Summary
Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.
Abstract
Decennia van onderzoek in veel model organismen hebben geleid tot het huidige concept van synaptische plasticiteit onderliggende leren en Geheugenvorming. Learning-geïnduceerde veranderingen in de synaptische transmissie zijn vaak verdeeld over vele neuronen en niveaus van verwerking in de hersenen. Daarom, methoden voor het visualiseren van leer afhankelijke synaptische plasticiteit over neuronen nodig zijn. De fruitvlieg Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een bijzonder gunstig modelorganisme om neuronale circuits onderliggende leren te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerd toont een manier waarop de processen die aan de vorming van associatieve reuk geheugens, dat wil zeggen, synaptische activiteit en hun veranderingen, kunnen worden gemonitord in vivo. Met behulp van de brede waaier van genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila, is het mogelijk om genetisch gecodeerde calcium indicatoren expliciet uit te drukken in bepaalde celpopulaties en zelfs enkelvoudige cellen. Door het bevestigen van een vlieg op zijn plaats, en het openen van de hoofd capsule, is het mogelijk om de calcium dynamica in deze cellen te visualiseren terwijl olfactorische stimuli worden gegeven. Daarnaast demonstreren we een set-up waarin de vlieg gelijktijdig kan worden blootgesteld aan elektrische schokken aan het lichaam. Dit biedt een systeem waarin vliegen klassieke olfactorische conditionering kan ondergaan-waarbij een eerder naïeve geur wordt geleerd te worden geassocieerd met elektrische schok straf-op hetzelfde moment als de representatie van deze geur (en andere ongetrainde geuren) is waargenomen in de hersenen via twee-photon microscopie. Ons laboratorium heeft eerder de generatie van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren gerapporteerd, waardoor men de fluorescerende calcium signalen kan beperken tot pre-of postsynaptische compartimenten. Two-photon microscopie biedt een manier om ruimtelijke structuren op te lossen. We illustreren dit door te focussen op neuronen die informatie van het paddestoel lichaam integreren, een hoger-orde centrum van het insecten brein. Over het algemeen, dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van de synaptische verbindingen tussen neuronen waarvan de activiteit wordt gemoduleerd als gevolg van reuk leren.
Introduction
Ontcijferen waar en hoe de informatie wordt verworven in de hersenen door te leren en vervolgens opgeslagen als geheugen vormt een van de meest uitdagende taken in neurowetenschappen1. Neurowetenschappelijk onderzoek heeft geleid tot het concept van een verandering in de synaptische transmissie als de neuronale substraat dat ten grondslag ligt aan leren en Geheugenvorming2,3. Het is veronderstelde dat, tijdens het leren, synaptische verbindingen tussen neuronale ensembles die actief zijn tijdens de perceptie van een stimulus zodanig worden gewijzigd dat hun gecombineerde activiteit patroon kan worden opgehaald tijdens geheugen terugroepen, waardoor het instrueren toekomstige gedrags actie4. Deze "engram cellen" en hun synapsen zijn vaak verdeeld over hersengebieden en niveaus van verwerking, waardoor het moeilijk is om waargenomen veranderingen in synaptische transmissie toe te wijzen aan het leren van een taak of een stimulus. Om te lokaliseren en visualiseren van die synaptische veranderingen die causaal gekoppeld aan een specifieke leer taak men moet een juiste modelsysteem dat het mogelijk maakt voor het nauwkeurig beperken van die synapsen.
