Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem vor- und/oder postsynaptisches Kalzium im Kontext des Drosophila-Lernens und -Gedächtnisses visualisiert werden kann. In vivo Kalzium-Bildgebung mit synaptisch lokalisierten Kalziumsensoren wird mit einem klassischen olfaktorischen Konditionierungsparadigma kombiniert, so dass die synaptische Plastizität, die dieser Art des assoziativen Lernens zugrunde liegt, bestimmt werden kann.
Abstract
Jahrzehntelange Forschung in vielen Modellorganismen hat zu dem aktuellen Konzept der synaptischen Plastizität geführt, die dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt. Lerninduzierte Veränderungen in der synaptischen Übertragung sind oft auf viele Neuronen und Ebenen der Verarbeitung im Gehirn verteilt. Daher sind Methoden zur Visualisierung lernabhängiger synaptischer Plastizität über Neuronen hinweg erforderlich. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster stellt einen besonders günstigen Modellorganismus dar, um neuronale Schaltkreise zu untersuchen, die dem Lernen zugrunde liegen. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt, wie die Prozesse, die der Bildung assoziativer olfaktorischer Erinnerungen zugrunde liegen, d.h. synaptische Aktivität und deren Veränderungen, in vivo überwacht werden können. Mit hilfe der breiten Palette genetischer Werkzeuge, die in Drosophilaverfügbar sind, ist es möglich, genetisch kodierte Kalziumindikatoren in bestimmten Zellpopulationen und sogar Einzelzellen gezielt auszudrücken. Durch die Fixierung einer Fliege an Ort und Stelle und das Öffnen der Kopfkapsel ist es möglich, die Kalziumdynamik in diesen Zellen zu visualisieren und gleichzeitig olfaktorische Reize zu liefern. Zusätzlich zeigen wir eine Einrichtung, bei der die Fliege gleichzeitig elektrischen Stößen auf den Körper ausgesetzt werden kann. Dies bietet ein System, in dem Fliegen klassische olfaktorische Konditionierung enden können - wobei ein zuvor naiver Geruch gelernt wird, mit Elektroschock-Strafe in Verbindung gebracht zu werden - zur gleichen Zeit wie die Darstellung dieses Geruchs (und anderer ungeübter Gerüche) im Gehirn mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet. Unser Labor hat bereits über die Erzeugung synaptisch lokalisierter Kalziumsensoren berichtet, die es ermöglichen, die fluoreszierenden Calciumsignale auf prä- oder postsynaptische Kompartimente zu beschränken. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie bietet eine Möglichkeit, feine Strukturen räumlich aufzulösen. Wir veranschaulichen dies, indem wir uns auf Neuronen konzentrieren, die Informationen aus dem Pilzkörper integrieren, einem Zentrum höherer Ordnung des Insektenhirns. Insgesamt bietet dieses Protokoll eine Methode, um die synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen zu untersuchen, deren Aktivität als Ergebnis des olfaktorischen Lernens moduliert wird.
Introduction
Die Entschlüsselung, wo und wie die Informationen durch Lernen im Gehirn erfasst und anschließend als Gedächtnis gespeichert werden, stellt eine der schwierigsten Aufgaben in der Neurowissenschaft1dar. Neurowissenschaftliche Forschung hat zum Konzept einer Veränderung der synaptischen Übertragung als neuronales Substrat geführt, das dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegt2,3. Es wird vermutet, dass während des Lernens synaptische Verbindungen zwischen neuronalen Ensembles, die während der Wahrnehmung eines Stimulus aktiv sind, so verändert werden, dass ihr kombiniertes Aktivitätsmuster während des Gedächtnisabrufs abgerufen werden kann, wodurch zukünftige Verhaltensaktion4. Diese "Engrammzellen" und ihre Synapsen sind oft über Hirnregionen und Verarbeitungsebenen verteilt, was es schwierig macht, beobachtete Veränderungen in der synaptischen Übertragung dem Erlernen einer Aufgabe oder eines Stimulus zuzuordnen. Um die synaptischen Veränderungen zu lokalisieren und zu visualisieren, die kausal mit einer bestimmten Lernaufgabe verbunden sind, braucht man ein geeignetes Modellsystem, das es ermöglicht, diese Synapsen präzise einzubeschränken.
