Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

ونحن نقدم وصفا للبروتوكولات الخاصة بتحديد هيكل المجال الملزم IKK من نيمو بواسطة البلورات بالاشعه السينية. وتشمل الأساليب التعبير البروتين, تنقيه وتوصيف وكذلك استراتيجيات لتحسين الكريستال الناجحة وهيكل تحديد البروتين في شكله غير منضم.

Abstract

نيمو هو بروتين السقالات الذي يلعب دورا أساسيا في المسار NF-κB عن طريق تجميع IKK-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. عند التنشيط ، فان مجمع IKK فوسفولات الجزيئات IκB مما يؤدي إلى النقل النووي NF-κB وتفعيل الجينات المستهدفة. تثبيط التفاعل نيمو/IKK هو نموذج علاجي جذاب لتشكيل النشاط المسار NF-κB ، مما يجعل نيمو هدفا لتصميم مثبطات واكتشاف. لتسهيل عمليه الاكتشاف والاستفادة المثلي من مثبطات نيمو ، قمنا بهندسة بناء محسن للمجال الملزم IKK من نيمو الذي من شانه ان يسمح لتحديد هيكل البروتين في شكل apo وبينما يرتبط بمثبطات الوزن الجزيئي الصغيرة. هنا ، نقدم الاستراتيجية المستخدمة للتصميم والتعبير والتوصيف الهيكلي للمجال الملزم IKK من نيمو. يتم التعبير عن البروتين في الخلايا القولونية ، solubilized تحت ظروف الدفن وتنقيتها من خلال ثلاث خطوات الكروماتوغرافي. نناقش البروتوكولات الخاصة بالحصول علي بلورات لتحديد الهيكل ووصف استراتيجيات الحصول علي البيانات وتحليلها. وسوف تجد البروتوكولات تطبيق واسعه لهيكل تحديد المجمعات من نيمو ومثبطات جزيء صغير.

Introduction

يتم تنشيط مسار NF-κB استجابه لمجموعه متنوعة من المحفزات ، بما في ذلك السايتوكينات والمنتجات الميكروبية والإجهاد ، لتنظيم التعبير عن الجينات المستهدفة المسؤولة عن الاستجابة التهابيه والمناعية ، وموت الخلايا أو البقاء علي قيد الحياة والانتشار1. الامراض بما في ذلك التهابات والمناعة الذاتية والسرطان2,3,4,5 وقد ارتبطت إلى فرط تنشيط المسار, الذي جعل التحوير NF-κb النشاط هدفا رئيسيا لتطوير العلاجات الجديدة6,7.

ويتميز المسار NF-κB الكنسي علي وجه الخصوص من المسار غير المتعارف عليه ، والمسؤولة عن الغدد الليمفاوية وتنشيط ب الخلية ، من قبل الاعتماد السابق علي نيمو البروتين السقالات (NF-κB المغير الاساسيه8) لتجميع ikk-مجمع مع كيناسيس IKKα و IKKβ. مجمع IKK هو المسؤول عن فوسفولات IκBα (المثبط من κB) التي تستهدف ذلك للتدهور ، وتحرير الدمامل NF-κB لنقل إلى نواه للنسخ الجيني1 التالي هو هدف جذاب لتطوير مثبطات لتعدل NF-κb النشاط.

