Summary

В Vivo оптические изображения кальция обучения индуцированной синаптической пластичности в Drosophila меланогастер

Published: October 08, 2019
doi:

Summary

Здесь мы представляем протокол, с которым до и / или postsynaptic кальция могут быть визуализированы в контексте drosophila обучения и памяти. In vivo изображения кальция с использованием синапитично локализованных датчиков кальция в сочетании с классической обонятельной парадигмы кондиционирования, таким образом, что синаптической пластичности, лежащей в основе этого типа ассоциативного обучения может быть определена.

Abstract

Десятилетия исследований во многих модельных организмах привели к нынешней концепции синаптической пластичности, лежащей в основе обучения и формирования памяти. Обучение индуцированных изменений в синаптической передачи часто распространяются по многим нейронам и уровни обработки в головном мозге. Таким образом, методы визуализации обучения зависимых синаптической пластичности через нейроны необходимы. Плодовая муха Drosophila melanogaster представляет собой особенно благоприятный модельный организм для изучения нейрональных схем, лежащих в основе обучения. Представленный здесь протокол демонстрирует, каким образом процессы, лежащие в основе формирования ассоциативных обонятельных воспоминаний, т.е. синаптической активности и их изменений, могут контролироваться in vivo. Используя широкий спектр генетических инструментов, доступных в Drosophila, можно специально выразить генетически закодированные показатели кальция в определенных популяций клеток и даже одиночных клеток. Фиксируя муху на месте, и открытие капсулы головы, можно визуализировать динамику кальция в этих клетках, обеспечивая обонятельные стимулы. Кроме того, мы демонстрируем настройку, в которой муха может быть подвергнута, одновременно, электрическим током к телу. Это обеспечивает систему, в которой мухи могут пройти классический обонятельный кондиционирования – в котором ранее наивный запах научился быть связаны с электрическим током наказания – в то же время, как представление этого запаха (и другие неподготовленные запахи) является наблюдается в головном мозге с помощью двухфотонной микроскопии. Наша лаборатория ранее сообщала о генерации синаптически локализованных датчиков кальция, что позволяет ограничить флуоресцентные сигналы кальция до или постсинаптические отсеки. Двухфотонная микроскопия позволяет пространственно разрешать мелкие конструкции. Мы иллюстрируем это, сосредоточив внимание на нейронах, интегрирующих информацию из грибного тела, центра высшего порядка мозга насекомых. В целом, этот протокол предоставляет метод для изучения синапических связей между нейронами, активность которых модулируется в результате обонятельного обучения.

Introduction

Расшифровка того, где и как информация приобретается в мозге путем обучения и впоследствии хранится в качестве памяти представляет собой одну из самых сложных задач в неврологии1. Нейронаучные исследования привели к концепции изменения в синаптической передачи в качестве нейронального субстрата, который лежит в основе обучения и формирования памяти2,3. Предполагается, что во время обучения синаптические связи между нейрональными ансамблями, которые активны во время восприятия стимула, становятся модифицированными такимобразом, что их комбинированная активность может быть извлечена во время отзыва памяти, тем самым инструктируя будущее поведенческое действие4. Эти “энграммные клетки” и их синапсы часто распределены по регионам мозга и уровням обработки, что затрудняет присвоение наблюдаемых изменений в синаптической передаче изучению задачи или стимула. Для локализации и визуализации тех синапических изменений, которые причинно связаны с конкретной задачей обучения, нужна соответствующая модельная система, позволяющая точно сограничировать эти синапсы.