Für ein solches Unterfangen eignet sich Drosophila melanogaster besonders, weil es relative Einfachheit des Gehirns, Verhaltensreichtum und experimentelle Zugänglichkeit kombiniert. Unter den etablierten Modellorganismen liegt Drosophila zwischen dem Nematoden C. elegans und genetisch beweglichen Säugetieren wie Mäusen in Bezug auf die neuronale Komplexität. Die stereotype Anzahl der Neuronen (300) und das begrenzte Verhaltensrepertoire werden in C. elegansbeobachtet. Säugetiere hingegen haben Millionen von Neuronen und eine erstaunliche Verhaltenskomplexität. Das Gehirn der Fruchtfliege ist mit seinen 100.000 Us-Litern deutlich kleiner als die Gehirne der meisten Wirbeltiere, und viele der Neuronen sind individuell identifizierbar5. Dennoch zeigt Drosophila ein breites Spektrum komplexer Verhaltensweisen, einschließlich der Fähigkeit, robustes assoziatives olfaktorisches Lernen und Gedächtnisbildung zu zeigen, das erstmals vor über 40 Jahren beschrieben wurde6. Im Rahmen dieses klassischen Konditionierungsverfahrens werden Fliegengruppen einem Geruch als konditionierter Stimulus (CS+) ausgesetzt, während sie einen strafenden Elektrischen Schlag als den unkonditionierten Stimulus (US) erhalten. Ein zweiter Geruch (CS-) wird dann ohne Strafe präsentiert. Dabei lernen die Tiere, den mit der Bestrafung verbundenen Geruch zu vermeiden, der in einer späteren Wahlsituation zwischen den beiden Gerüchen CS+ und CS-getestet werden kann. Die Arbeit an der Sezieren des neuronalen Substrats, das diesem Verhalten in Drosophila zugrunde liegt, hat die Pilzkörper (MB) als primäre Stelle des "Engramms" identifiziert7,8,9,10 und daher war und ist die Schaltung dieser Hirnregion Gegenstand intensiver Forschung, um die Logik aufzudecken, durch die ein Speicherengramm erworben und gespeichert wird (vor kurzem in11,12überprüft).
Die Drosophila MB besteht aus 2.000 intrinsischen Neuronen (Kenyon-Zellen) pro Hemisphäre, organisiert in parallelen axonalen Projektionen13. Axone von olfaktorischen Projektionsneuronen werden auf die seitliche Protocerebra und auf die MB-Calyces, die Haupt-dendritische Eingangsstelle des MB, ausgedehnt und empfangen olfaktorische Eingaben von Antennenlappen. Das lange, parallele Axonbündel von Kenyon-Zellen bilden den Pedunkel und die Lappen. Die meisten Kenyon-Zellen bifurcate bilden horizontale ,-Lappen, indem sie eine Sicherheit in Richtung der Mittellinie des Gehirns ausdehnen, und die vertikalen ,,/"-Lappen, indem sie die zweite Sicherheit erweitern, die in die dorsale Vorderrichtung projiziert. Die andere Gruppe von Kenyon-Zellen bildet die horizontalen -lappes13 des MB, wo der Lernprozess und die anschließende Kurzzeitgedächtnisbildung lokalisiert werden könnten10. Die MB-Lappen erhalten eine affete Eingabe und bieten eine efferente Ausgabe, die beide in der Regel auf unterschiedliche Teilunterregionen entlang der Kenyon-Zell-Axone14,15,16beschränkt sind. Insbesondere haben afferente dopaminerge MB-Eingangsneuronen gezeigt, dass sie wertbasierte, z.B. strafbare, verstärkende Effekte im assoziativen olfaktorischen Lernen15,17vermitteln. Stereotypische und individuell identifizierbare effelösenMB Output-Neuronen aus den Pilzkörperlappen integrieren Informationen über eine große Anzahl von Kenyon-Zellen, zielen auf verschiedene Hirnbereiche ab und tragen verhaltens-lehrreiche appetitive oder aversive Informationen15 . Diese neuronale Architektur hat zu einem Konzept der Organisation des assoziativen Engramms geführt. Gerüche werden relativ präzise von spärlich aktivierten Ensembles von Kenyon-Zellen kodiert. Die zufällige Aktivität dieser Kenyon-Zell-Ensembles und die Freisetzung von Dopamin - evoziert durch strafende Reize - moduliert die Übertragung von Kenyon-Zell-Präsynapsen auf MB-Ausgangsneuronen, so dass die Tiere anschließend diesen besonderen Geruch vermeiden10 ,12. Wir verwenden dieses ziemlich genau definierte und lokalisierte Engramm als paradigmatischen Fall, um zu veranschaulichen, wie diese lernabhängigen Veränderungen der synaptischen Aktivität bestimmt und überwacht werden können.