Voor een dergelijke inspanning is Drosophila melanogaster bijzonder geschikt omdat het relatieve hersen eenvoud, gedrags rijkdom en experimentele toegankelijkheid combineert. Onder de gevestigde model organismen, Drosophila is gelegen tussen de nematode C. elegans en genetisch Tractable zoogdieren zoals muizen in termen van neuronale complexiteit. Het type aantal neuronen (~ 300) en het beperkte gedrags repertoire wordt waargenomen bij C. elegans. Zoogdieren, aan de andere kant, hebben miljoenen neuronen en duizelingwekkende gedrags complexiteit. De hersenen van de fruitvlieg is, met zijn ~ 100.000, neuronen aanzienlijk kleiner dan de hersenen van de meeste gewervelde dieren, en veel van de neuronen zijn individueel identificeerbaar5. Toch toont Drosophila een breed spectrum van complexe gedragingen, waaronder een vermogen om robuuste associatieve olfactorische leer-en Geheugenvorming te vertonen, die voor het eerst werd beschreven 40 jaar geleden6. In de loop van deze klassieke conditionerings procedure worden groepen vliegen onderworpen aan een geur als de geconditioneerde stimulus (CS+) terwijl ze een punierende elektrische schok krijgen als de ongeconditioneerde STIMULUS (VS). Een tweede geur (CS-) wordt dan gepresenteerd zonder straf. Daardoor leren de dieren om de geur geassocieerd met de straf te vermijden, die kan worden getest in een latere keuze situatie tussen de twee geuren, CS+ en CS-. Werk aan het ontleden van de neuronale substraat onderliggende dit gedrag in Drosophila heeft de paddestoel lichamen geïdentificeerd (MB) als de primaire site van de "engram"7,8,9,10 en daarom, de circuits van dit hersengebied was en is het onderwerp van intens onderzoek om de logica te achterhalen waarmee een geheugen-engram wordt verworven en opgeslagen (onlangs beoordeeld in11,12).
De Drosophila MB bestaat uit ~ 2.000 intrinsieke neuronen (Kenyon cellen) per halfrond, georganiseerd in parallelle axonale projecties13. Axonen van olfactorische projectie neuronen worden uitgebreid naar de laterale protocerebra en naar de MB calyces, de belangrijkste dendritische ingangs plaats van de MB en ontvangen olfactorische input van antennal lobben. De lange, parallelle axonen-bundel van Kenyon-cellen vormen de bloem en de lobben. De meeste Kenyon-cellen vormen horizontale β/β'-lobben door een onderpand uit te breiden naar de middenlijn van de hersenen, en de verticale α/α'-lobben door het uitbreiden van tweede onderpand dat projecteren in de dorsale-anterieure richting. De andere groep van Kenyon cellen vormt de horizontale γ-lobben13 van de MB waar het leerproces en de daaropvolgende korte-termijn Geheugenvorming zou kunnen worden gelokaliseerd10. De MB-lobben krijgen een afferente input en zorgen voor een efferente output, die beide meestal beperkt zijn tot verschillende compartimentele subregio's langs de Kenyon Cell axonen14,15,16. In het bijzonder is aangetoond dat de afferente Dopaminerge MB-input neuronen bemiddel op waarde gebaseerde, bijvoorbeeld, punitieve, versterkende effecten in associatieve reuk Learning15,17. Stereotypic en individueel identificeerbare efferente MB-output neuronen uit de paddestoel Body lobben integreren informatie over grote aantallen Kenyon cellen, richten diverse hersengebieden en dragen gedrag-leerzame eetlust of aversieve informatie15 . Deze neuronale architectuur heeft geleid tot een concept van de organisatie van het associatieve engram. Geuren zijn relatief nauwkeurig gecodeerd door dun geactiveerde ensembles van Kenyon-cellen. De samenvallen activiteit van deze Kenyon celensembles en het vrijkomen van dopamine-opgeroepen door het straffen van stimuli-moduleert transmissie van Kenyon Cell presynapses op MB uitgangs neuronen zodanig dat de dieren vervolgens deze bijzondere geur zal vermijden10 ,12. We gebruiken dit nogal nauwkeurig gedefinieerde en gelokaliseerde engram als een paradigmatische zaak om te illustreren hoe deze leer afhankelijke veranderingen in synaptische activiteit kunnen worden bepaald en gemonitord.
