In vivo optische calcium beeldvorming van leren-geïnduceerde synaptische plasticiteit in Drosophila melanogaster

Summary

Hier presenteren we een protocol waarmee pre-en/of postsynaptisch calcium kan worden gevisualiseerd in de context van Drosophila leren en geheugen. In vivo calcium beeldvorming met behulp van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren wordt gecombineerd met een klassieke olfactorische conditionerings paradigma zodanig dat de Synaptische plasticiteit onderliggende dit type associatief leren kan worden bepaald.

Abstract

Decennia van onderzoek in veel model organismen hebben geleid tot het huidige concept van synaptische plasticiteit onderliggende leren en Geheugenvorming. Learning-geïnduceerde veranderingen in de synaptische transmissie zijn vaak verdeeld over vele neuronen en niveaus van verwerking in de hersenen. Daarom, methoden voor het visualiseren van leer afhankelijke synaptische plasticiteit over neuronen nodig zijn. De fruitvlieg Drosophila melanogaster vertegenwoordigt een bijzonder gunstig modelorganisme om neuronale circuits onderliggende leren te bestuderen. Het protocol hier gepresenteerd toont een manier waarop de processen die aan de vorming van associatieve reuk geheugens, dat wil zeggen, synaptische activiteit en hun veranderingen, kunnen worden gemonitord in vivo. Met behulp van de brede waaier van genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in Drosophila, is het mogelijk om genetisch gecodeerde calcium indicatoren expliciet uit te drukken in bepaalde celpopulaties en zelfs enkelvoudige cellen. Door het bevestigen van een vlieg op zijn plaats, en het openen van de hoofd capsule, is het mogelijk om de calcium dynamica in deze cellen te visualiseren terwijl olfactorische stimuli worden gegeven. Daarnaast demonstreren we een set-up waarin de vlieg gelijktijdig kan worden blootgesteld aan elektrische schokken aan het lichaam. Dit biedt een systeem waarin vliegen klassieke olfactorische conditionering kan ondergaan-waarbij een eerder naïeve geur wordt geleerd te worden geassocieerd met elektrische schok straf-op hetzelfde moment als de representatie van deze geur (en andere ongetrainde geuren) is waargenomen in de hersenen via twee-photon microscopie. Ons laboratorium heeft eerder de generatie van Synaptisch gelokaliseerde calcium sensoren gerapporteerd, waardoor men de fluorescerende calcium signalen kan beperken tot pre-of postsynaptische compartimenten. Two-photon microscopie biedt een manier om ruimtelijke structuren op te lossen. We illustreren dit door te focussen op neuronen die informatie van het paddestoel lichaam integreren, een hoger-orde centrum van het insecten brein. Over het algemeen, dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van de synaptische verbindingen tussen neuronen waarvan de activiteit wordt gemoduleerd als gevolg van reuk leren.

Introduction

Ontcijferen waar en hoe de informatie wordt verworven in de hersenen door te leren en vervolgens opgeslagen als geheugen vormt een van de meest uitdagende taken in neurowetenschappen¹. Neurowetenschappelijk onderzoek heeft geleid tot het concept van een verandering in de synaptische transmissie als de neuronale substraat dat ten grondslag ligt aan leren en Geheugenvorming^2,3. Het is veronderstelde dat, tijdens het leren, synaptische verbindingen tussen neuronale ensembles die actief zijn tijdens de perceptie van een stimulus zodanig worden gewijzigd dat hun gecombineerde activiteit patroon kan worden opgehaald tijdens geheugen terugroepen, waardoor het instrueren toekomstige gedrags actie⁴. Deze “engram cellen” en hun synapsen zijn vaak verdeeld over hersengebieden en niveaus van verwerking, waardoor het moeilijk is om waargenomen veranderingen in synaptische transmissie toe te wijzen aan het leren van een taak of een stimulus. Om te lokaliseren en visualiseren van die synaptische veranderingen die causaal gekoppeld aan een specifieke leer taak men moet een juiste modelsysteem dat het mogelijk maakt voor het nauwkeurig beperken van die synapsen.