Der Wert von Drosophila als Modellsystem hängt stark von der unübertroffenen genetischen Toolbox ab, die es ermöglicht, Transgene zur Identifizierung, Überwachung und Steuerung einzelner Neuronen innerhalb komplexer Schaltkreise auszudrücken18. Das Aufkommen von Techniken zur neuronalen Aktivitätsüberwachung - wie die hier diskutierte Kalzium-Bildgebung - hat die Bestimmung neuronaler Aktivitätsmuster als Reaktion auf einen bestimmten Reiz ermöglicht. Durch die Kombination spezifischer Gal4-gesteuerter Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) mit olfaktorischer Stimulation kann man die geruchsbeschworene Kalziumdynamik von Neuronen von Interesse visualisieren19. In diesem Protokoll wird gezeigt, dass es durch die weitere Kopplung dieser Technik mit einem klassischen Konditionierungsparadigma möglich ist, diese olfaktorischen Reaktionen im Kontext des Lernens zu untersuchen. Lerninduzierte Plastizität kann mit GECIs weiter seziert werden, die nicht nur auf ein einzelnes spezifisches Neuron, sondern auch auf bestimmte Teilabteilungen eines Neurons lokalisiert sind. Pech et al.20 haben eine Auswahl an Werkzeugen etabliert, die genau dies erlauben. Durch die Ausrichtung von GCaMP321 auf die Vor- oder Postsynapse - über die Verbindung zum Wirbeltier Synaptophysin bzw. dHomer bzw.20- kann die Differentialmodulation dieser Standorte unterschieden werden. Diese Lokalisierung verschafft in diesem Zusammenhang einen Vorteil gegenüber den meisten GECIs, die im gesamten Zytosol allgegenwärtig sind - z. B. GCaMP22, GCaMP321oder GCaMP623 -, da es bedeutet, dass prä- und postsynaptische Transienten vom gesamten integrierten Kalziumzufluss, der durch neuronische Aktivierung auftritt, unterschieden. Dies kann Hinweise auf den Ort und die Arten der Plastizität geben, die als Folge von oder zu Lern- und Gedächtnisbildung auftreten. Als Beispiel zeigt das hier bereitgestellte Protokoll den Wert dieses Werkzeugs bei der Entschlüsselung der Modulation von MB-Ausgangsneuronen während des olfaktorischen assoziativen Lernens, indem es die Expression des Kalziumsensors nur auf die Postsynapse ausrichtet. Durch die Überwachung, innerhalb einer einzelnen Fliege, geruchsevokte Aktivität vor und nach der Geruchskonditionierung kann ein direkter Vergleich zwischen einer naiven Geruchsreaktion und einer erlernten Geruchsreaktion gezogen werden. Während sie in derselben Bildkammer fixiert sind, werden Fliegen einer Auswahl von Gerüchen ausgesetzt. Dann erhalten sie ein aversives assoziatives Konditionierungsprotokoll, in dem einer dieser Gerüche mit einem elektrischen Schlag gepaart wird (wird das CS+) und ein weiterer Geruch wird ohne Verstärkung präsentiert (wird zum CS-). Schließlich sind die Fliegen wieder den gleichen Gerüchen ausgesetzt wie im ersten Schritt. Die Calciumdynamik wird mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet.
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Protocol
1. Transgene Fruchtfliegen, Drosophila melanogaster
- Kreuzinnen von Jungfrauen und männlichen Fliegen (bei 25 °C bei 60 % relativer Luftfeuchtigkeit auf einem 12 h-Licht-/Dunkelzyklus) mit den gewünschten Gal4- bzw. UAS-Konstrukten25,um Fliegen zu produzieren, in denen bestimmte Neuronen von Interesse eine genetisch kodierte Kalzium-Indikator.
- Altern Sie die weibliche Nachkommenschaft des oben genannten Kreuzes, bis sie im Bereich von 3-6 Tagen nach der Eklat liegen. Weibliche Fliegen sind wegen ihrer etwas größeren Größe vorzuziehen.
2. Vorbereitung der Fruchtfliege für die In-vivo-Calciumbildgebung
- Wählen Sie eine einzelne weibliche Fliege und anästhesieren auf Eis für nicht länger als 5 min.
- Mit feinen Zangen die Fliege in die Bildkammer legen (in Abbildung 1cdargestellt). Stellen Sie sicher, dass Thorax und Beine in Kontakt mit den elektrischen Drähten im Boden der Kammer sind und dass der Kopf flach liegt. Fixieren Sie die Position der Fliege mit klarem Klebeband.