تركز أبحاثنا علي توصيف التفاعل بين البروتين والبروتين بين نيمو و IKKβ ، والتي تستهدف نيمو لتطوير مثبطات جزيئات صغيره من تكوين مجمع IKK. مجال ملزم الحد الأدنى من نيمو ، المطلوبة لربط IKKβ ، ويشمل بقايا 44-111 ، وتم تحديد بنيتها في مجمع مع الببتيد المقابلة ل IKKβ تسلسل 701-7459. نيمو و ikkβ تشكل حزمه أربعه الحلزون حيث يستضيف نيمو ديمر الهلاليين من ikkβ (701-745) في أخدود مفتوح ممدود مع واجهه تفاعل موسعه. IKKβ (734-742) ، والمعروف أيضا باسم المجال نيمو ملزمه (بنك دبي الرئيسي) ، ويعرف أهم بقعه ساخنه للربط ، حيث تريبتوفانس الاساسيه اثنين (739,741) دفن عميقا داخل الجيب نيمو. تفاصيل هيكل معقده يمكن ان تساعد في التصميم القائم علي هيكل والأمثل لمثبطات جزيء صغير استهداف نيمو. في الوقت نفسه ، فانه من الصعب ان ملزمه لجزيء صغير أو الببتيد من شانه ان يعيد في نيمو التغيير المطابق الكامل (اي ، فتح واسعه من نيمو ملفوف لفائف dimer) الناجمة عن ربط IKKβ طويلة (701-745) ، كما لوحظ في الكريستال ، وبنيه غير منضم نيمو أو نيمو منضما إلى مثبط جزيء صغير قد تمثل هدفا أفضل لتصميم المخدرات المستندة إلى بنيه والمثبط الأمثل.

وقد ثبت الطول الكامل نيمو وأصغر بنيات اقتطاع تشمل مجال IKK-ربط المستعصية لتحديد هيكل في شكل غير منضم عن طريق الاشعه السينية البلورات والرنين المغناطيسي النووي (NMR) طرق10، مما دفعنا إلى تصميم نسخه محسنه من مجال ikk ملزم من نيمو. في الواقع, نيمو (44-111) في شكل غير منضم فقط مطوية جزئيا ويخضع للتبادل المطابق ونحن لذلك تعيين لتحقيق الاستقرار هيكلها ديميريك, ملفوف لفائف اضعاف والاستقرار, مع الحفاظ علي تقارب ملزمه ل IKKβ. من خلال إلحاق ثلاثه من الهبات من الديميريك المثالي لفائف ملفوفه11 في N-و C-تيرميني من البروتين ، وسلسله من أربعه طفرات النقطة ، ونحن ولدت نيمو-eeaa ، بناء ديميريك تماما ومطوية في لفائف ملفوف ، التي أنقذت صله ikk الربط إلى نطاق نانومولار كما لوحظ لكامل طول نيمو12. كميزه اضافيه ، كنا نامل ان محولات ملفوف لفائف (علي أساس تسلسل GCN4) من شانه ان يسهل تبلور والمساعدة في نهاية المطاف في تحديد هيكل الاشعه السينية عن طريق استبدال الجزيئية. وقد استخدمت محولات ملفوف لفائف بالمثل لزيادة الاستقرار ، وتحسين السلوك الحل وتسهيل بلوره للفائف ملفوف تريميريك وشظايا الأجسام المضادة13،14. يتم التعبير عن نيمو-EEAA بسهوله وتنقيتها من اساسيكوجيا. القولونية الخلايا مع العلامة كليفابل Histidine ، هو قابل للذوبان ، مطوية في لفائف ديميريك ملفوف مستقره وتبلور بسهوله ، مع انكسار إلى 1.9 Å. وجود المناطق ملفوف لفائف أمر من GCN4 يمكن ان تساعد بالاضافه إلى ذلك في التدريج البيانات من بلورات نيمو-EEAA من قبل الاستبدال الجزيئي باستخدام الهيكل المعروف من GCN415.

النظر إلى النتائج التي تم الحصول عليها مع apo-نيمو-EEAA ، ونحن نعتقد ان البروتوكولات الموصوفة هنا يمكن أيضا ان تطبق علي بلوره نيمو-EEAA في وجود الببتيدات الصغيرة (مثل الببتيد بنك دبي المحلي) أو مثبطات جزيء صغير ، مع الهدف من فهم متطلبات تثبيط نيمو والتحسين القائم علي الهيكل من مثبطات الرصاص النظر إلى اللدونة والطبيعة الديناميكية للعديد من المجالات ملفوف لفائف16، واستخدام محولات لفائف ملفوف يمكن العثور علي تطبيق أكثر عمومية في مساعده التصميم الهيكلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم بناء لبلورات

