Summary
Ici nous présentons un protocole avec lequel le calcium pré- et/ou postsynaptic peut être visualisé dans le contexte de l'apprentissage et de la mémoire de Drosophila. L'imagerie in vivo de calcium utilisant des capteurs de calcium synaptically localisés est combinée avec un paradigme olfactif classique de telle sorte que la plasticité synaptique sous-jacente à ce type d'apprentissage associatif peut être déterminée.
Abstract
Des décennies de recherche dans de nombreux organismes modèles ont conduit au concept actuel de plasticité synaptique sous-jacent à l'apprentissage et à la formation de la mémoire. Les changements induits par l'apprentissage dans la transmission synaptique sont souvent répartis dans de nombreux neurones et niveaux de traitement dans le cerveau. Par conséquent, des méthodes pour visualiser la plasticité synaptique dépendante de l'apprentissage à travers les neurones sont nécessaires. La mouche des fruits Drosophila melanogaster représente un organisme modèle particulièrement favorable pour étudier les circuits neuronaux sous-jacents à l'apprentissage. Le protocole présenté ici montre comment les processus sous-jacents à la formation de mémoires olfactives associatives, c'est-à-dire l'activité synaptique et leurs changements, peuvent être surveillés in vivo. En utilisant le large éventail d'outils génétiques disponibles dans Drosophila, il est possible d'exprimer spécifiquement des indicateurs de calcium génétiquement codés dans les populations cellulaires déterminées et même les cellules individuelles. En fixant une mouche en place, et en ouvrant la capsule de tête, il est possible de visualiser la dynamique du calcium dans ces cellules tout en fournissant des stimuli olfactifs. En outre, nous démontrons une configuration dans laquelle la mouche peut être soumise, simultanément, à des chocs électriques au corps. Cela fournit un système dans lequel les mouches peuvent subir un conditionnement olfactif classique - par lequel une odeur auparavant naïve est appris à être associée à la punition de choc électrique - en même temps que la représentation de cette odeur (et d'autres odeurs non formées) est observé dans le cerveau par microscopie à deux photons. Notre laboratoire a déjà signalé la génération de capteurs de calcium synaptically localisés, ce qui permet de confiner les signaux fluorescents de calcium aux compartiments pré- ou postsynaptiques. La microscopie à deux photons permet de résoudre spatialement les structures fines. Nous l'exemplifions en nous concentrant sur les neurones intégrant l'information du corps des champignons, un centre d'ordre supérieur du cerveau des insectes. Dans l'ensemble, ce protocole fournit une méthode pour examiner les connexions synaptiques entre les neurones dont l'activité est modulée à la suite de l'apprentissage olfactif.
Introduction
Déchiffrer où et comment l'information est acquise dans le cerveau par l'apprentissage et ensuite stocké comme mémoire constitue l'une des tâches les plus difficiles en neurosciences1. La recherche neuroscientifique a mené au concept d'un changement dans la transmission synaptique comme substrat neuronal qui sous-tend l'apprentissage et la formation de mémoire2,3. On suppose que, pendant l'apprentissage, les connexions synaptiques entre les ensembles neuronaux qui sont actifs pendant la perception d'un stimulus sont modifiées de telle sorte que leur modèle d'activité combiné peut être récupéré pendant le rappel de mémoire, instruisant ainsi future action comportementale4. Ces « cellules d'engramme » et leurs synapses sont souvent distribuées entre les régions du cerveau et les niveaux de traitement, ce qui rend difficile d'attribuer les changements observés dans la transmission synaptique à l'apprentissage d'une tâche ou d'un stimulus. Pour localiser et visualiser les changements synaptiques qui sont causalement liés à une tâche d'apprentissage spécifique, il faut un système modèle approprié qui permet de confiner précisément ces synapses.