Voor een dergelijke inspanning is Drosophila melanogaster bijzonder geschikt omdat het relatieve hersen eenvoud, gedrags rijkdom en experimentele toegankelijkheid combineert. Onder de gevestigde model organismen, Drosophila is gelegen tussen de nematode C. elegans en genetisch Tractable zoogdieren zoals muizen in termen van neuronale complexiteit. Het type aantal neuronen (~ 300) en het beperkte gedrags repertoire wordt waargenomen bij C. elegans. Zoogdieren, aan de andere kant, hebben miljoenen neuronen en duizelingwekkende gedrags complexiteit. De hersenen van de fruitvlieg is, met zijn ~ 100.000, neuronen aanzienlijk kleiner dan de hersenen van de meeste gewervelde dieren, en veel van de neuronen zijn individueel identificeerbaar⁵. Toch toont Drosophila een breed spectrum van complexe gedragingen, waaronder een vermogen om robuuste associatieve olfactorische leer-en Geheugenvorming te vertonen, die voor het eerst werd beschreven 40 jaar geleden⁶. In de loop van deze klassieke conditionerings procedure worden groepen vliegen onderworpen aan een geur als de geconditioneerde stimulus (CS⁺) terwijl ze een punierende elektrische schok krijgen als de ongeconditioneerde STIMULUS (VS). Een tweede geur (CS^–) wordt dan gepresenteerd zonder straf. Daardoor leren de dieren om de geur geassocieerd met de straf te vermijden, die kan worden getest in een latere keuze situatie tussen de twee geuren, CS⁺ en CS^–. Werk aan het ontleden van de neuronale substraat onderliggende dit gedrag in Drosophila heeft de paddestoel lichamen geïdentificeerd (MB) als de primaire site van de “engram”^7,8,9,10 en daarom, de circuits van dit hersengebied was en is het onderwerp van intens onderzoek om de logica te achterhalen waarmee een geheugen-engram wordt verworven en opgeslagen (onlangs beoordeeld in^11,12).

De Drosophila MB bestaat uit ~ 2.000 intrinsieke neuronen (Kenyon cellen) per halfrond, georganiseerd in parallelle axonale projecties¹³. Axonen van olfactorische projectie neuronen worden uitgebreid naar de laterale protocerebra en naar de MB calyces, de belangrijkste dendritische ingangs plaats van de MB en ontvangen olfactorische input van antennal lobben. De lange, parallelle axonen-bundel van Kenyon-cellen vormen de bloem en de lobben. De meeste Kenyon-cellen vormen horizontale β/β’-lobben door een onderpand uit te breiden naar de middenlijn van de hersenen, en de verticale α/α’-lobben door het uitbreiden van tweede onderpand dat projecteren in de dorsale-anterieure richting. De andere groep van Kenyon cellen vormt de horizontale γ-lobben¹³ van de MB waar het leerproces en de daaropvolgende korte-termijn Geheugenvorming zou kunnen worden gelokaliseerd¹⁰. De MB-lobben krijgen een afferente input en zorgen voor een efferente output, die beide meestal beperkt zijn tot verschillende compartimentele subregio’s langs de Kenyon Cell axonen^14,15,16. In het bijzonder is aangetoond dat de afferente Dopaminerge MB-input neuronen bemiddel op waarde gebaseerde, bijvoorbeeld, punitieve, versterkende effecten in associatieve reuk Learning^15,17. Stereotypic en individueel identificeerbare efferente MB-output neuronen uit de paddestoel Body lobben integreren informatie over grote aantallen Kenyon cellen, richten diverse hersengebieden en dragen gedrag-leerzame eetlust of aversieve informatie¹⁵ . Deze neuronale architectuur heeft geleid tot een concept van de organisatie van het associatieve engram. Geuren zijn relatief nauwkeurig gecodeerd door dun geactiveerde ensembles van Kenyon-cellen. De samenvallen activiteit van deze Kenyon celensembles en het vrijkomen van dopamine-opgeroepen door het straffen van stimuli-moduleert transmissie van Kenyon Cell presynapses op MB uitgangs neuronen zodanig dat de dieren vervolgens deze bijzondere geur zal vermijden^{10 ,12}. We gebruiken dit nogal nauwkeurig gedefinieerde en gelokaliseerde engram als een paradigmatische zaak om te illustreren hoe deze leer afhankelijke veranderingen in synaptische activiteit kunnen worden bepaald en gemonitord.

De waarde van Drosophila als modelsysteem is sterk afhankelijk van de ongeëvenaarde genetische Toolbox die het mogelijk maakt om transgenen te uiten voor het identificeren, bewaken en beheersen van enkele neuronen binnen complexe circuits¹⁸. De opkomst van technieken voor Neuronale activiteit monitoring-zoals calcium Imaging, hier besproken-hebben toegestaan voor de bepaling van de neuronale activiteit patronen in reactie op een specifieke stimulans. Door het combineren van specifieke Gal4-driven expressie van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) met olfactorische stimulatie, kan men visualiseren de geur-opgeroepen calcium dynamiek van neuronen van belang¹⁹. In dit protocol wordt aangetoond dat door deze techniek verder te koppelen aan een klassiek conditionerings paradigma, het mogelijk is om deze olfactorische responsen in de context van leren te onderzoeken. Leer-geïnduceerde plasticiteit kan verder worden ontleed met behulp van GECIs die niet alleen gelokaliseerd zijn op één specifiek neuron, maar ook op specifieke subcompartimenten van een neuron. Pech et al.²⁰ heeft een selectie van tools opgezet die dit precies mogelijk maken. Door zich te richten op GCaMP3²¹ op de pre-of postsynapse-via-koppeling naar het gewervelde Syntophysin of dHomer, respectievelijk²⁰-de differentiële modulatie van deze sites kan worden onderscheiden. Deze lokalisatie verleent in dit verband een voordeel ten opzichte van de meeste GECIs die alomtegenwoordig aanwezig zijn in de cytosol-bijvoorbeeld GCaMP²², GCaMP3²¹of GCaMP6²³ -omdat dit betekent dat pre-en postsynaptische transiënten kunnen worden onderscheiden van de totale geïntegreerde calcium instroom die optreedt als gevolg van neuron activatie. Dit kan aanwijzingen geven over de locatie en de soorten plasticiteit die optreden als gevolg van of die leiden tot leren en Geheugenvorming. Als voorbeeld toont het protocol dat hier wordt geleverd de waarde van dit hulpmiddel bij het ontcijferen van de modulatie van MB-uitgangs neuronen tijdens olfactorische associatief leren door de expressie van de calcium sensor te richten op alleen de postsynapse. Door te monitoren, binnen een individuele vlieg, geur-Evoked activiteit voor en na olfactorische conditionering een directe vergelijking kan worden getrokken tussen een naïeve geur respons en een geleerde geur respons. Terwijl ze in dezelfde Imaging kamer zijn bevestigd, worden vliegen blootgesteld aan een selectie van geuren. Vervolgens krijgen ze een aversief associatief conditionerings protocol waarin een van deze geuren is gekoppeld aan elektrische schokken (de CS⁺) en een andere geur wordt gepresenteerd zonder versterking (de CS^–). Ten slotte worden de vliegen weer blootgesteld aan dezelfde geuren als in de eerste stap. Calcium dynamica wordt waargenomen met behulp van twee-photon microscopie.