  1. استنساخ تسلسل نيمو-EEAA كما في المنشور السابق12 في متجه للتعبير في e. كولاي باستخدام المروج T7 ، بما في ذلك العلامة الطرفية N-histidine وموقع انشقاق البروتياز.
    ملاحظه: في هذا البروتوكول ، استخدمنا متجه معدله لتشمل N-محطه سداسية histidine العلامة والتبغ حفر الفيروس (TEV) موقع الانشقاق10. يسهل هذا المتجه انشقاق العلامة الخاصة به لبلوره البروتين ويترك فقط الامتداد القصير لبقايا GSW قبل بداية تسلسل البروتين المطلوب. المتجه الذي تم اشتقاقه منه ، والمتجات البديلة مدرجه في جدول المواد. في هذا البروتوكول ، أدخلت التعديلات اللاحقة علي التسلسل الأصلي نيمو (44-111) تدريجيا ، كما هو موضح في وقت سابق10، وذلك باستخدام الجانب الموجهة الطفرات. حاولنا في البداية لتحقيق الاستقرار في نيمو ملفوف لفائف ديمر إلحاق محولات لفائف ملفوف المثالي (في طول ما لا يقل عن ثلاثه الهبات) إلى N-الطرفية أو C-نهاية الطرفية أو علي حد سواء. وكان لفائف ملفوفه مزدوجة الأكثر الواعدة من التجارب تبلور في وقت سابق وتم تعديلها في وقت لاحق إدخال طفرات لتحسين بلوره كما هو موضح سابقا12.

2. التعبير علي نطاق واسع من له6 الموسومة نيمو-eeaa

  1. تحويل بناء إلى BL21 (DE3) الخلايا المختصة. تخزين في-80 درجه مئوية كخليه الجلسرين الأسهم.
  2. اليوم الأول-اعداد ثقافة بداية الخلية. في قارورة 125 mL Erlenmeyer ، أضافه 20 مل من محلول مرق رائع و 20 μL من 100 mg/mL الأسهم من الامبيسلين. أضافه بعض ميكروليتر من الخلية الجلسرين الأسهم (من-80 درجه مئوية تخزين BL21 (DE3) الخلايا المختصة تحولت مع ناقلات).
  3. هز الثقافة كاتب 10 مل بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية ، 220 دوره في الدقيقة (حوالي 15 ساعة).
  4. اليوم الثاني – من البداية ، تمييع إلى600 OD = 0.1 في 250 مل من مرق رائع. أضافه الامبيسيلين إلى تركيز نهائي من 100 ميكروغرام/مل. ينمو إلى600 OD = 0.8-1.0.
    1. أضافه ايزوبروبيل β-د-1-ثيوغالالاكتويرانيوسيد (IPTG) إلى 500 μM ، وتنمو ل 4 ح في 37 درجه مئوية.
    2. قياس OD600 من الثقافة المستحثة بعد 4 ح. يجب ان تصل الثقافة إلى od600 = 6-10.