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert eine maßgeschneiderte Kammer, in der die Fliegen fixiert sind, wobei die Kopfkapsel zum Öffnen zugänglich ist und die Fliegen sowohl Geruchsstimulationen an den Antennen als auch elektrische Stöße an Thorax und Beinen empfangen können (Abbildung 1). - Mit einer chirurgischen Skalpellklinge, die am Skalpellgriff befestigt ist (siehe Tabelle der Materialien),schneidet ein Fenster im Band um den Kopf der Fliege, so dass die Antennen bedeckt und nur der vordere Teil des Thorax ausgesetzt.
- Umgeben Sie die Seiten und die Rückseite des Kopfes mit blaulichthärtendem Kleber, sorgfältig manipuliert mit einem Insektenstift, der von konkav-konvexen Kiefern gehalten wird. Stellen Sie den Kleber mit einer blauen, lichtemittierenden LED-Lampe ein.
- Prüfen Sie, ob der Kleber vollständig eingestellt ist, und entfernen Sie alle verbleibenden ungehärteten Kleber von der dorsalen Oberfläche des Fliegenkopfes.
- Tragen Sie einen Tropfen Ringers Lösung24 (siehe Materialtabelle) auf, um die freiliegende Nagelhaut des Kopfes abzudecken.
- Mit einem sehr feinklingenden Stichmesser durch die Nagelhaut schneiden. Für die effizienteste Entfernung der Nagelhaut, zuerst über das Hinterteil des Kopfes schneiden mit dem Ocelli als Ausgangspunkt. Dann schneiden Sie jede Seite, medial zu den Augen, um eine Klappe der Nagelhaut zu bilden, die leicht mit Zangen abgerissen werden kann.
- Entfernen Sie überschüssige Nagelhaut, die die Gehirnregion von Interesse blockieren kann.
- Löschen Sie vorsichtig die dorsale Oberfläche jeder Luftröhre mit feinen Zangen, um Störungen des Hirngewebes selbst zu vermeiden. Entfernen und aktualisieren Sie die Lösung24 von Ringer (siehe Materialtabelle),wenn dies erforderlich ist, um den Bereich von Gewebeablagerungen zu entfernen.
- Stellen Sie die hypodermische Geruchsabgabenadel in Position, ca. 1 cm vom Flugkopf entfernt. Stellen Sie sicher, dass es nichts gibt, was die Geruchszufuhr zu den Antennen behindern könnte.
- Schließen Sie am Mikroskop die Bildgebungskammer über die hypodermische Geruchsabgabenadel an das Geruchsabgabesystem an.
- Um der Fliege zu ermöglichen, sich vollständig von Anästhesie und Operation zu erholen und sich an den Luftstrom anzupassen, implementieren Sie in diesem Stadium eine 10-min-Ruhezeit.
3. In vivo Calcium-Bildgebung
- Verwenden Sie ein Multiphotonenmikroskop, das mit einem Infrarotlaser und einem Wassertauchobjektiv (siehe Tabelle der Materialien)ausgestattet ist, das auf einem vibrationsisolierten Tisch installiert ist. Für die Visualisierung von GFP-basierten Calciumindikatoren stimmen Sie den Laser auf eine Anregungswellenlänge von 920 nm ab und installieren Sie einen GFP-Bandpassfilter.
- Scannen Sie mit dem groben Z-Einstellknopf durch die Z-Achse des Gehirns und lokalisieren Sie die von Interesse sindde Hirnregion. Verwenden Sie die Zuschneidefunktion, um das Scannen nur auf diesen Bereich zu konzentrieren, um die Scanzeit zu minimieren, und um die Scanansicht so zu drehen, dass der Vorderkopf nach unten zeigt.
- Passen Sie die Framegröße auf 512 x 512 px, die Scangeschwindigkeit auf > 4 Hz und den Scanbereich (in der Y-Dimension) an, sodass die neuronen von Interesse abgedeckt werden.
4. Visualisierung geruchsbeschworener Calciumtransienten durch olfaktorische Konditionierung
- Verwenden Sie ein Geruchsabgabesystem19,26, das zeitlich präzise mehrere Geruchsreize liefern kann.
- Verwenden Sie einen zusätzlichen Computer, um das Gerät zu steuern, und um mit der Bildmikroskop-Software zu kommunizieren, um Geruchsstimulationen mit Bildaufnahme während Experimenten zu koordinieren.
- Initiieren Sie ein vorprogrammiertes Makropaket, das die Bildaufnahmesoftware mit dem Geruchslieferprogramm (z. B. ein in der Mikroskopsteuerungssoftware installiertes VBA-Makropaket, siehe Tabelle der Materialien)miteinander verknüpft, das auf einen externen Eingang reagiert. durch die Initiierung eines Geruchsabgabeprotokolls in einem separaten Programm).