De waarde van Drosophila als modelsysteem is sterk afhankelijk van de ongeëvenaarde genetische Toolbox die het mogelijk maakt om transgenen te uiten voor het identificeren, bewaken en beheersen van enkele neuronen binnen complexe circuits18. De opkomst van technieken voor Neuronale activiteit monitoring-zoals calcium Imaging, hier besproken-hebben toegestaan voor de bepaling van de neuronale activiteit patronen in reactie op een specifieke stimulans. Door het combineren van specifieke Gal4-driven expressie van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) met olfactorische stimulatie, kan men visualiseren de geur-opgeroepen calcium dynamiek van neuronen van belang19. In dit protocol wordt aangetoond dat door deze techniek verder te koppelen aan een klassiek conditionerings paradigma, het mogelijk is om deze olfactorische responsen in de context van leren te onderzoeken. Leer-geïnduceerde plasticiteit kan verder worden ontleed met behulp van GECIs die niet alleen gelokaliseerd zijn op één specifiek neuron, maar ook op specifieke subcompartimenten van een neuron. Pech et al.20 heeft een selectie van tools opgezet die dit precies mogelijk maken. Door zich te richten op GCaMP321 op de pre-of postsynapse-via-koppeling naar het gewervelde Syntophysin of dHomer, respectievelijk20-de differentiële modulatie van deze sites kan worden onderscheiden. Deze lokalisatie verleent in dit verband een voordeel ten opzichte van de meeste GECIs die alomtegenwoordig aanwezig zijn in de cytosol-bijvoorbeeld GCaMP22, GCaMP321of GCaMP623 -omdat dit betekent dat pre-en postsynaptische transiënten kunnen worden onderscheiden van de totale geïntegreerde calcium instroom die optreedt als gevolg van neuron activatie. Dit kan aanwijzingen geven over de locatie en de soorten plasticiteit die optreden als gevolg van of die leiden tot leren en Geheugenvorming. Als voorbeeld toont het protocol dat hier wordt geleverd de waarde van dit hulpmiddel bij het ontcijferen van de modulatie van MB-uitgangs neuronen tijdens olfactorische associatief leren door de expressie van de calcium sensor te richten op alleen de postsynapse. Door te monitoren, binnen een individuele vlieg, geur-Evoked activiteit voor en na olfactorische conditionering een directe vergelijking kan worden getrokken tussen een naïeve geur respons en een geleerde geur respons. Terwijl ze in dezelfde Imaging kamer zijn bevestigd, worden vliegen blootgesteld aan een selectie van geuren. Vervolgens krijgen ze een aversief associatief conditionerings protocol waarin een van deze geuren is gekoppeld aan elektrische schokken (de CS+) en een andere geur wordt gepresenteerd zonder versterking (de CS-). Ten slotte worden de vliegen weer blootgesteld aan dezelfde geuren als in de eerste stap. Calcium dynamica wordt waargenomen met behulp van twee-photon microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. transgene vruchten vliegen, Drosophila melanogaster
- Kruis vrouwelijke Maagd en mannelijke vliegen (verhoogd bij 25 °C in 60% relatieve vochtigheid op een 12 h licht/donkere cyclus) dragen van de gewenste Gal4 en UAS constructies25, respectievelijk, om vliegen te produceren waarin specifieke neuronen van belang Express een genetisch gecodeerde calcium indicator.
- Leeftijd de vrouwelijke nakomelingen van het bovenstaande Kruis totdat ze in het bereik van 3-6 dagen na Eclosion. Vrouwelijke vliegen hebben de voorkeur vanwege hun iets grotere omvang.
2. bereiding van de fruitvlieg voor in vivo calcium beeldvorming
- Selecteer een enkele vrouwelijke Fly en verdol op ijs voor niet langer dan 5 min.
- Met behulp van fijne Tang, plaats de vlieg in de Imaging kamer (gedemonstreerd in Figuur 1c). Zorg ervoor dat de thorax en benen in contact zijn met de elektrische draden in de bodem van de kamer en dat het hoofd plat ligt. Bevestig de positie van de vlieg met behulp van duidelijke plakband.