3. تنقيه له6 الموسومة نيمو-eeaa

  1. تدور ثقافة الخلية إلى أسفل في 3,800 x g لمده 20 دقيقه في 4 ° c.
  2. حفظ بيليه الخلية وتجاهل المتوسطة.
    ملاحظه: يمكن حفظ بيليه الخلية وتخزينها في-20 درجه مئوية في هذه المرحلة ، لتنقيه في وقت لاحق.
  3. أعاده تعليق الخلايا في 40 mL من العازلة تحلل التي تحتوي علي 20 مم تريس ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 10 مم ايميدازول ، 2 مم MgCl2، 0.5 mm فينيل ميثيل السلفونيل فلوريد ، 2 مم ديثيوثريتول (dtt) ، و 3 μl من النواة البننوداز.
    ملاحظه: النيكل الذي تمت تعبئته المعدن اللوني التقارب أيون (ايماك) العمود المستخدمة متوافق مع 2 مم DTT. بدلا من ذلك ، 0.2 mM تريس (2-كربوكسيل ايثيل) فوسفونين (TCEP) يمكن استخدامها.
  4. انقسام أعاده تعليق الخلايا إلى اثنين من الارصفه 20-25 mL.
  5. Lyse الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية (الضغط التقريبي 25,000 psi) ، وتكرار 2-3 مره لكل قسامه (في غرفه الباردة).
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن ان يكون تفكيك الخلايا بواسطة سونيكيشن (لم يتم اختبارها في هذا البروتوكول).
  6. أضافه اليوريا إلى الخلية محلله إلى تركيز النهائي من 8 M ، والسماح لاحتضان علي منصة هزاز لمده لا تقل عن 2 ح أو ما يصل إلى بين عشيه وضحيها. هذا وجميع الخطوات تنقيه التالية ، باستثناء غسيل الكلي ، يمكن ان يؤديها في درجه حرارة الغرفة.
  7. اليوم 3-نقل محلله إلى أنابيب اولتراسينتريفوجي والوزن التوازن ، وضمان الأنبوب يملا الأنابيب إلى ما لا يقل عن 3/4 كامله. تدور محلله في 125,000 x ز ل 45 دقيقه عند 25 درجه مئوية. Decant ماده طافي في كوب 100 mL للتحميل علي العمود.
    ملاحظه: سيؤدي يطرد عند درجه حرارة 4 درجات مئوية إلى تعطل اليوريا.
  8. علي نظام اللوني السائل السريع ، وأزاله الايثانول من ايماك 5 مل العمود مع 25 مل من نقاء H2س في 5 مل/دقيقه ، تليها 25 مل من العازلة التي تحتوي علي 20 مم تريس ، 150 mm كلوريد الصوديوم ، 500 mm ايميدازول ، 2 مم dtt ، pH 8.0 ، ثم 25 مل من العازلة ملزمه تحتوي علي 20 مم تريس ، 150 mm كلوريد الصوديوم ، 10 مم ايميدازول ، 2 مم dtt ، 8 م اليوريا ، pH 8.0.
  9. تحميل اليوريا المحتضنة سوبرناتانت في 3 مل/دقيقه علي العمود ايماك ، وجمع التدفق من خلال. اغسل العمود ل 10 مجلدات العمود مع العازلة ملزمه في 3 مل/دقيقه.
  10. Refold نيمو-EEAA بناء علي عمود بواسطة غسل العمود مع العازلة للطي لحجم العمود 20 في 3 مل/دقيقه ، والتي تحتوي علي 20 مم تريس ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 10 مم ايميدازول ، 2 مم DTT ، pH 8.0.
  11. أداء التدرج اللوني من نيمو-EEAA ، من 10 إلى 500 mM ايميدازول علي التدرج حجم 12 العمود ، وجمع كل التملص في لوحه جمع كسر (1 مل الكسور).
  12. مواصله التملص في 500 mM ايميدازول لمجلدين العمود ، والاستمرار في جمع.
  13. تشغيل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS)-بولياكرياميد هلام الكهربائي (PAGE) من الكسور لتحديد وجود نيمو-EEAA في كسور الشطف.
    ملاحظه: استخدمنا 10 ٪ اكريلاميد ، ميس العازلة.
  14. كسور التجمع التي تحتوي علي البروتين المستهدف النقي.
  15. قياس تركيز البروتين من قبل الفحص برادفورد17.
    ملاحظه: هذا ضروري لتقدير كميه الانزيم البروتيني لعلامة الانقسام.

