). Typiskt, flugor kan överleva i flera timmar i denna beredning. - Spara avbildningsfiler i lämpligt format (t. ex. TIFF) för senare bildanalys.
5. bildanalys
- För att analysera bilder, öppna TIFF (eller liknande) filer i bildanalysprogram som Fiji27.
- Justera staplarna med hjälp av en algoritm för rörelse korrigering för att säkerställa minimal förflyttning i X-och Y-riktningarna. Kassera alla inspelningar som visar stark rörelse i Z-axeln.
- Välj verktyget för den programvara som används för att markera en intresse region (ROI) runt det område som ska undersökas. Detta bör vara så exakt som möjligt för att begränsa påverkan av bakgrundsfluorescens.
- Använd respektive verktyg för programvaran för att extrahera temporala fluorescensintensitetsdata som datafiler från den valda avkastningen, så att ett värde genereras för varje bildruta i inspelningen.
- Öppna data med hjälp av ett dataanalysprogram för att beräkna ΔF/F0 -värdena för varje lukt spår. F0 = genomsnittlig fluorescens i 2 s före lukt debut. ΔF = skillnaden mellan råfluorescensen i en given bildruta och F0. Från dessa värden, beräkna ett ΔF/F0 värde för varje bildruta som kan plottas mot tiden för att återspegla relativ fluorescens under hela lukt stimulans perioden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på bilder som erhållits med ovanstående protokoll kan ses i figur 2. d Homer-GCaMP3 uttrycks i en MB utgång neuron vars dendriter innerverar facket 1 av MB γ-lob (neuron kallas MVP228,29) och är genetiskt inriktad med Split-Gal4 linje MB112C16. Också, visat är skillnaden i subcellulära lokalisering av en cytosoliska och post-synaptically lokaliserad kalcium indikator. När siffrorna 2a och figur 2Fjämförs, kan man tydligt Observera det specifika, uppdelade uttrycket för dhomer-GCaMP3-sensorn14 -utan uttryck i neuronets axonala fack, och en punktad signal synlig i det dendritiska facket. Clear-även om den lägre amplitud-lukt Svaren kan ses i flugor som uttrycker dHomer-GCaMP3 (figur 2, lägre paneler), jämfört med flugor som uttrycker cytosoliska GCaMP6f23 (figur 2, övre paneler). Detta visar att verktyget är effektivt för visualisering av lukt svar på nivån för postsynapsen, och, därför, ger en ytterligare specificitet till undersökning av neurala kretsar underliggande, i detta fall, lukt kodning och lukt lärande.
Ett exempel på det sistnämnda kan ses i figur 3. I detta experiment, dHomer-GCaMP3 uttrycks som i figur 2 -i svampen kroppen ut neuron MVP2. Detta är en neuron känd för att moduleras genom luktsinnet lärande sådan att presynaptisk depression som ett resultat av aversiva luktsinnet konditionering återspeglas i en avliden postsynaptiska svar på utbildad lukt28,29 och här en bekräftelse av detta resultat visas med detta in vivo kalcium avbildnings protokoll. De kalcium spår som visas i figur 3 representerar exemplariska data från en enskild fluga. Observera att ljudnivån och amplituden kan variera mellan enskilda preparat (t. ex. jämföra figur 2e och figur 3c-e). Därför är en djur jämförelse av pre-vs. efter träningen ett sätt att redogöra för inter-individuell variation. Naturligtvis är protokollet lämpligt att överföras till avbildning av andra nervceller av intresse.
Figur 1: konstruktion av en monterings kammare och beredning av en fluga för avbildning. a) åtgärder för uppförande av monterings kammaren för fluga. Basen består av en standard Mikroskop bild (1) täckt med ett fint plast nät (2). Två elektriska ledningar som transporterar motsatta laddningar (3) är limmade till bilden på vardera sidan. Trådarna är avskalade och böjda att korsa bilden (4) löper parallellt med varandra, men inte i kontakt. Skikt av klar tejp (5) tillsätts tills höjden av en fluga (ca 1 mm). En kanal skärs genom tejpen vertikalt (6), ungefär 1 mm bred för att passa bredden på en fluga. En upphöjd plattform gjord av klar tejp (7) byggs precis ovanför de elektriska kablarna för att bilda en kudde för flugans huvud medan bröstkorgen är ovanpå trådarna. bSchematisk illustration av flugan placerad under två-fotons Mikroskop. Den lukt stimulering uppnås genom en Hypodermic nål placerad framför flugans huvud (infogas genom kanalen i bandet (6) och ovanpå plattformen (7) för att styra lukter till antennerna). (c)-(h) fastsättning och öppnande av fluga huvudet. c) en fluga som är fast i bild kammaren, inne i kanalen (skal stång = 1 mm) och hålls på plats av en ny bit klar tejp över hela flugan. (d) förstorade syn på flugan i läge. Skalbar = 0,1 mm. (e) ett fönster skärs in i tejpen runt huvudet på fluga. (f) huvudet är ytterligare fast med blått ljus-härdnings lim. (g) huvud kapseln är täckt med Ringers lösning och öppnas. h) färdig beredning av hjärnan med överskott av vävnad och luftstrupe (vit vävnad synlig ig) borttagen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: postsynaptically-lokaliserad kalcium visualiseras med hjälp av dHomer-GCaMP3. (a) konfokalmikroskopi bilder som visar uttrycket av cytosolically lokaliserade GCaMP6f (i) och postsynaptically lokaliserade dHomer-GCaMP3 (II) i MB output neuron MVP2. Grön pil anger γ1-subregionen för MB γ-Lobe. Skalstreck = 15 μm. (b)-(d) bilder tagna med två-Photon excitation mikroskopi av genotyperna ovan, visar in vivo fluorescens av respektive kalcium sensorer. (b) F0 -bilder (baslinje fluorescens), visade som en genomsnittlig intensitetsprojektion av 2 s före lukt debut. Skalstreck = 10 μm. (c) Flukt bilder (fluorescens under lukt stimulering), visas som en medelintensitetsprojektion över lukt responstiden (2,5 s). (d) δf bilder som genereras genom att subtrahera f0 bild från flukt bild, för att Visa faktisk lukt responssignal. (e) δf/f0 spår från ovanstående flugor av respektive genotyper genom en lukt stimulering (grå stapel). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Inlärningsinducerad postsynaptisk plasticitet visualiseras via dHomer-GCaMP3. (a) schematiska av konditioneringsprotokoll som används i dessa experiment. Naiva lukt svar, före konditionering ("pre") mäts först. Därefter erfar varje fluga en av tre möjlighet villkora protokoll: "parat", var en lukt (CS+) paras med elektriskt CHOCKAR (US) och another (cs-) inte förstärks; "Lukt bara", där endast lukter presenteras, både utan förstärkning, att kontrollera för lukt exponeringseffekter; och "chocker bara", där endast elektriska stötar presenteras utan lukt stimuli, att kontrollera för chock exponeringseffekter. Efter denna konditionering fas, flugor sedan utsätts för "pre" lukter igen för att testa för förändrad lukt-evoked aktivitet ("post"). (b) ett exempel på lukt reaktion modulering som ett resultat av den Parade lukt/chock presentation. Stark dämpning av svaret på cs+ lukt kan ses i γ1 del (prickad linje). (c)-(e) lukt respons spår från samma fluga som i (b), visar att denna dämpning effekt endast observeras i fallet med den utbildade lukten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissektion av neurala kretsar underliggande inlärning och minne är ett framträdande mål inom neurovetenskap. Den genetiska tillgängligheten av Drosophila och bredden och enkelheten i beteendemässiga tester gör detta till ett idealiskt verktyg för att undersöka sådana fenomen. Här är en metod som presenteras med vilken det är möjligt att visualisera, inom enskilda flugor, modulering som sker på en subcellulär nivå som en följd av luktsinnet konditionering. Genom att utföra både pre-utbildning och efter utbildning visualisering av lukt-evoked kalciumdynamik, som först inrättades av vår grupp17, är det möjligt att dra en direkt, inom-djur jämförelse mellan naiva och lärde lukt svar och därför Undersök plasticitet av neuroner av intresse. Detta ger en fördel till detta protokoll över en masse -bedömningar (som används i klassisk lukt) eftersom pre-och post-utbildning stater kan kvantifieras kvantitativt för individer, vilket gör det möjligt att fastställa inter-individuell Variation. Dessutom är den utbildning som utförs direkt under mikroskopet i stort sett motsvarar den klassiska luktsinnet konditioneringen paradigm som vanligtvis används i beteendemässiga experiment och inte innebär artificiell optogenetisk stimulering av nervceller. Naturligtvis, hantering av de små flugor och försiktigt öppna huvudet kapseln utan att skada hjärnvävnaden samtidigt som de sensoriska organen intakt kräver en nivå av expertis som kan uppnås genom noggrann och upprepad utbildning, inte olikt den utsträckning som ses i fysiologiska bedömningar såsom elektrofysiologi.
Dessutom, potentialen att använda lokaliserade kalcium indikatorer för att undersöka plasticitet på Single neuron nivå demonstreras-lägga större precision till neuronala krets dissektion. Detta exemplifieras genom att visa en inlärningsinducerad depression av en postsynaptisk respons i en väl undersökt MB utgång neuron28,29. Drosophila stammar uttrycker en mängd synaptically lokaliserade fluorescens sensorer under UAS kontroll finns tillgängliga, t. ex., uttrycker presynaptically lokaliserad sensor Synaptophysin-GCaMP3 eller den röda fluorescerande sensorn av Synaptic överföring Synaptophysin-pHTomato20. Naturligtvis kan de olika fluorescenssensorproteinerna implementeras med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan.
Optisk bildteknik är i allmänhet begränsad av den temporala och rumsliga upplösningen av mikroskopiska bild förvärvs system (t. ex. en två-Photon Mikroskop) och den temporala upplösningen av sensorn själv (t. ex., kinetik av kalcium sensorn). Elektrofysiologiska inspelningar, t ex med hjälp av plåster klämma elektrofysiologi från Somata av nervceller i Drosophila hjärnan, fortfarande erbjuder en oöverträffad temporala upplösning, men utan att ge någon rumslig precision. På grund av specificiteten hos genuttrycket i neuroner av intresse kombinerat med den subcellulära lokalisering av sensorn, optiska avbildningstekniker kan potentiellt komplettera elektrofysiologiska tekniker för att avslöja neuronala plasticitet underliggande inlärning och minnesbildning. De kontinuerliga framstegen i utvecklingen av fluorescenssensorer kommer kanske att ge möjlighet att smälta sensor proteiner med snabbare kinetik eller högre signal-till-brus-förhållanden (t. ex. GCaMP6 varianter23) med synaptically lokaliserade proteiner som dHomer. Även de senaste framstegen med att etablera mikroskopiska tekniker med snabbare förvärvsfrekvens eller högre rumslig upplösning kommer att visa sig ovärderliga för ytterligare finjustering av vårt förhållningssätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det tyska forskningsrådet genom samverkande Research Center SFB 889 "mekanismer för sensorisk bearbetning" och forskningsenheten för 2705 "dissektion av en hjärn krets: struktur, plasticitet och beteendemässiga funktion av Drosophila svamp kropp ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