Opmerking: dit protocol vereist een op maat gebouwde kamer waarin de vliegen zijn vast, met de hoofd capsule toegankelijk voor opening, en de vliegen in staat om beide geur stimulaties te ontvangen om de antennes en elektrische schokken aan de thorax en benen (Figuur 1). - Met behulp van een chirurgische scalpel zwaard bevestigd aan de scalpel handvat (Zie tabel van de materialen), snijd een venster in de tape rond het hoofd van de vlieg, waardoor de antennes bedekt en alleen het voorste-meest gedeelte van de thorax blootgesteld.
- Omring de zijkanten en achterkant van het hoofd met blauw-lichtuithardende lijm, zorgvuldig gemanipuleerd met behulp van een insecten PIN vastgehouden door concave-bolle kaken. Stel de lijm in met een blauw lichtuitstralend LEDLAMPJE.
- Controleer of de lijm volledig is ingesteld en Wis eventuele resterende niet-geharde lijm van het rugoppervlak van de vliegkop.
- Breng een druppel Ringer's Solution24 aan (Zie tabel met materialen) om de blootgestelde cuticula van het hoofd te bedekken.
- Met behulp van een zeer fijn bladed steek mes, snijd door de cuticula. Voor de meest efficiënte verwijdering van de cuticula, snijdt u eerst over het achterste deel van het hoofd met behulp van de ocelli als uitgangspunt. Knip vervolgens elke kant, mediaal naar de ogen, om een flap van de cuticula te vormen die gemakkelijk kan worden afgebroken met behulp van een tang.
- Verwijder eventuele overtollige cuticula die het hersengebied van belang kan blokkeren.
- Verwijder voorzichtig het rugoppervlak van een luchtpijp met behulp van fijne Tang, Vermijd verstoring van het hersenweefsel zelf. Verwijder en vernieuw de oplossing van Ringer24 (Zie tabel met materialen) zoals vereist om het gebied van weefsel puin te wissen.
- Plaats de hypodermische geur leveringsnaald in positie, ongeveer 1 cm van het hoofd van de vlieg. Zorg ervoor dat er niets is dat de geur afgifte aan de antennes kan belemmeren.
- Op de Microscoop, Verbind de Imaging kamer met de geur-afgiftesysteem via de hypodermische geur levering naald.
- Om de vlieg volledig te herstellen van anesthesie en chirurgie, en aan te passen aan de luchtstroom, implementeren van een 10 min rustperiode in dit stadium.
3. in vivo calcium Imaging
- Gebruik een multiphoton-Microscoop die is uitgerust met een infrarood laser en een wateronderdompelings doelstelling (Zie tabel met materialen), geïnstalleerd op een trillingsgeïsoleerde tafel. Voor de visualisatie van op GFP gebaseerde calcium indicatoren stemt u de laser af op een excitatie golflengte van 920 nm en installeert u een GFP band-pass filter.
- Door de grove Z-instelknop te gebruiken, scant u de Z-as van de hersenen en zoekt u het hersengebied van belang. Gebruik de functie uitsnijden om het scannen op alleen dit gebied scherp te stellen om de scantijd te minimaliseren en om de scan weergave zodanig te roteren dat het voorste deel van het hoofd naar beneden wordt gericht.
- Pas de framegrootte aan 512 x 512 px, scansnelheid naar > 4 Hz, en scan regio (in de Y-dimensie) zodat de neuronen van belang zijn bedekt.
4. visualisatie van geur-Evoked calcium transiënten via olfactorische conditionering
- Gebruik een geur afgiftesysteem19,26 dat verschillende geur stimuli kan leveren op een tijdelijke nauwkeurige manier.
- Gebruik een extra computer om het apparaat te bedienen en om te communiceren met de Imaging-Microscoop-software om geur stimulaties te coördineren met beeldopname tijdens experimenten.