Protocol

1. transgene vruchten vliegen, Drosophila melanogaster Kruis vrouwelijke Maagd en mannelijke vliegen (verhoogd bij 25 °C in 60% relatieve vochtigheid op een 12 h licht/donkere cyclus) dragen van de gewenste Gal4 en UAS constructies25, respectievelijk, om vliegen te produceren waarin specifieke neuronen van belang Express een genetisch gecodeerde calcium indicator. Leeftijd de vrouwelijke nakomelingen van het bovenstaande Kruis totdat ze in het bereik van 3-6 dagen na …

Representative Results

Een voorbeeld van afbeeldingen die met het bovenstaande protocol zijn verkregen, is te zien in Figuur 2. d Homer-GCaMP3 wordt uitgedrukt in een MB-output neuron waarvan dendrites innervate het compartiment 1 van de MB γ-kwbe (het neuron wordt genoemd MVP228,29) en is genetisch gericht met behulp van de split-Gal4 lijn MB112C16. Ook, gedemonstreerd is het verschil in d…

Discussion

De dissectie van de neurale circuits onderliggende leren en geheugen is een prominente doel op het gebied van de neurowetenschappen. De genetische bereikbaarheid van Drosophila en de breedte en het gemak van gedragstesten maken dit een ideaal instrument om dergelijke verschijnselen te onderzoeken. Hier wordt een methode gepresenteerd waarmee het mogelijk is om binnen individuele vliegen de modulatie te visualiseren die optreedt op een subcellulair niveau als gevolg van olfactorische conditionering. Door het uitv…

Materials

1-Octen-3-ol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	O5284	Chemical used as odorant
3-Octanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	218405	Chemical used as odorant
4-Methylcyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	153095	Chemical used as odorant
Bandpass filter for EGFP (525/50 nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany
Clear adhesive tape	Tesa SE, Norderstedt, Germany		Standard claer adhesive tape
Concave-convex jaws	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	10053-09	Blade Holders with concave-convex jaws
Fine forceps	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	11412-11	Forceps with tip 0.1 x 0.06mm
Hypodermic needle	Sterican – B. Braun, Melsungenk, Germany	4665120	1.20x40mm
Insect Minutien pins	Fine Science Tools, North Vancouver, Canada	26002-10	Diameter 0.1mm, tip 0.0125mm
Kentoflow	Kent Express Dental Supplies, Gillingham, UK	953683	Blue light-curing glue
Microscope slide	Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Germany	0656.1	Standard objective slide 76 x 26 mm
Mineral oil	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	M8410	Used as diluent for odorants
Mode-locked Ti-Sapphire laser Chameleon Vision 2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA		Tunable infrared femtosecond laser
Multiphoton Microscope LSM 7MP equipped with BiG detectors	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany		Multiphoton microscope, multiple companies provide similar devices.
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) water immersion objective	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germany	421452-9900-000	Objective W "Plan-Apochromat" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringer's solution	n.a.	n.a.	5mM KCl, 130mM NaCl, 2mM MgCl2, 2mM CaCl2, 5mM Hepes-NaOH, 36mM sucrose, pH = 7.4
Stab knife	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, Reading, PA, USA	72-1551	5.0mm Straight restricted blade depth
Surgical scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	0303	Product No. 11
Surgical scalpel handle	Swann-Morton, Sheffield, UK	0907	Product No. 7S/S
Visual Basics of Applicatons (VBA) software to receive a trigger from the odor-delivery device and the electric shock application device (power supply) to interact with the ZEN software from Zeiss that controls the microscope.	Custom-written and available upon request	n.a.	n.a.