Для такого начинания, Drosophila melanogaster особенно подходит, потому что он сочетает в себе относительную простоту мозга, поведенческое богатство, и экспериментальной доступности. Среди устоявшихся модельных организмов, Drosophila находится между нематод C. elegans и генетически tractable млекопитающих, как мыши с точки зрения нейронной сложности. Стереотипное количество нейронов (300 евро) и ограниченный поведенческий репертуар наблюдаются в C. elegans. Млекопитающие, с другой стороны, имеют миллионы нейронов и ошеломляющей поведенческой сложности. Мозг плодовой мухи, с его 100000 фунтов, нейроны значительно меньше, чем мозг большинства позвоночных, и многие из нейронов индивидуально идентифицируемых5. Тем не менее, Drosophila продемонстрировать широкий спектр сложных моделей поведения, в том числе способность проявлять надежное ассоциативное обонятельное обучение и формирование памяти, впервые описано более 40 лет назад6. В ходе этой классической процедуры кондиционирования, группы мух подвергаются запаху в качестве условного стимула (CS)в то время как они получают наказание электрическим током, как безусловный стимул (США). Второй запах (CS– )затем представлен без какого-либо наказания. Таким образом, животные учатся избегать запаха, связанного с наказанием, которое может быть проверено в последующей ситуации выбора между двумя запахами, CSи CS. Работа по вскрытию нейронального субстрата, лежащего в основе такого поведения в Дрософиле, выявила грибные тела (МБ) в качестве основного места “энграммы”7,8,9,10 и, следовательно, схема этой области мозга была и является предметом интенсивных исследований, с тем чтобы раскрыть логику, с помощью которой энграмма памяти приобретается и хранится (недавно рассмотрены в11,12).

Дрозофила МБ состоит из 2000 внутренних нейронов (клеток Кеньона) на полушарие, организованных в параллельных аксональных проекциях13. Аксоны обонятельных проекционных нейронов распространяются на боковые протоцеребры и мБ калеки, основной дендритный вхоломестоц МБ и получают обонятельный вход из антенных долей. Длинный параллельный аксоны пучок клеток Кеньон составляют peduncle и долей. Большинство клеток Кеньона раздвоените, образуя горизонтальные доли, расширяя одно обеспечение к средней линии мозга, и вертикальные доли, расширяя второе второе секондирование в направлении дорсал-переднего. Другая группа клеток Кеньона образует горизонтальные доли13 МБ, где процесс обучения и последующее кратковременное формирование памяти могут быть локализованы10. МБ доли получают afferent входив и обеспечивают efferent выход, оба из которых типично ограничены к отдельно расчастью sub-области вдоль аксонов клетки Kenyon14,15,16. В частности, афферентные дофаминергические mb входные нейроны были показаны посредничать на основе стоимости, например, карательные, усиливающие эффекты в ассоциативном обонятельном обучении15,17. Стереотипные и индивидуально идентифицируемые эфферентные нейроны выхода МБ из долей грибного тела интегрируют информацию в большом количестве клеток Кеньона, нацелены на различные области мозга и несут поведение-поучительную аппетитную или аверсивную информацию15 . Эта нейрональная архитектура привела к концепции организации ассоциативной энграммы. Одоры относительно точно кодируются редко активированными ансамблями клеток Кеньона. Совпадение деятельности этих кеньон клеточных ансамблей и выпуск допамина – вызванные наказанием стимулов – модулирует передачу из Кеньон клетки presynapses на выброс нейронов МБ таким образом, что животные будут впоследствии избежать этого конкретногозапаха 10 ,12. Мы используем эту довольно точно определенную и локализованную энграмму в качестве парадигматического случая, чтобы проиллюстрировать, как можно определить и контролировать эти обучающие изменения в синаптической активности.