- Een voorgeprogrammeerd macro pakket initiëren waarmee de software voorbeeld verwerving en het afleverings programma voor geuren kunnen worden gekoppeld (bijv. een VBA-macro pakket dat is geïnstalleerd in de Microscoop-besturingssoftware, Zie tabel met materialen) die reageert op een externe ingang door de initiatie van een geur leverings protocol in een apart programma).
- Start de meting door het monitoren van "pre-training"/naïeve geur-opgeroepen calcium transiënten bij een resolutie van 512 x 512 PX en een frame rate van 4 Hz. lever een 2,5 s geur stimulus geflankeerd door extra beeld verwerving voor 6,25 s voorafgaand aan het stank-begin (om een F 0 baselinewaarde) en 12,5 s na verschuiving van de geur. Herhaal dit met een tweede geurend en vervolgens met een derde geur.
- Vervolg 3 minuten na deze meting met klassieke conditionering ("training") de vlieg.
- Selecteer een van de geuren die in de "pre-training"-fase worden gepresenteerd om de CS+ -geur te worden en een andere om de CS- geur te worden. Presenteer de CS+ geur met behulp van de computergestuurde geur-leveren systeem voor 60 s naast 12 90 V elektrische schokken.
- Na een pauze van 60 s, presenteren de CS- geur alleen voor 60 s. gebruik als geurstoffen 4-methylcyclohexanol en 3-octanol. De derde geur (bijv. 1-octen-3-OL) niet presenteren tijdens deze training, omdat deze alleen wordt gebruikt als controle vóór (stap 4,2.) en na (stap 4,4) de trainingsfase.
- Meet de "post-training" geur-opgeroepen calcium transiënten opnieuw door het herhalen van de "pre-training" geur stimulatie Protocol (stap 4,2.) 3 min na het beëindigen van de trainingsfase (stap 4,3).
Opmerking: de timing van deze stap moet de tijd van belang na de Geheugenvorming weerspiegelen (bijvoorbeeld, uitvoeren van deze stap 3-4 min na de conditionerings stap om te onderzoeken van de korte-termijn geheugen). Meestal, vliegen kan overleven voor enkele uren in deze voorbereiding. - Sla Imaging bestanden op in een geschikte indeling (bijvoorbeeld TIFF) voor latere beeldanalyse.
5. beeldanalyse
- Voor het analyseren van afbeeldingen, open TIFF (of soortgelijke) bestanden in de beeldanalyse software zoals Fiji27.
- Lijn de stapels uit met behulp van een algoritme voor bewegings correctie om een minimale beweging in de X-en Y-richting te garanderen. Gooi alle opnames weg die een sterke beweging in de Z-as vertonen.
- Selecteer de tool van de software die wordt gebruikt om een regio van belang (ROI) te markeren rond het gebied dat moet worden onderzocht. Dit moet zo nauwkeurig mogelijk zijn om de invloed van de achtergrond fluorescentie te beperken.
- Gebruik de respectieve tool van de software om temporele fluorescentie intensiteitsgegevens te extraheren als gegevensbestanden van de geselecteerde ROI, zodat voor elk frame van de opname een waarde wordt gegenereerd.