- Beginnen Sie die Messung mit einer Messung durch Überwachung von "Pre-Training"/naiven geruchsbeschworenen Calciumtransienten mit einer Auflösung von 512 x 512 px und einer Bildrate von 4 Hz. Liefern Sie einen 2,5 s Geruchsreiz, flankiert durch zusätzliche Bildaufnahme für 6,25 s vorausgehenden Geruchsbeginn (um ein F zu etablieren 0 Basiswert) und 12,5 s nach Geruchsversatz. Wiederholen Sie dies mit einem zweiten Geruchsmittel und dann mit einem dritten Geruchsmittel.
- Fahren Sie 3 min nach dieser Messung mit klassischer Konditionierung ("Training") der Fliege fort.
- Wählen Sie einen der Gerüche in der "Pre-Training" Phase präsentiert, um die CS+ Geruch und eine andere, um die CS- Geruch zu werden. Präsentieren Sie den CS+ Geruch mit dem computergesteuerten Geruchsliefersystem für 60 s neben zwölf 90 V Elektroschocks.
- Nach einer 60 s Pause, präsentieren Sie die CS- Geruch allein für 60 s. Als Geruchsstoffe 4-Methylcyclohexanol und 3-Oktanol verwenden. Stellen Sie das dritte Geruchsmittel (z.B. 1-Okten-3-ol) während dieses Trainings nicht vor (Schritt 4.2.) und nach (Schritt 4.4) der Trainingsphase als Kontrolle dar.
- Messen Sie die "nach dem Training" geruchsbeschworenen Kalziumtransienten erneut, indem Sie das "Pre-Training"-Geruchsstimulationsprotokoll (Schritt 4.2.) 3 min nach Abschluss der Trainingsphase wiederholen (Schritt 4.3).
HINWEIS: Der Zeitpunkt dieses Schritts sollte die Zeit des Interesses nach der Gedächtnisbildung widerspiegeln (z. B. diesen Schritt 3-4 min nach dem Konditionierungsschritt durchführen, um das Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen). In der Regel können Fliegen in dieser Zubereitung mehrere Stunden überleben. - Speichern Sie Bildgebungsdateien in einem geeigneten Format (z. B. Tiff) für eine spätere Bildanalyse.
5. Bildanalyse
- Um Bilder zu analysieren, öffnen Sie Tiff (oder ähnliche) Dateien in der Bildanalyse-Software wie Fidschi27.
- Richten Sie die Stapel mithilfe eines Bewegungskorrekturalgorithmus aus, um eine minimale Bewegung in X- und Y-Richtung zu gewährleisten. Verwerfen Sie alle Aufnahmen, die eine starke Bewegung in der Z-Achse zeigen.
- Wählen Sie das Tool der Software aus, mit der ein Bereich von Interesse (ROI) um den zu untersuchenden Bereich markiert wird. Dies sollte so präzise wie möglich sein, um den Einfluss der Hintergrundfluoreszenz zu begrenzen.
- Verwenden Sie das entsprechende Tool der Software, um zeitliche Fluoreszenzintensitätsdaten als Datendateien aus dem ausgewählten ROI zu extrahieren, so dass für jeden Frame der Aufzeichnung ein Wert generiert wird.
- Öffnen Sie die Daten mit einem Datenanalyseprogramm, um die Werte für jede Geruchsspur mit F/F0 zu berechnen. F0 = durchschnittliche Fluoreszenz in den 2 s vor Geruchsbeginn. F = die Differenz zwischen der Rohfluoreszenz in einem gegebenen Rahmen und F0. Berechnen Sie aus diesen Werten einen Wert von F/F0 für jeden Frame, der gegen die Zeit geplottet werden kann, um die relative Fluoreszenz während der gesamten Geruchsreizperiode widerzuspiegeln.