Значение Drosophila как модельная система сильно опирается на непревзойденный генетический инструментарий, который позволяет выразить трансгенов для выявления, мониторинга и контроля отдельных нейронов в сложных схемах18. Появление методов мониторинга нейронной активности – таких, как изображения кальция, обсуждается здесь – позволили для определения нейронной активности моделей в ответ на конкретный стимул. Комбинируя специфические Gal4-управляемые выражения генетически закодированных индикаторов кальция (GECIs) с обонятельной стимуляцией, можно визуализировать вызванную запахом динамику кальция нейронов, представляющих интерес19. В этом протоколе показано, что путем дальнейшего соединения этой техники с классической парадигмой кондиционирования, можно изучить эти обонятельные ответы в контексте обучения. Обучение индуцированной пластичности может быть дополнительно вскрыты с помощью GECIs, которые не только локализованы для одного конкретного нейрона, но и для конкретных subcompartments нейрона. Pech et al.20 создали подборку инструментов, которые позволяют именно это. Ориентируясь gCaMP321 либо до или postsynapse – через связь с позвоночных Synaptophysin или dГомер, соответственно20– дифференциальной модуляции этих сайтов можно отличить. Эта локализация предоставляет, в этом контексте, преимущество перед большинством GECIs, которые повсеместно присутствуют во всем цитозоле – например, GCaMP22, GCaMP321, или GCaMP623 – потому что это означает, что до и постсинаптических переходных может быть отличается от общего интегрированного притока кальция, который происходит в результате активации нейронов. Это может дать подсказки о местоположении и типах пластичности, которые возникают в результате или которые вызывают обучение и формирование памяти. В качестве примера, протокол, представленный здесь показывает значение этого инструмента в расшифровке модуляции МБ выходных нейронов во время обонятельного ассоциативного обучения, ориентируясь на выражение датчика кальция только postsynapse. Путем контролировать, внутри индивидуальная муха, запах-вызванная деятельность перед и после обонятельного кондиционирования сразу сравнение можно нарисовать между наивным реакцией запаха и выученным реакцией запаха. В то время как фиксированные в той же камере изображения, мухи подвергаются выбор запахов. Затем они получают аверсивный ассоциативный протокол кондиционирования, в котором один из этих запахов в паре с электрическим током (становясь CS)и другой запах представлен без подкрепления (становится CS). Наконец, мухи снова подвергаются тем же запахам, что и на первом этапе. Динамика кальция наблюдается с помощью двухфотонной микроскопии.

Protocol

1. Трансгенные плодовые мушки, Drosophila melanogaster Крест женских девственниц и самцов мух (поднятые при 25 градусах Цельсия при 60% относительной влажности на 12 ч светло/темный цикл), несущих желаемый Gal4 и UAS строит25, соответственно, для производства мух, в которых конкретны?…

Representative Results

Пример изображений, полученных с помощью вышеуказанного протокола, можно увидеть на рисунке 2. г Гомер-GCaMP3 выражается в МБ выход ногой нейрон, дендриты которого inendvate отсек 1 из MB-lobe (нейрон называется MVP228,29) и генетиче…

Discussion

Вскрытие нейронной схемы, лежащей в основе обучения и памяти, является важной целью в области неврологии. Генетическая доступность дрозофилы и широта и простота поведенческого тестирования делают это идеальным инструментом для исследования таких явлений. Здесь представлен мето?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Германским исследовательским советом через Совместный исследовательский центр SFB 889 “Механизмы сенсорной обработки” и научно-исследовательский отдел для 2705 “Рассечение цепи мозга: структура, пластичность и поведенческая функция Дрозофила Грибное тело»…

Materials

1-Octen-3-ol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA O5284 Chemical used as odorant
3-Octanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 218405 Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 153095 Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape Tesa SE, Norderstedt, Germany Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 10053-09 Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 11412-11 Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany 4665120 1.20x40mm
Insect Minutien pins Fine Science Tools, North Vancouver, Canada 26002-10 Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK 953683 Blue light-curing glue
Microscope slide Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany 0656.1 Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA M8410 Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany 421452-9900-000 Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution n.a. n.a. 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA 72-1551 5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade Swann-Morton, Sheffield, UK 0303 Product No. 11
Surgical scalpel handle Swann-Morton, Sheffield, UK 0907 Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger
from the odor-delivery device and the electric shock
application device (power supply) to interact with the
ZEN software from Zeiss that controls the microscope.
Custom-written and available upon request n.a. n.a.