- Open de gegevens met behulp van een Data-analyseprogramma om de ΔF/F0 -waarden voor elke geur tracering te berekenen. F0 = gemiddelde fluorescentie in de 2 s vóór het begin van de geur. ΔF = het verschil tussen de ruwe fluorescentie in een gegeven frame en F0. Bereken uit deze waarden een ΔF/F0 -waarde voor elk frame dat tegen de tijd kan worden uitgezet om de relatieve fluorescentie tijdens de geur stimulus periode weer te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van afbeeldingen die met het bovenstaande protocol zijn verkregen, is te zien in Figuur 2. d Homer-GCaMP3 wordt uitgedrukt in een MB-output neuron waarvan dendrites innervate het compartiment 1 van de MB γ-kwbe (het neuron wordt genoemd MVP228,29) en is genetisch gericht met behulp van de split-Gal4 lijn MB112C16. Ook, gedemonstreerd is het verschil in de subcellulaire lokalisatie van een cytosolische en de post-Synaptisch gelokaliseerde calcium indicator. Bij het vergelijken van cijfers 2a en figuur 2F, kan men duidelijk de specifieke, Compartimenaliseerde uitdrukking van de dhomer-GCaMP3 sensor14 waarnemen-zonder expressie in de axonale compartimenten van het neuron, en een onderbroken signaal zichtbaar in het dendritische compartiment. Duidelijk-hoewel de lagere amplitude-geur reacties kunnen worden gezien in vliegen uitdrukken dHomer-GCaMP3 (Figuur 2, onderste panelen), in vergelijking met vliegen uitdrukken cytosolische GCaMP6f23 (Figuur 2, bovenste panelen). Dit toont aan dat de tool effectief is voor de visualisatie van olfactorische responsen op het niveau van de postsynapse, en daarom een extra specificiteit biedt voor het onderzoek van de onderliggende neurale circuits, in dit geval, geur codering en reuk learning.
Een voorbeeld van de laatste kan worden gezien in Figuur 3. In dit experiment, dHomer-GCaMP3 wordt uitgedrukt als in Figuur 2 -in de PADDESTOEL lichaam output neuron MVP2. Dit is een neuron bekend om te worden gemoduleerd door reuk leren zodanig dat presynaptische depressie als gevolg van aversieve olfactorische conditionering wordt weerspiegeld in een overleden postsynaptische reactie op de getrainde geur28,29 en hier een bevestiging van dit resultaat wordt getoond met behulp van dit in vivo calcium Imaging protocol. De in Figuur 3 getoonde calcium sporen vertegenwoordigen voorbeeldige gegevens van een individuele vlieg. Merk op dat het geluidsniveau en de amplitude kunnen variëren tussen individuele preparaten (bijv. Vergelijk figuur 2e en figuur 3c-e). Daarom biedt een vergelijking binnen dieren van pre-vs. na de training een manier om rekening te kunnen maken met inter-individuele variabiliteit. Natuurlijk, het protocol is geschikt om te worden overgebracht naar beeldvorming van andere neuronen van belang.
Figuur 1: bouw van een montage kamer en voorbereiding van een vlieg voorbeeld vorming. a) stappen voor de aanleg van de vlieg montage kamer. De basis wordt gevormd door een standaard Microscoop glijbaan (1) bedekt met een fijn kunststof gaas (2). Twee elektrische draden die tegengestelde ladingen (3) dragen, worden aan beide zijden aan de glijbaan vastgelijmd. De draden worden gestript en gebogen om de glijbaan (4) met elkaar parallel te kruisen, maar niet in contact. Lagen van doorzichtige kleefband (5) worden toegevoegd tot het bereiken van de hoogte van een vlieg (ongeveer 1 mm). Een kanaal wordt verticaal door de tape gesneden (6), ongeveer 1 mm breed om de breedte van een vlieg te passen. Een verhoogd platform gemaakt van doorzichtige kleefband (7) is net boven de elektrische draden gebouwd om een kussen te vormen voor het hoofd van de fly terwijl de thorax bovenop de draden staat. b) Schematische illustratie van de vlieg die onder de twee-Fobe Microscoop is geplaatst. De geur stimulatie wordt bereikt door middel van een hypodermische naald geplaatst voor de kop van de Fly (ingebracht door het kanaal in de tape (6) en bovenop het platform (7) om de geuren naar de antennes te richten). (c)-(h) bevestiging en opening van de vliegkop. c) een vlieg in de beeldvormings kamer, in het kanaal (schaalbalk = 1 mm) en op zijn plaats gehouden door een nieuw stukje doorzichtige kleefband over de hele vlieg. d) vergrote weergave van de Gulp in positie. Schaalbalk = 0,1 mm. (e) een venster wordt in de tape rond het hoofd van de vlieg gesneden. f) het hoofd wordt verder bevestigd met blauwe lichtuithardende lijm. g) de hoofd capsule is bedekt met ringer's oplossing en geopend. h) voltooide bereiding van de hersenen met overtollig weefsel en luchtpijp (Wit weefsel zichtbaar in (g) verwijderd). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: postsynaptisch gelokaliseerde calcium gevisualiseerd met behulp van dHomer-GCaMP3. (a) confocale microscopie beelden die de uitdrukking van cytosolically gelokaliseerde GCaMP6f (i) en postsynaptisch gelokaliseerde dHomer-GCaMP3 (II) in de MB-output neuron MVP2 tonen. Groene pijl geeft de γ1 subregio van de MB γ-kwbe aan. Schaal staven = 15 μm. (b)-(d) beelden die zijn vastgelegd met behulp van twee-fotonen excitatie microscopie van de genotypen hierboven, met de in vivo fluorescentie van de respectieve calcium sensoren. b) F0 (baseline fluorescentie) beelden, aangetoond als een gemiddelde intensiteit projectie van de 2 s vóór het begin van de geur. Schaal staven = 10 μm. (c) Fgeur beelden (fluorescentie tijdens geur stimulatie), aangetoond als een gemiddelde intensiteits projectie over de reactieperiode van de geur (2,5 s). d) δf-afbeeldingen die worden gegenereerd door het f0 -beeld af te trekken van f-geur afbeelding, om het werkelijke geur respons signaal weer te geven. e) δf/f0 sporen van de bovengenoemde vliegen van de respectieve genotypen door middel van een geur stimulatie (grijze balk). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: leren-geïnduceerde postsynaptische plasticiteit gevisualiseerd via dHomer-GCaMP3. a) Schematische voorstelling van de conditionerings protocollen die bij deze experimenten worden gebruikt. Naïeve geur responsen, vóór conditionering ("pre") worden eerst gemeten. Dan ervaart elke Fly een van de drie mogelijke conditionerings protocollen: "gepaarde", waarbij één geur (CS+) wordt gecombineerd met elektrische schokken (VS) en een andere (CS-) niet wordt versterkt; "Alleen geuren", waarbij alleen de geuren worden gepresenteerd, beide zonder versterking, om controle te hebben op de effecten van geur blootstelling; en "alleen schokken", waarbij alleen elektrische schokken worden gepresenteerd zonder enige geur stimuli, om te controleren op schok blootstelling effecten. Na deze conditionerings fase worden vliegen vervolgens weer blootgesteld aan de "pre" geuren om te testen op veranderde geur-Evoked activiteit ("post"). b) een voorbeeld van geur respons modulatie als gevolg van de gepaarde geur/schok presentatie. Een sterke onderdrukking van de reactie op de CS+ geur is te zien in de γ1 subregio (gestippelde lijn). c)-(e) de reactie van geur van dezelfde vlucht als inb), waaruit blijkt dat dit onderdrukkings effect alleen in het geval van de getrainde geur wordt waargenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De dissectie van de neurale circuits onderliggende leren en geheugen is een prominente doel op het gebied van de neurowetenschappen. De genetische bereikbaarheid van Drosophila en de breedte en het gemak van gedragstesten maken dit een ideaal instrument om dergelijke verschijnselen te onderzoeken. Hier wordt een methode gepresenteerd waarmee het mogelijk is om binnen individuele vliegen de modulatie te visualiseren die optreedt op een subcellulair niveau als gevolg van olfactorische conditionering. Door het uitvoeren van zowel pre-training en post-training visualisatie van geur-opgeroepen calcium dynamica, eerst vastgesteld door onze groep17, is het mogelijk om een directe, binnen-dier vergelijking tussen naïeve en geleerde geur reacties te trekken en daarom onderzoek de plasticiteit van neuronen van belang. Dit biedt een voordeel voor dit protocol over en masse -evaluaties (gebruikt in klassieke olfactorische conditionering), omdat pre-en posttrainingstatussen kwantitatief kunnen worden beoordeeld voor individuen, waardoor men de Inter-individuele Variabiliteit. Bovendien is de trainings procedure die direct onder de Microscoop wordt uitgevoerd, grotendeels equivalent aan het klassieke olfactorische conditionerings paradigma dat typisch wordt gebruikt bij gedrags experimenten en geen kunstmatige optogenetische stimulatie van neuronen inhoudt. Natuurlijk, het hanteren van de kleine vliegen en het zorgvuldig openen van de hoofd capsule zonder beschadiging van het hersenweefsel, terwijl het intact houden van de zintuigen organen vereist een niveau van deskundigheid die kan worden opgedaan door nauwgezette en herhaalde training, niet in tegenstelling tot de mate gezien in fysiologische evaluaties zoals elektrofysiologie.