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Representative Results
Ein Beispiel für Bilder, die mit dem obigen Protokoll aufgenommen wurden, ist in Abbildung 2zu sehen. d Homer-GCaMP3 wird in einem MB-Ausgangsneuron exprimiert, dessen Dendriten das Fach 1 des MB-Lappens (das Neuron wird MVP228,29) innervierend erhalten und genetisch mit der Split-Gal4-Linie MB112C16gezielt eingesetzt werden. Auch, gezeigt ist der Unterschied in der subzellulären Lokalisierung eines Zytosolus und der postsynaptisch lokalisierten Kalzium-Indikator. Beim Vergleich der Abbildungen 2a und Abbildung 2fkann man den spezifischen, abgeschotteten Ausdruck des dHomer-GCaMP3-Sensors14 deutlich beobachten - ohne Expression in den axonalen Fächern des Neurons und einem unterbrochenen Signal sichtbar im dendritischen Fach. Klar - obwohl die geringere Amplitude - Geruchsreaktionen können in Fliegen gesehen werden, die dHomer-GCaMP3(Abbildung 2, untere Paneele) ausdrücken, im Vergleich zu Fliegen, die zytosolisolg gCaMP6f23 (Abbildung 2, obere Paneele) exdrücken. Dies zeigt, dass das Tool für die Visualisierung von geruchsneutralen Reaktionen auf der Ebene der Postsynapse wirksam ist, und bietet daher eine zusätzliche Spezifität für die Untersuchung der neuronalen Schaltkreise, die in diesem Fall der Geruchscodierung und olfaktorisches Lernen.
Ein Beispiel für Letzteres ist in Abbildung 3zu sehen. In diesem Experiment wird dHomer-GCaMP3 wie in Abbildung 2 ausgedrückt - im Pilzkörperausgang Neuron MVP2. Dies ist ein Neuron bekannt, durch olfaktorisches Lernen so moduliert werden, dass präsynaptische Depression als Folge der aversiven olfaktorischen Konditionierung in einer verstorbenen postsynaptischen Reaktion auf den trainierten Geruch reflektiert wird28,29 und hier ein Bestätigung dieses Ergebnisses wird anhand dieses in vivo Calcium-Imaging-Protokolls gezeigt. Die in Abbildung 3 dargestellten Kalziumspuren stellen beispielhafte Daten einer einzelnen Fliege dar. Beachten Sie, dass der Geräuschpegel und die Amplitude zwischen einzelnen Präparaten variieren können (z. B. abbildung 2e und Abbildung 3c-e). Daher bietet ein innertierischer Vergleich von Pre- und Post-Training eine Möglichkeit, die interindividuelle Variabilität zu berücksichtigen. Natürlich ist das Protokoll geeignet, auf die Bildgebung anderer Neuronen von Interesse übertragen werden.
Abbildung 1: Bau einer Montagekammer und Vorbereitung einer Fliege für die Bildgebung. (a) Schritte für den Bau der Fliegenmontagekammer. Die Basis besteht aus einem Standardmikroskopschlitten (1), der mit einem feinen Kunststoffgitter (2) bedeckt ist. Zwei elektrische Drähte mit gegensätzlichen Ladungen (3) werden auf beiden Seiten an die Rutsche geklebt. Die Drähte werden abgestreift und gebogen, um die Folie (4) zu überqueren, die parallel zueinander verläuft, aber nicht in Kontakt. Schichten aus klarem Klebeband (5) werden hinzugefügt, bis die Höhe einer Fliege (ca. 1 mm) erreicht ist. Ein Kanal wird vertikal (6) durch das Band geschnitten, ca. 1 mm breit, um die Breite einer Fliege zu erreichen. Eine erhöhte Plattform aus klarem Klebeband (7) wird direkt über den elektrischen Drähten gebaut, um ein Kissen für den Kopf der Fliege zu bilden, während sich der Thorax auf den Drähten befindet. (b) Schematische Darstellung der Unterbeinen unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop positionierten Fliege. Die Geruchsstimulation wird durch eine hypodermische Nadel erreicht, die vor dem Kopf der Fliege positioniert ist (durch den Kanal im Band (6) und auf der Oberseite der Plattform (7) eingesetzt, um die Gerüche auf die Antennen zu lenken). (c)-(h) Befestigung und Öffnung des Fliegenkopfes. (c) Eine Fliege, die in der Bildkammer, innerhalb des Kanals (Scale bar = 1 mm) befestigt und von einem frischen Stück klarem Klebeband über die gesamte Fliege gehalten wird. (d) Vergrößerte Sicht der Fliege in Position. Maßstabsstange = 0,1 mm. (e) Ein Fenster wird um den Flugkopf in das Band geschnitten. (f) Der Kopf wird weiter mit blauem lichthärtenden Kleber fixiert. (g) Die Kopfkapsel wird mit Ringer-Lösung abgedeckt und geöffnet. (h) Abgeschlossene Vorbereitung des Gehirns mit überschüssigem Gewebe und Luftröhre (weißes Gewebe sichtbar in (g) entfernt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Postsynaptisch lokalisiertes Kalzium visualisiert mit dHomer-GCaMP3. (a) Konfokale Mikroskopiebilder, die den Ausdruck von zytosolisch lokalisierten GCaMP6f (i) und postsynaptisch lokalisierten dHomer-GCaMP3 (ii) im MB-Ausgangsneuron MVP2 zeigen. Grüner Pfeil zeigt die Unterregion Nr. 1 des MB-Lappens an. Skalenbalken = 15 m. (b)-(d) Bilder, die mit der Zwei-Photonen-Erregungsmikroskopie der oben genannten Genotypen aufgenommen wurden und die In-vivo-Fluoreszenz der jeweiligen Calciumsensoren zeigen. (b) F0 (Baseline Fluoreszenz) Bilder, die als durchschnittliche Intensitätsprojektion der 2 s vor Geruchsbeginn nachgewiesen werden. Skalenbalken = 10 m (c)F-Geruchsbilder (Fluoreszenz bei der Geruchsstimulation), die als durchschnittliche Intensitätsprojektion über den Geruchsreaktionszeitraum (2,5 s) nachgewiesen werden. (d) F-Bilder, die durch Subtraktion von F0-Bild vomF-Geruchsbild erzeugt werden, um das tatsächliche Geruchssignal anzuzeigen. (e) F/F0 Spuren von den obigen Fliegen der jeweiligen Genotypen durch eine Geruchsstimulation (grauer Balken). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Lerninduzierte postsynaptische Plastizität visualisiert über dHomer-GCaMP3. (a) Schematische Konditionierungsprotokolle, die in diesen Experimenten verwendet werden. Naive Geruchsreaktionen, bevor zuerst konditioniert ("pre") gemessen werden. Dann erlebt jede Fliege eines von drei möglichen Konditionierungsprotokollen: "Gekoppelt", bei dem ein Geruch (CS+) mit Elektrischen Stößen (US) und ein anderer (CS-) nicht verstärkt wird; "Nur Gerüche", bei denen nur die Gerüche präsentiert werden, beide ohne Verstärkung, um Geruchsexpositionseffekte zu kontrollieren; und "Nur Schocks", bei denen nur Elektrische Stöße ohne Geruchsreize präsentiert werden, um Schock-Expositionseffekte zu kontrollieren. Nach dieser Konditionierungsphase werden die Fliegen dann wieder den "Pre"-Gerüchen ausgesetzt, um auf veränderte geruchsbeschworene Aktivität ("Post") zu testen. (b) Ein Beispiel für die Geruchsreaktionsmodulation als Ergebnis der gepaarten Geruchs-/Schockdarstellung. Eine starke Unterdrückung der Reaktion auf den CS+ Geruch ist in der Subregion Nr. 1 (gepunktete Linie) zu beobachten. (c)-(e) Geruchsreaktionsspuren von derselben Fliege wie in (b), was zeigt, dass dieser Unterdrückungseffekt nur bei trainiertem Geruch beobachtet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Zerlegung der neuronalen Schaltkreise, die dem Lernen und Gedächtnis zugrunde liegen, ist ein herausragendes Ziel auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Die genetische Zugänglichkeit von Drosophila und die Breite und Leichtigkeit der Verhaltenstests macht dies zu einem idealen Werkzeug, um solche Phänomene zu untersuchen. Hier wird eine Methode vorgestellt, mit der innerhalb einzelner Fliegen die Modulation visualisiert werden kann, die auf subzellulärer Ebene als Ergebnis der olfaktorischen Konditionierung auftritt. Durch die Durchführung sowohl der Vortrainings- als auch der Nachschulung der geruchsbeschworenen Kalziumdynamik, die zuerst von unserer Gruppe17erstellt wurde, ist es möglich, einen direkten, innertierischen Vergleich zwischen naiven und erlernten Geruchsreaktionen und damit die Plastizität von Neuronen von Interesse zu untersuchen. Dies verschafft diesem Protokoll einen Vorteil gegenüber massenhaften Bewertungen (in der klassischen Geruchskonditionierung), da Vor- und Nachtrainingszustände quantitativ für Einzelpersonen bewertet werden können, was es ermöglicht, interindividuelle unbeständigkeit. Darüber hinaus entspricht das direkt unter dem Mikroskop durchgeführte Training weitgehend dem klassischen Geruchskonditionierungsparadigma, das typischerweise in Verhaltensexperimenten verwendet wird, und beinhaltet keine künstliche optogenetische Stimulation von Neuronen. Natürlich erfordert der Umgang mit den kleinen Fliegen und das vorsichtige Öffnen der Kopfkapsel, ohne das Hirngewebe zu beschädigen, während die Sinnesorgane intakt bleiben, ein Maß an Fachwissen, das durch sorgfältiges und wiederholtes Training gewonnen werden kann, nicht unähnlich dem Ausmaß, das in physiologische Bewertungen wie Elektrophysiologie.