Pour une telle entreprise, Drosophila melanogaster est particulièrement approprié parce qu'il combine la simplicité relative du cerveau, la richesse comportementale, et l'accessibilité expérimentale. Parmi les organismes modèles bien établis, Drosophila est situé entre le nématode C. elegans et les mammifères génétiquement traitables comme les souris en termes de complexité neuronale. Le nombre stéréotypé de neurones (300 euros) et le répertoire comportemental limité sont observés chez C. elegans. Les mammifères, d'autre part, ont des millions de neurones et la complexité comportementale stupéfiante. Le cerveau de la mouche des fruits est, avec ses 100 000 euros, des neurones significativement plus petits que le cerveau de la plupart des vertébrés, et beaucoup de neurones sont individuellement identifiables5. Pourtant, Drosophila démontrer un large éventail de comportements complexes, y compris une capacité à montrer l'apprentissage olfactif associatif robuste et la formation de la mémoire, d'abord décrit il ya 40 ans6. Au cours de cette procédure de conditionnement classique, les groupes de mouches sont soumis à une odeur comme le stimulus conditionné (CS)alors qu'ils reçoivent un choc électrique punissant comme le stimulus non conditionné (US). Une deuxième odeur (CS-) est alors présentée sans aucune punition. Par conséquent, les animaux apprennent à éviter l'odeur associée à la punition, qui peut être testé dans une situation de choix ultérieure entre les deux odeurs,CS et CS-. Les travaux de dissection du substrat neuronal sous-jacent à ce comportement dans Drosophila ont identifié les corps de champignons (MB) comme le site principal de l'"engramme"7,8,9,10 et, par conséquent, les circuits de cette région du cerveau a été et fait l'objet d'intenses recherches afin de découvrir la logique par laquelle un engramme de mémoire est acquis et stocké (récemment examiné en11,12).
Le Drosophila MB se compose de 2 000 neurones intrinsèques (cellules Kenyon) par hémisphère, organisés en projections axonales parallèles13. Les axones des neurones de projection olfactive sont étendus au protocerebra latéral et aux calyces de MB, le site principal d'entrée dendritique du MB et reçoivent l'entrée olfactive des lobes d'antenne. Le long faisceau parallèle d'axones des cellules de Kenyon constitue le pédoncule et les lobes. La plupart des cellules de Kenyon bifurquent formant des lobes horizontaux en tendant une garantie vers la ligne médiane du cerveau, et les lobes verticaux en prolongeant la deuxième projection collatérale dans la direction dorsale-antérieure. L'autre groupe de cellules Kenyon forme les lobes horizontaux13 du Mb où le processus d'apprentissage et la formation de mémoire à court terme ultérieure pourraient être localisés10. Les lobes MB reçoivent une entrée afférente et fournissent une production efferent, qui sont généralement limitées à des sous-régions compartimentées distinctes le long des axones de cellules Kenyon14,15,16. En particulier, les neurones d'entrée dopaminergiques afférents de MB ont été montrés pour mimériser la valeur-basée, par exemple, punitif, renforçant des effets dans l'apprentissage olfactif associatif15,17. Les neurones de sortie stéréotypiques et individuellement identifiables de MB des lobes de corps de champignon intègrent l'information à travers un grand nombre de cellules de Kenyon, ciblent les secteurs divers du cerveau et portent l'information appetitive ou aversive de comportement-instructive15 . Cette architecture neuronale a conduit à un concept d'organisation de l'engramme associatif. Les odeurs sont relativement précisément codées par des ensembles peu activés de cellules Kenyon. L'activité coïncidente de ces ensembles cellulaires Kenyon et la libération de dopamine - évoquée par des stimuli punissants - module la transmission des présynapses de cellules de Kenyon sur les neurones de sortie de MB de sorte que les animaux éviteront plus tard cette odeur particulière10 ,12. Nous utilisons cet engramme plutôt précisément défini et localisé comme un cas paradigmatique pour illustrer comment ces changements dépendants de l'apprentissage dans l'activité synaptique peuvent être déterminés et surveillés.