Bovendien wordt het potentieel voor het gebruik van gelokaliseerde calcium indicatoren om plasticiteit op het niveau van één neuron te onderzoeken aangetoond-het toevoegen van grotere precisie aan het neuronale circuit dissectie. Dit wordt geïllustreerd door het tonen van een door leer veroorzaakte depressie van een postsynaptische respons in een goed onderzochte MB-uitgangs neuron28,29. Drosophila stammen die een verscheidenheid aan Synaptisch gelokaliseerde fluorescentie sensoren onder de UAS-besturing uitdrukken zijn beschikbaar, bijvoorbeeld door de presynaptisch gelokaliseerde sensor Synaptophysin-GCaMP3 of de rode fluorescerende sensor van synaptische transmissie Synaptophysin-pHTomato20. Natuurlijk kan de verscheidenheid aan fluorescentie sensor eiwitten worden geïmplementeerd met behulp van het hierboven beschreven protocol.
Optische beeldvormingstechnieken worden in het algemeen beperkt door de temporele en ruimtelijke resolutie van het microscopische beeldverwervings systeem (bijv. een twee-fotorenmicroscoop) en de temporele resolutie van de sensor zelf (bijv. de kinetiek van de calcium sensor). Elektrofysiologische opnames, bijvoorbeeld met behulp van patch klem elektrofysiologie van somata van neuronen in het brein van Drosophila , bieden nog steeds een ongeëvenaarde temporele resolutie, maar zonder ruimtelijke precisie te bieden. Vanwege de specificiteit van de genexpressie in neuronen van belang gecombineerd met de subcellulaire lokalisatie van de sensor, kunnen optische beeldvormingstechnieken potentieel elektrofysiologische technieken aanvullen om neuronale plasticiteit te achterhalen die onderliggende leren en Geheugenvorming. De voortdurende vooruitgang in de ontwikkeling van fluorescentie sensoren zal wellicht de mogelijkheid bieden om sensor eiwitten te fuseren met snellere kinetiek of hogere signaal-ruis verhoudingen (bijv. GCaMP6 varianten23) met Synaptisch gelokaliseerde eiwitten zoals dHomer. Ook zullen recente vooruitgang bij het vaststellen van microscopische technieken met snellere acquisitie percentages of een hogere ruimtelijke resolutie van onschatbare waarde zijn bij het verder afstemmen van onze aanpak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Duitse Onderzoeksraad via het collaboratief onderzoekscentrum SFB 889 "mechanismen van sensorische verwerking" en de onderzoekseenheid voor 2705 "dissectie van een hersen circuit: structuur, plasticiteit en Gedragsfunctie van de Drosophila paddestoel lichaam ".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
- Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
- Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
- Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
- Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S.
- Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
- de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
- Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
- Fiala, A., Riemensperger, T. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. editors, edition.,R. .M. enzelandJ. .H. .B. yrne, 1, Academic Press. Oxford. 475-482 (2017).
- Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
- Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
- Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
- Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
- Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
- Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
- Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).