4. له6 الوسم الانقسام وتنقيه

  1. أضافه TEV في 1:10 نسبه الوزن من TEV: نيمو-البروتين EEAA ليلتصق له6 العلامة. تم تنقيه الانزيم البروتيني TEV في المنزل.
    ملاحظه: تحسين كميه TEV ، والوقت ودرجه الحرارة المطلوبة لانشقاق كامل بشكل منفصل.
    1. اكسبرس TEV البروتيني ، S219V متحولة18 في BL21 (DE3)-بريل الخلايا وتنقيه كما هو موضح في وقت سابق19. لفتره وجيزة تنمو الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2 ، lyse بواسطة الصحافة الفرنسية وتنقيه باستخدام عمود IMAC. تخزين البروتين النهائي في 25 مم العازلة فوسفات الصوديوم ، pH 7.8 ، 150 mM NaCl ، 1 مم أدتا ، 2 مم DTT ، 20 ٪ v/v الجلسرين.
  2. الديزه العينة بين عشيه وضحيها (حوالي 15 ح) في 4 لتر من 20 مم تريس ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 2 مم DTT ، pH 8.0 ، للسماح للانقسام وأزاله ايميدازول الزائدة من العينة لتنقيه اللاحقة.
  3. اليوم الرابع – أزاله العينة من الغسيل الكلوي. تشغيل هلام الصفحة SDS من العينة من الانقسام TEV لضمان اكتمال الانقسام.
  4. علي نظام اللوني السائل السريع ، وأزاله الايثانول من العمود ايماك 5 مل مع 25 مل من نقاء H2في 5 مل/دقيقه ، تليها 25 مل من العازلة التي تحتوي علي 20 مم تريس, 150 mm كلوريد الصوديوم, 500 mm ايميدازول, 2 مم dtt, pH 8.0, ثم ملزمه العازلة التي تحتوي علي 20 مم تريس, 150 mm كلوريد الصوديوم, 10 مم ايميدازول, 2 مم dtt, pH 8.0.
  5. تحميل العمود في 1 مل/دقيقه مع TEV-كليفيد نيمو-EEAA. المشقوق نيمو-eeaa سوف الوت في التدفق من خلال: جمع في لوحه جمع كسر بئر 96 (1 مل الكسور). غسل العمود لخمسه مجلدات العمود من 20 مم تريس ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 10 ملم ايميدازول في 1 مل/دقيقه ، والاستمرار في جمع جزء لوحه جمع.
  6. Elute TEV وغير المشقوق له6-نيمو-eeaa مع ثلاثه مجلدات العمود من 20 مم تريس ، 150 mm كلوريد الصوديوم ، 500 mm ايميدازول ، 2 مم Dtt ، pH 8.0 ، جمع الشطف في قارورة 50 mL.
  7. تشغيل البيانات الخاصة ب SDS-الصفحة هلام من تدفق-من خلال الكسور لتحديد وجود المشقوق نيمو-EEAA.
  8. تجمع تدفق من خلال الكسور التي تحتوي علي المشقوق نيمو-EEAA بناء ، والتركيز باستخدام المكثف الخلايا يحركها إلى 5 مل. غشاء الوزن الجزيئي للقطع (MWCO) = 3 كده.
  9. باستخدام غشاء موكو 3 كده ، العينة مركزه في 2 لتر من 20 مم تريس ، 100 mM كلوريد الصوديوم ، 2 مم DTT ، pH 8.0 لمده 2 ح. تغيير العازلة غسيل الكلي إلى 2 لتر من العازلة غسيل الكلي الطازجة لغسيل الكلي بين عشيه وضحيها (حوالي 15 ساعة) ، في 4 درجه مئوية.
  10. اليوم 5-تحميل 5 مل من عينه ديزيد علي حجم استبعاد اللوني (SEC) 16 مم × 60 سم العمود (34 μm متوسط حجم الجسيمات) في 1 مل/دقيقه في تريس 2 ملم ، 100 mM كلوريد الصوديوم ، 2 مم DTT ، pH 8.0. كرر مع أعمده اضافيه اعتمادا علي وحده تخزين العينة.
  11. تجمع الكسور المقابلة لديميريك نيمو-EEAA.
    ملاحظه: نيمو-EEAA التملص بين 60-65 mL ، المقابلة لأكبر بروتين الوزن الجزيئي ، نظرا لطبيعة ممدود لفائف ملفوف ديميريك.
  12. التركيز باستخدام المكثف خليه يحركها و MWCO = 3 الغشاء كده إلى تركيز نهائي من 113 μM (1.65 ملغ/مل).
  13. Aliquot البروتين وتخزين في 4 درجه مئوية (مستقره لأكثر من 1 شهر).

5. الكشف عن مصفوفة متفرقة

ملاحظه: يقوم البروتوكول باجراء تجارب التبلور باستخدام الشاشات المتاحة تجاريا واعداد تجارب السقوط الجالسة باستخدام روبوت بلوره. يتم جمع الصور الكريستالية تلقائيا بواسطة التصوير.