La valeur de Drosophila en tant que système modèle repose fortement sur la boîte à outils génétique inégalée qui permet d'exprimer des transgènes pour identifier, surveiller et contrôler les neurones uniques dans les circuits complexes18. L'avènement de techniques de surveillance de l'activité neuronale - comme l'imagerie calcique, discutée ici - a permis de déterminer les modèles d'activité neuronale en réponse à un stimulus spécifique. En combinant l'expression spécifique Gal4-conduite des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIs) avec la stimulation olfactive, on peut visualiser la dynamique de calcium odorante-évoquée des neurones d'intérêt19. Dans ce protocole, il est démontré qu'en associant davantage cette technique à un paradigme de conditionnement classique, il est possible d'examiner ces réponses olfactives dans le contexte de l'apprentissage. La plasticité induite par l'apprentissage peut être disséquée à l'aide d'ISGE qui sont non seulement localisées à un seul neurone spécifique, mais aussi à des sous-compartiments spécifiques d'un neurone. Pech et coll.20 ont établi une sélection d'outils qui permettent exactement cela. En ciblant GCaMP321 à la pré- ou la postsynapse - par liaison avec le vertébré Synaptophysin ou dHomer, respectivement20- la modulation différentielle de ces sites peut être distinguée. Cette localisation confère, dans ce contexte, un avantage par rapport à la plupart des GECI qui sont omniprésents présents dans tout le cytosol - par exemple, GCaMP22, GCaMP321, ou GCaMP623 - parce que cela signifie que les transitoires pré- et postsynaptiques peuvent être distingué de l'afflux intégré global de calcium qui se produit en raison de l'activation de neurone. Cela peut fournir des indices sur l'emplacement et les types de plasticité qui se produisent à la suite ou qui causent l'apprentissage et la formation de la mémoire. À titre d'exemple, le protocole fourni ici montre la valeur de cet outil dans le déchiffrement de la modulation des neurones de sortie MB au cours de l'apprentissage associatif olfactif en ciblant l'expression du capteur de calcium à seulement la postsynapse. En surveillant, au sein d'une mouche individuelle, l'activité odorante avant et après le conditionnement olfactif peut être établie entre une réponse naïve d'odeur et une réponse d'odeur apprise. Bien que fixées dans la même chambre d'imagerie, les mouches sont exposées à une sélection d'odeurs. Ensuite, ils reçoivent un protocole de conditionnement associatif aversif dans lequel l'une de ces odeurs est jumelée à un choc électrique (devenant leCS)et une autre odeur est présentée sans renfort (devenant le CS-). Enfin, les mouches sont à nouveau exposées aux mêmes odeurs que dans la première étape. La dynamique du calcium est observée à l'aide de la microscopie à deux photons.
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Protocol
1. Mouches des fruits transgéniques, Drosophila melanogaster
- Traverser les mouches femelles vierges et mâles (élevées à 25 oC dans une humidité relative de 60 % sur un cycle clair/sombre de 12 h) transportant les constructions Gal4 et UAS souhaitées25,respectivement, pour produire des mouches dans lesquelles des neurones d'intérêt spécifiques expriment un cycle génétiquement codé calcium.
- Age de la progéniture féminine de la croix ci-dessus jusqu'à ce qu'ils soient dans la gamme de 3-6 jours après l'eclosion. Les mouches femelles sont préférables en raison de leur taille légèrement plus grande.
2. Préparation de la mouche des fruits pour l'imagerie in vivo du calcium
- Sélectionnez une seule mouche femelle et anesthésiez sur la glace pour une durée de plus de 5 min.
- À l'aide de forceps fins, placez la mouche dans la chambre d'imagerie (démontrée à la figure 1c). Assurez-vous que le thorax et les jambes sont en contact avec les fils électriques dans le fond de la chambre et que la tête est à plat. Fixer la position de la mouche à l'aide d'un ruban adhésif transparent.
REMARQUE : Ce protocole nécessite une chambre sur mesure dans laquelle les mouches sont fixées, avec la capsule de tête accessible pour l'ouverture, et les mouches capables de recevoir des stimulations d'odeur aux antennes et des chocs électriques au thorax et aux jambes (figure 1). - À l'aide d'une lame de scalpel chirurgicale fixée à la poignée du scalpel (voir Tableau des matériaux),coupez une fenêtre dans le ruban adhésif autour de la tête de la mouche, laissant les antennes couvertes et seulement la partie la plus antérieure du thorax exposée.
- Entourez les côtés et l'arrière de la tête avec de la colle de durcissement à la lumière bleue, soigneusement manipulée à l'aide d'une goupille d'insecte tenue par des mâchoires concave-convexes. Définir la colle à l'aide d'une lampe LED électroluminescente bleue.
- Vérifiez que la colle est complètement réglé et effacer toute colle résiduelle non durcie de la surface dorsal de la tête de mouche.
- Appliquer une goutte de la solution24 de Ringer (voir Tableau des matériaux) pour couvrir la cuticule exposée de la tête.