References

  1. Poo, M. M., et al. What is memory? The present state of the engram. BMC Biology. 14, 40 (2016).
  2. Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  3. Takeuchi, T., Duszkiewicz, A. J., Morris, R. G. The synaptic plasticity and memory hypothesis: encoding, storage and persistence. Philosophical Transactions of the Royal Society London B: Biological Sciences. 369 (1633), (2013).
  4. Josselyn, S. A., Frankland, P. W. Memory Allocation: Mechanisms and Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 389-413 (2018).
  5. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).
  6. Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 708-712 (1974).
  7. Heisenberg, M., Borst, A., Wagner, S., Byers, D. Drosophila mushroom body mutants are deficient in olfactory learning. Journal of Neurogenetics. 2 (1), 1-30 (1985).
  8. de Belle, J. S., Heisenberg, M. Associative odor learning in Drosophila abolished by chemical ablation of mushroom bodies. Science. 263 (5147), 692-695 (1994).
  9. Gerber, B., Tanimoto, H., Heisenberg, M. An engram found? Evaluating the evidence from fruit flies. Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 737-744 (2004).
  10. Fiala, A., Riemensperger, T., editors, e. d. i. t. i. o. n. .. ,. R. .. M. e. n. z. e. l. a. n. d. J. .. H. .. B. y. r. n. e. ,. Localization of a memory trace: aversive associative olfactory learning and short-term memory in Drosophila. In: Learning and Memory: A Comprehensive Reference. 1, 475-482 (2017).
  11. Cognigni, P., Felsenberg, J., Waddell, S. Do the right thing: neural network mechanisms of memory formation, expression and update in Drosophila. Current Opinion in Neurobiology. 49, 51-58 (2018).
  12. Hige, T. What can tiny mushrooms in fruit flies tell us about learning and memory. Neuroscience Research. 129, 8-16 (2018).
  13. Aso, Y., Grübel, K., Busch, S., Friedrich, A. B., Siwanowicz, I., Tanimoto, H. The mushroom body of adult Drosophila characterized by GAL4 drivers. Journal of Neurogenetics. 23 (1-2), 156-172 (2009).
  14. Pech, U., Pooryasin, A., Birman, S., Fiala, A. Localization of the contacts between Kenyon cells and aminergic neurons in the Drosophila melanogaster brain using SplitGFP reconstitution. Journal of Comparative Neurology. 521 (17), 3992-4026 (2013).
  15. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, (2014).
  16. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, (2014).
  17. Riemensperger, T., Völler, T., Stock, P., Buchner, E., Fiala, A. Punishment prediction by dopaminergic neurons in Drosophila. Current Biology. 15 (21), 1953-1960 (2005).
  18. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).
  19. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  20. Pech, U., Revelo, N. H., Seitz, K. J., Rizzoli, S. O., Fiala, A. Optical dissection of experience-dependent pre- and postsynaptic plasticity in the Drosophila brain. Cell Reports. 10 (12), 2083-2095 (2015).
  21. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
  22. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noize Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  23. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  24. Estes, P. S., Roos, J., vander Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5443-5456 (1996).
  25. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  26. Dipt, S., Riemensperger, T., Fiala, A. Optical calcium imaging using DNA-encoded fluorescence sensors in transgenic fruit flies, Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 1071, 195-206 (2014).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Hige, T., Aso, Y., Modi, M. N., Rubin, G. M., Turner, G. C. Heterosynaptic Plasticity Underlies Aversive Olfactory Learning in Drosophila. Neuron. 88 (5), 985-998 (2015).
  29. Owald, D., et al. Activity of defined mushroom body output neurons underlies learned olfactory behavior in Drosophila. Neuron. 86 (2), 417-427 (2015).

Play Video

Cite This Article
Hancock, C. E., Bilz, F., Fiala, A. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (152), e60288, doi:10.3791/60288 (2019).

View Video