  1. استخدام شاشات مصفوفة متفرقة متاحه تجاريا (انظر جدول المواد) ، ماصه 60 μl من محلول مصفوفة متفرقة في كل من الآبار 96 من لوحه البلورة قطره 2 للجلوس قطره بخار الانتشار (حل الخزان).
  2. باستخدام واضعه قطره الروبوتية ، الاستغناء 100 nL من محلول البروتين في 1.65 mg/mL في نسبه 1:1 مع محلول الخزان في قطره 1 لحجم النهائي من 200 nL ؛ ثم 66 nL من محلول البروتين مع 134 nL من حل الخزان لحجم النهائي من 200 nL في قطره 2 (1:2 نسبه).
  3. ختم اللوحة باستخدام 3 بوصه وختم الشريط علي الفور بعد الاستغناء.
    ملاحظه: ستجف قطرات إذا تركت تتعرض للغلاف الجوي لفتره أطول من 2-3 دقيقه.
  4. تخزين الصواني في تخزين تصوير التبلور ، عند 20 درجه مئوية ، والتحقق من الصور التي تم جمعها تلقائيا لوجود الكريستال ، بدءا بعد يومين.
    ملاحظه: بدا فحص التبلور بالتوازي مع تحسين البناء. بلورات الاوليه التي شكلت في الحالات التالية (الشاشات التجارية المدرجة في جدول المواد): ا) 0.1 M تريس ، pH 8.0 ، 30 ٪ v/v البولي إيثيلين غليكول (PEG) السيدة 550 ، 5 ٪ بولي γ ، حمض الجلوتاميك ، 200-400 كده منخفضه الوزن الجزيئي البوليمر (بغ-LM) ؛ ب) 0.1 M تريس ، الأس الهيدروجيني 7.8 ، 20 ٪ ث/v PEG السيدة 2k ، 5 ٪ بغ-LM ؛ ج) 0.1 M تريس ، pH 7.8 ، 20 ٪ ث/v PEG 3350 ، 5 ٪ بغ-LM. وبلورات الشاشة مصفوفة متفرقة الفقراء شعريه التوحيد; ولذلك ، فانها سوف تبدو الفقراء باستخدام التصوير عبر الاستقطاب. استخدام التصوير الاشعه فوق البنفسجية للتاكد من ان البلورات تحتوي علي البروتين. خطوه توليد مخزون البذور التالية ضرورية للحصول علي بلورات جوده الانكسار النهائية.

6-توليد مخزون البذور

ملاحظه: نحن التكرار الحصول علي بلورات لتوليد البذور في 0.1 M تريس الأس الهيدروجيني 8.0 ، 5 ٪ بغ-LM ، 3.6 ٪ ث/v PEG 20k. ومع ذلك ، فان بلورات تظهر الفسيفساء عاليه وغير صالحه لجمع البيانات في هذه المرحلة.

  1. باستخدام مجموعه لتوليد البذور ، واعداد الأسهم البذور عن طريق التنضيد من قطره كامله مع الكريستال الحالية ، ووضع في 50 μL من حل حاله التبلور في قارورة المقدمة.
  2. الدوامة الأسهم البذور لمده 3 دقائق ، نبض 20 ق علي و 10 ليالي قباله.
  3. المخزون البذور المخففة بشكل متسلسل في 1:10 الزيادات إلى 1:10000. تخزين جميع المخففات في 4 درجه مئوية ، لمزيد من الاستخدام.