- À l'aide d'un couteau à lame très fine, couper à travers la cuticule. Pour l'enlèvement le plus efficace de la cuticule, d'abord coupé à travers le postérieur de la tête en utilisant l'ocelli comme point de départ. Ensuite, couper de chaque côté, médial aux yeux, pour former un rabat de la cuticule qui peut être facilement arraché à l'aide de forceps.
- Enlever toute cuticule excessive qui peut bloquer la région du cerveau d'intérêt.
- Effacer soigneusement la surface dorsale de toute trachée à l'aide de forceps fines, évitant la perturbation du tissu cérébral lui-même. Retirez et actualisez la solution24 de Ringer (voir Tableau des matériaux) au besoin pour dégager la zone des débris tissulaires.
- Placez l'aiguille de livraison d'odeur hypodermique en position, à environ 1 cm de la tête de la mouche. Assurez-vous qu'il n'y a rien qui pourrait obstruer la livraison d'odeurs aux antennes.
- Au microscope, connectez la chambre d'imagerie au système de livraison d'odeurs par l'intermédiaire de l'aiguille de livraison d'odeurhypodermique.
- Pour permettre à la mouche de se remettre complètement de l'anesthésie et de la chirurgie, et de s'adapter au flux d'air, mettre en œuvre une période de repos de 10 min à ce stade.
3. Imagerie in vivo de calcium
- Utilisez un microscope multiphoton équipé d'un laser infrarouge et d'un objectif d'immersion dans l'eau (voir Tableau des matériaux),installé sur une table à vibrations isolées. Pour la visualisation des indicateurs de calcium à base de GFP, accordez le laser à une longueur d'onde d'excitation de 920 nm et installez un filtre de passage de bande GFP.
- À l'aide du bouton d'ajustement Z grossier, scannez l'axe Z du cerveau et localisez la région du cerveau d'intérêt. Utilisez la fonction culture pour concentrer la numérisation sur cette zone seulement pour minimiser le temps d'analyse, et pour faire pivoter la vue d'analyse de telle sorte que l'antérieur de la tête est orienté vers le bas.
- Ajuster la taille du cadre à 512 x 512 px, la vitesse d'analyse à 4 Hz, et la région de balayage (dans la dimension Y) de sorte que les neurones d'intérêt sont couverts.
4. Visualisation des transitoires de calcium odorants par le conditionnement olfactif
- Utilisez un système de livraison d'odeurs19,26 qui peut fournir plusieurs stimuli d'odeur d'une manière temporellement précise.
- Utilisez un ordinateur supplémentaire pour contrôler l'appareil et pour communiquer avec le logiciel de microscope d'imagerie pour coordonner les stimulations d'odeur avec la capture d'image pendant les expériences.
- Lancer un paquet macro préprogrammé capable de relier le logiciel d'acquisition d'images et le programme de livraison d'odeurs (p. ex., un paquet macro VBA installé dans le logiciel de contrôle du microscope, voir Tableau des matériaux) qui répond à une entrée externe par l'introduction d'un protocole de livraison d'odeurs dans un programme distinct).
- Commencez la mesure en surveillant les transitoires de calcium « pré-formation »/naïves de calcium évoqués par les odeurs à une résolution de 512 x 512 px et un taux d'image de 4 Hz. Délivrez un stimulus d'odeur de 2,5 s flanqué d'une acquisition d'image supplémentaire pour 6,25 s début d'odeur précédente (pour établir un F 0 valeur de base) et 12,5 s après compensation d'odeur. Répétez cette opération avec un deuxième odorant, puis avec un troisième odorant.
- Continuer 3 min après cette mesure avec le conditionnement classique ("entraînement") la mouche.
- Sélectionnez l'une des odeurs présentées dans la phase de « pré-formation » pour devenir l'odeur CSet une autre pour devenir l'odeurCS. Présentez l'odeur CSà l'aide du système de livraison d'odeurs contrôlé par ordinateur pour 60 s aux côtés de douze chocs électriques de 90 V.
- Après une pause de 60 s, présentez le CS- odeur seule pour 60 s. Utiliser comme odorants 4-methylcyclohexanol et 3-octanol. Ne présentez pas le troisième odorant (p. ex. 1-octen-3-ol) au cours de cette formation puisqu'il n'est utilisé comme contrôle qu'avant (étape 4.2.) et après (étape 4.4) la phase d'entraînement.