Zusätzlich wird das Potenzial demonstriert, lokalisierte Kalziumindikatoren zur Untersuchung der Plastizität auf der Ebene des einzelnen Neuronenzustufen zu verwenden - was die neuronale Kreissektion genauer macht. Dies wird durch das Zeigen einer lerninduzierten Depression einer postsynaptischen Reaktion in einem gut untersuchten MB-Outputneuron28,29veranschaulicht. Drosophila-Stämme, die eine Vielzahl synaptisch lokalisierter Fluoreszenzsensoren unter UAS-Steuerung exezieren, sind z.B. für den präsynaptisch lokalisierten Sensor Synaptophysin-GCaMP3 oder den roten Fluoreszenzsensor synaptisch Übertragung Synaptophysin-pHTomato20. Natürlich kann die Vielfalt der Fluoreszenzsensorproteine mit dem oben beschriebenen Protokoll implementiert werden.
Optische Bildgebungstechniken werden im Allgemeinen durch die zeitliche und räumliche Auflösung des mikroskopischen Bildaufnahmesystems (z.B. ein Zwei-Photonen-Mikroskop) und die zeitliche Auflösung des Sensors selbst (z. B. die Kinetik des Calciumsensors) eingeschränkt. Elektrophysiologische Aufnahmen, z.B. mit Patchclamp Elektrophysiologie aus Somata von Neuronen im Drosophila Gehirn, bieten immer noch eine unübertroffene zeitliche Auflösung, aber ohne räumliche Präzision. Aufgrund der Spezifität der Genexpression in Neuronen von Interesse in Verbindung mit der subzellulären Lokalisierung des Sensors können optische Bildgebungstechniken potenziell elektrophysiologische Techniken ergänzen, um neuronale Plastizität aufzudecken, die Lernen und Gedächtnisbildung. Der kontinuierliche Fortschritt in der Entwicklung von Fluoreszenzsensoren wird vielleicht die Möglichkeit bieten, Sensorproteine mit schnellerer Kinetik oder höheren Signal-Rausch-Verhältnissen (z. B. GCaMP6-Varianten23) mit synaptisch lokalisierten Proteinen zu verschmelzen. wie dHomer. Auch die jüngsten Fortschritte bei der Etablierung mikroskopischer Techniken mit schnelleren Erfassungsraten oder höherer räumlicher Auflösung werden sich bei der weiteren Feinabstimmung unseres Ansatzes als von unschätzbarem Wert erweisen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Deutschen Forschungsrat durch das Sonderforschungsbereich SFB 889 "Mechanismen der sensorischen Verarbeitung" und die Forschergruppe FÜR 2705 "Dissektion eines Hirnkreises: Struktur, Plastizität und Verhaltensfunktion der Drosophila Pilz Körper".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Octen-3-ol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | O5284 | Chemical used as odorant |
| 3-Octanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 218405 | Chemical used as odorant |
| 4-Methylcyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 153095 | Chemical used as odorant |
| Bandpass filter for EGFP (525/50 nm) | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | ||
| Clear adhesive tape | Tesa SE, Norderstedt, Germany | Standard claer adhesive tape | |
| Concave-convex jaws | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 10053-09 | Blade Holders with concave-convex jaws |
| Fine forceps | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 11412-11 | Forceps with tip 0.1 x 0.06mm |
| Hypodermic needle | Sterican - B. Braun, Melsungenk, Germany | 4665120 | 1.20x40mm |
| Insect Minutien pins | Fine Science Tools, North Vancouver, Canada | 26002-10 | Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm |
| Kentoflow | Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK | 953683 | Blue light-curing glue |
| Microscope slide | Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany | 0656.1 | Standard objective slide 76 x 26 mm |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M8410 | Used as diluent for odorants |
| Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2 | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | Tunable infrared femtosecond laser | |
| Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices. | |
| Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective | Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany | 421452-9900-000 | Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm |
| Ringer's solution | n.a. | n.a. | 5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4 |
| Stab knife | Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA | 72-1551 | 5.0mm Straight restricted blade depth |
| Surgical scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0303 | Product No. 11 |
| Surgical scalpel handle | Swann-Morton, Sheffield, UK | 0907 | Product No. 7S/S |
| Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope. |
Custom-written and available upon request | n.a. | n.a. |
References
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