7. الشاشات الدقيقة

  1. تصميم شاشات غرامه متفاوتة الظروف لتريس ، بغ-LM ، و PEG. تختلف طول الوتد لصواني الفردية.
    ملاحظه: الشاشة الجميلة التي أنتجت الكريستال المستخدمة لتحديد هيكل نيمو-EEAA استخدمت الشروط التالية: 0.1 M تريس الأس الهيدروجيني 8; [بغ-م] اختلف من 8 إلى 0% في أعمده 1-12. الصفوف A-H فرز أوتاد مختلفه ، مع تركيزات متفاوتة في الاعمده 1-12 علي النحو التالي. A: PEG 200 (0-40 ٪ v/v) ؛ B: PEG 400 (0-40 ٪ v/v) ؛ C: PEG السيدة 500 (0-40 ٪ v/v) ؛ D: PEG 1000 (0-30 ٪ ث/الخامس) ؛ E: PEG 3350 (0-30 ٪ ث/الخامس) ؛ F: PEG 6k (0-30 ٪ w/v) ؛ G: PEG 10k (0-20 ٪ w/v) ؛ H: PEG 20k (0-20 ٪ w/v). ظهرت البلورة في H4 جيدا (5.45 ٪ w/v PEG 20k ، 5.8 ٪ ث/v بغ-LM). في هذا البروتوكول ، تم استخدام معالج السائل باني الشاشة البروتين البلورية لبناء الشاشات.
  2. البذور المخزون البروتين في 1:25 نسبه الحجم من 1:1000 تخفيف البذور.
    ملاحظه: تركيز نيمو-EEAA سوف تنخفض قليلا ، ولكن البلورات سوف لا تزال تشكل.
  3. كرر الخطوة 2 باستخدام 1:10000 البذور التخفيف ، نفس نسبه حجم 1:25.
  4. باستخدام واضعه قطره ، الاستغناء 100 nL من محلول البروتين في 1.65 mg/mL ، مع 1:1000 التخفيف من المخزون البذور إلى نسبه 1:1 مع حل الخزان في قطره 1 لحجم النهائي من 200 nL. كرر لقطره 2 ، ولكن مع 1:10000 التخفيف من المخزون البذور الحالية.
  5. ختم اللوحة باستخدام 3 بوصه وختم الشريط علي الفور بعد الاستغناء.
    ملاحظه: ستجف قطرات إذا تركت تتعرض للغلاف الجوي لفتره أطول من 2-3 دقيقه.
  6. تخزين الصواني في تخزين تصوير ، في 20 درجه مئوية ، والتحقق من الصور التي تم جمعها بعد يومين لوجود الكريستال.
  7. تحقق من بلورات مع تصوير عبر الاستقطاب لتوحيد شعريه ، لتحديد لظروف واحده لاعداد الصواني التالية.

8. توليد بلورات لجمع البيانات

  1. تصميم شاشات حاله واحده حول تريس ، بغ-LM ، وحاله PEG التي أنتجت بلورات موحده كما حللتها الصور عبر الاستقطاب ، وأكبر بلورات ممكن.
    ملاحظه: بلورات من هذه الحالات غير النظامية في الشكل ، ومعظمها ورقه رقيقه مستطيله. انه مفتاح لتحديد شرط حيث يتم تعريف حواف البلورة جيدا ويكون أكبر سمك ممكن.
  2. جعل 20 مل من حاله تبلور باليد.
  3. باستخدام pipettor متعدد القناات ، والاستغناء عن 60 μL في بئر في 2 غرفه قطره ، 96 لوحه تبلور جيدا للجلوس قطره بخار الانتشار.
  4. اعداد مخزون البذور كما هو موضح في الخطوة 6.2.
  5. الاستغناء عن البروتين كما هو موضح في الخطوة 6.3.
  6. ختم اللوحة باستخدام 3 بوصه وختم الشريط علي الفور بعد الاستغناء.
    ملاحظه: ستجف قطرات إذا تركت تتعرض للغلاف الجوي لفتره أطول من 2-3 دقيقه.
  7. تخزين الصواني في التصوير في 20 درجه مئوية والتحقق من الصور لوجود الكريستال كل يوم.
  8. التحقق من الصور عبر الاستقطاب من بلورات لتوحيد شعريه ، لتحديد بلورات لجمع البيانات.