- Mesurer à nouveau les transitoires de calcium « post-formation » évoqués par les odeurs en répétant le protocole de stimulation des odeurs « pré-formation » (étape 4.2.) 3 min après avoir terminé la phase d'entraînement (étape 4.3).
REMARQUE : Le moment de cette étape doit refléter le moment d'intérêt après la formation de la mémoire (p. ex., effectuer cette étape 3-4 min après l'étape de conditionnement pour étudier la mémoire à court terme). Typiquement, les mouches peuvent survivre pendant plusieurs heures dans cette préparation. - Enregistrer les fichiers d'imagerie dans un format approprié (p. ex., Tiff) pour une analyse d'image ultérieure.
5. Analyse d'image
- Pour analyser des images, ouvrez des fichiers Tiff (ou similaires) dans le logiciel d'analyse d'images tel que Fidji27.
- Alignez les piles à l'aide d'un algorithme de correction de mouvement pour assurer un mouvement minimal dans les directions X et Y. Jetez tous les enregistrements qui montrent un fort mouvement dans l'axe Z.
- Sélectionnez l'outil du logiciel utilisé pour marquer une région d'intérêt (ROI) autour de la zone qui doit être examinée. Cela devrait être aussi précis que possible pour limiter l'influence de la fluorescence de fond.
- Utilisez l'outil respectif du logiciel pour extraire les données d'intensité de fluorescence temporelle sous forme de fichiers de données à partir du retour sur investissement sélectionné, de sorte qu'une valeur est générée pour chaque image de l'enregistrement.
- Ouvrez les données à l'aide d'un programme d'analyse de données pour calculer les valeurs F/F0 pour chaque trace d'odeur. F0 - fluorescence moyenne dans les 2 s avant l'odeur début. La différence entre la fluorescence brute dans un cadre donné et F0. À partir de ces valeurs, calculez une valeur F/F0 pour chaque image qui peut être tracée contre le temps pour refléter la fluorescence relative tout au long de la période de stimulation des odeurs.
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Representative Results
Un exemple d'images acquises avec le protocole ci-dessus peut être vu dans la figure 2. d (en) Homer-GCaMP3 est exprimé dans un neurone de sortie MB dont les dendrites innervate le compartiment 1 de la MB -lobe (le neurone est appelé MVP228,29) et est génétiquement ciblée en utilisant la ligne split-Gal4 MB112C16. En outre, démontré est la différence dans la localisation subcellulaire d'un cytosolic et l'indicateur de calcium post-synaptically localisé. En comparant les figures 2a et la figure 2f, on peut clairement observer l'expression spécifique et compartimentée du capteur dHomer-GCaMP314 - sans expression dans les compartiments axonaux du neurone, et un signal ponctué visible dans le compartiment dendritique. Clair - bien que l'amplitude inférieure - les réponses d'odeur peuvent être vus chez les mouches exprimant dHomer-GCaMP3 (Figure 2, panneaux inférieurs), par rapport aux mouches exprimant cytosolique GCaMP6f23 (Figure 2, panneaux supérieurs). Ceci démontre que l'outil est efficace pour la visualisation des réponses olfactives au niveau de la postsynapse, et, par conséquent, fournit une spécificité supplémentaire à l'examen des circuits neuronaux sous-jacents, dans ce cas, l'encodage des odeurs et l'apprentissage olfactif.
Un exemple de ce dernier peut être vu dans la figure 3. Dans cette expérience, dHomer-GCaMP3 est exprimé comme dans la figure 2 - dans le corps champignon de sortie neurone MVP2. Il s'agit d'un neurone connu pour être modulé par l'apprentissage olfactif de telle sorte que la dépression présynaptique à la suite de conditionnement olfactif aversif se reflète dans une réponse postsynaptique décédé à l'odeur entraînée28,29 et ici un La confirmation de ce résultat est montrée utilisant ce protocole in vivo d'imagerie de calcium. Les traces de calcium montrées dans la figure 3 représentent des données exemplaires d'une mouche individuelle. Notez que le niveau de bruit et l'amplitude peuvent varier d'une préparation à l'autre (p. ex., comparer la figure 2e et la figure 3c-e). Par conséquent, une comparaison à l'intérieur des animaux de la pré- par rapport à la formation post-formation fournit un moyen de tenir compte de la variabilité interindividuelle. Bien sûr, le protocole est approprié pour être transféré à l'imagerie d'autres neurones d'intérêt.
Figure 1 : Construction d'une chambre de montage et préparation d'une mouche pour l'imagerie. (a) Étapes pour la construction de la chambre de montage de mouche. La base est formée d'une lame de microscope standard (1) recouverte d'une fine maille en plastique (2). Deux fils électriques portant des charges opposées (3) sont collés à la glissière de chaque côté. Les fils sont dépouillés et pliés pour traverser la glissière (4) en parallèle les uns avec les autres, mais pas en contact. Des couches de ruban adhésif clair (5) sont ajoutées jusqu'à atteindre la hauteur d'une mouche (environ 1 mm). Un canal est coupé à travers le ruban verticalement (6), d'environ 1 mm de large pour s'adapter à la largeur d'une mouche. Une plate-forme surélevée faite de ruban adhésif clair (7) est construite juste au-dessus des fils électriques pour former un oreiller pour la tête de la mouche tandis que le thorax est au-dessus des fils. ( b) Illustration schématique de la mouche placée sous le microscope à deux photons. La stimulation des odeurs est obtenue par une aiguille hypodermique placée devant la tête de la mouche (insérée à travers le canal dans la bande (6) et sur le dessus de la plate-forme (7) pour diriger les odeurs vers les antennes). (c)--h) Fixation et ouverture de la tête de mouche. (c) Une mouche fixée à l'intérieur de la chambre d'imagerie, à l'intérieur du canal (barre d'échelle de 1 mm) et maintenue en place par un nouveau morceau de ruban adhésif clair sur toute la mouche. d) Vue agrandie de la mouche en position. Barre d'échelle de 0,1 mm (e) Une fenêtre est coupée dans le ruban adhésif autour de la tête de la mouche. (f) La tête est encore fixée avec de la colle bleue de traitement de la lumière. (g) La capsule de tête est recouverte de la solution de Ringer et ouverte. (h) Préparation complète du cerveau avec un excès de tissu et de trachée (tissu blanc visible dans (g) enlevé). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Calcium postsynaptically localisé visualisé utilisant dHomer-GCaMP3. (a) Images de microscopie confocales montrant l'expression de GCaMP6f (i) localisés cytosoliquement et postsynaptically localisés dHomer-GCaMP3 (ii) dans le neurone de sortie MB MVP2. La flèche verte indique la sous-région 1 du lobe MB. Barres d'échelle de 15 m. (b)-d) Images capturées à l'aide d'une microscopie d'excitation à deux photons des génotypes ci-dessus, montrant la fluorescence in vivo des capteurs de calcium respectifs. (b) F0 (fluorescence de base) images, démontrées comme une projection d'intensité moyenne des 2 s avant l'odeur. Barres d'échelle de 10 m. (c) Imagesd'odeurs F (fluorescence pendant la stimulation des odeurs), démontrées comme une projection moyenne d'intensité au cours de la période de réponse aux odeurs (2,5 s). (d) Images F générées par la soustraction de l'image F0 de l'imaged'odeur F, pour montrer le signal réel de réponse d'odeur. (e) Traces F/F0 des mouches ci-dessus des génotypes respectifs par une stimulation d'odeur (barre grise). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Plasticité postsynaptique induite par l'apprentissage visualisée via dHomer-GCaMP3. (a) Schéma des protocoles de conditionnement utilisés dans ces expériences. Les réponses naïves d'odeur, avant que le conditionnement (« pré ») soient mesurées en premier. Ensuite, chaque mouche connaît l'un des trois protocoles de conditionnement possibles: "Paired", où une odeur (CS)est jumelé avec des chocs électriques (US) et un autre (CS-) n'est pas renforcée; "Odeurs seulement", où seules les odeurs sont présentées, à la fois sans renforcement, pour contrôler les effets d'exposition aux odeurs; et "Shocks only", où seuls les chocs électriques sont présentés sans aucun stimulus d'odeur, pour contrôler les effets d'exposition aux chocs. Après cette phase de conditionnement, les mouches sont ensuite exposées à nouveau aux odeurs «Pré» pour tester l'altération de l'activité évoquée par les odeurs (« Post »). (b) Un exemple de modulation de réponse d'odeur en raison de la présentation appariée d'odeur/choc. Une forte suppression de la réponse à l'odeur CS peut être observée dans la sous-région no 1 (ligne pointillée). (c)-(e) Traces de réponse d'odeur de la même mouche que dans (b), montrant que cet effet de suppression n'est observé que dans le cas de l'odeur entraînée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La dissection des circuits neuronaux sous-jacents à l'apprentissage et à la mémoire est un objectif important dans le domaine des neurosciences. L'accessibilité génétique de Drosophila et l'ampleur et la facilité des tests comportementaux en font un outil idéal pour étudier de tels phénomènes. Ici, une méthode est présentée avec laquelle il est possible de visualiser, au sein des mouches individuelles, la modulation qui se produit à un niveau subcellulaire à la suite du conditionnement olfactif. En réalisant à la fois la visualisation pré-formation et post-formation de la dynamique calcique odorante, d'abord établie par notre groupe17, il est possible d'établir une comparaison directe, à l'intérieur de l'animal entre les réponses naïves et apprises odeur et, par conséquent,, examiner la plasticité des neurones d'intérêt. Cela confère un avantage à ce protocole par rapport aux évaluations en masse (utilisées dans le conditionnement olfactif classique) parce que les États pré et post-formation peuvent être évalués quantitativement pour les individus, ce qui permet de déterminer les états inter-individuels Variabilité. En outre, la procédure de formation effectuée directement sous le microscope est en grande partie équivalente au paradigme classique de conditionnement olfactif généralement utilisé dans les expériences comportementales et n'implique pas la stimulation optogénétique artificielle des neurones. Bien sûr, la manipulation des petites mouches et l'ouverture minutieuse de la capsule de la tête sans endommager le tissu cérébral tout en gardant les organes sensoriels intacts nécessite un niveau d'expertise qui peut être acquise par une formation méticuleuse et répétée, un peu comme l'étendue vue dans physiologiques telles que l'électrophysiologie.
En outre, le potentiel d'utiliser des indicateurs de calcium localisés pour examiner la plasticité au niveau neuronal unique est démontré - ajoutant une plus grande précision à la dissection du circuit neuronal. Ceci est illustré en montrant une dépression induite par l'apprentissage d'une réponse postsynaptique dans un neurone de sortie MB bien étudié28,29. Des souches de Drosophila exprimant une variété de capteurs de fluorescence synaptically localisés sous le contrôle de la SAMU sont disponibles, par exemple, exprimant le capteur présynaptically localisé Synaptophysin-GCaMP3 ou le capteur fluorescent rouge de synaptique transmission Synaptophysin-pHTomato20. Bien sûr, la variété de protéines capteur de fluorescence peut être mis en œuvre en utilisant le protocole décrit ci-dessus.
Les techniques d'imagerie optique sont en général limitées par la résolution temporelle et spatiale du système d'acquisition d'images microscopiques (p. ex., un microscope à deux photons) et par la résolution temporelle du capteur lui-même (p. ex., la cinétique du capteur de calcium). Les enregistrements électrophysiologiques, par exemple, utilisant l'électrophysiologie de pince de correction de somata des neurones dans le cerveau de Drosophila, offrent toujours une résolution temporelle inégalée, mais sans fournir n'importe quelle précision spatiale. En raison de la spécificité de l'expression génique dans les neurones d'intérêt combinée avec la localisation subcellulaire du capteur, les techniques d'imagerie optique peuvent potentiellement compléter les techniques électrophysiologiques pour découvrir la plasticité neuronale sous-jacente l'apprentissage et la formation de la mémoire. Les progrès continus dans le développement de capteurs de fluorescence fourniront peut-être la possibilité de fusionner les protéines du capteur avec une cinétique plus rapide ou des rapports signal-bruit plus élevés (p. ex., variantes GCaMP623) avec des protéines synaptisées localisées comme dHomer. En outre, les progrès récents dans l'établissement de techniques microscopiques avec des taux d'acquisition plus rapides ou une résolution spatiale plus élevée s'avéreront inestimables dans l'ajustement ultérieur de notre approche.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le Conseil allemand de recherche par l'intermédiaire du Centre de recherche collaboratif SFB 889 "Mécanismes of Sensory Processing" et l'Unité de recherche POUR 2705 "Dissection d'un circuit cérébral: Structure, Plasticité et fonction comportementale de la Corps de champignons Drosophila".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
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