9-تحديد الحماية من البرد

  1. لاختبار ريفيين ، إنشاء حلول الأسهم المقابلة لظروف التبلور ولكن تحتوي علي 30 ٪ ، 20 ٪ ، 10 ٪ ، و 5 ٪ تركيز اعلي من كل مكون. سيؤدي أضافه وحده التخزين المبردة إلى التركيز النهائي للمكونات التي هي نفس ظروف التبلور.
    ملاحظه: لاختبار لحماية البرد في تركيز 30 ٪ من حجم لحاله بلوره 0.1 M تريس ، تبدا مع حل الأسهم من 0.143 M تريس ، قبل أضافه البرد واقيه.
  2. من عده الكواشف التبريد ، وخلق 10 μL من عينه لاختبار البرد واقيه من خلال خلط 30 ٪ من حجم حاله البرد في 70 ٪ من حل الأسهم حاله التبلور ، للتركيز النهائي من 30 ٪ البرد واقيه في ظروف التبلور الأصلي. اخلط جيدا.
    1. باستخدام ماصه بقياس 10 μL ، خذ 5 ميكرولتر من محلول التبريد المحمي بالتبريد ويغرق الطرف الماص في النيتروجين السائل. إذا لوحظ الجليد ، وتجاهل.
    2. اختبار جميع ريفيين بنسبه 30 ٪. للحلول الناجحة ، كرر العملية في 20 ٪ ، ثم 10 ٪ و 5 ٪ من البرد واقيه.
    3. الاستفادة من الحل الناجح لحماية التبريد مع أصغر نسبه مئوية للحماية من البرد ، أضافه 0.5 μL من المحلول إلى قطره اختبار مع البلورات الحالية. مراقبه تحت المجهر ، توقيت كيف طويلة الكريستال يدوم في حاله ، ان لم يكن لأجل غير مسمي.
      ملاحظه: هذه البلورات هي للاختبار فقط سيتم تجاهلها. للحصول علي نيمو-EEAA ، 12 ٪ 1 ، 2-propanediol هو الحل الأمثل للحماية من البرد. 12% حسابات لتخفيف الحل التبريد-بروتكدانت سوف تواجه عندما تضاف إلى قطره الكريستال من حوالي 100 nL ، للتركيز النهائي التقريبي من 1 ، 2-propanediol من 10 ٪.

10. الكريستال حلقات

  1. بلورات حلقه 1-2 أيام قبل الشحن إلى synchrotron.
    ملاحظه: سوف تكون البلورات تقريبا 60-100 μm في القطر: 0.05-0.10 مم الحلقات مثاليه للحلقات.
  2. اقطع الشريط من اعلي البئر
  3. أضافه 0.5 μL من الحل تبلور التي تحتوي علي 12 ٪ 1 ، 2-propanediol البرد-بروتيكتانت مباشره إلى البئر.
    ملاحظه: التركيز النهائي من 1 ، 2-propanediol هو الآن في ما يقرب من 10 ٪ ، وذلك بسبب التخفيف من قبل 100 nL من حل انخفاض (انخفاض حجم الإسقاط التقريبي من الاوليه 200 nL ، بسبب انتشار بخار).
  4. حلقه البلورة من البئر.
    ملاحظه: بلورات غالبا ما تنمو علي الجزء السفلي من البئر ولكن سوف أزاحه مع دفعه لطيف من حلقه. مره واحده طردت ، حلقه.
  5. تخزين الكريستال التي تحتوي علي البرد الحلقات في التجعيد مغمورة في N السائل2.
  6. تخزين هذه الكتل في السائل N2 في dewar قارورة حتى تكون جاهزه للشحن للحصول علي الاشعه السينية الانكسار في synchrotron.

11-جمع البيانات

  1. جمع بيانات انكسار الاشعه السينية. في هذا البروتوكول ، استخدم AMX beamline (ID: 17-ID-1) ، الوطنية الضوء Synchrotron المصدر الثاني.
    ملاحظه: تم جمع البيانات في الموقع ولكن يمكن جمعها عن بعد. جمع البيانات في منطقه البلورة التي أظهرت التوحيد شعريه في الصور عبر الاستقطاب. ضع البلورات في الحلقة بحيث لا يتضمن جمع البيانات مناطق "فقيره" من البلورة بينما تدور البلورة في مقياس الدوران. وجاءت البيانات التي قدمت أفضل قرار من جمع علي حافه امتداد الكريستال حوالي 5 × 5 ميكرون في الحجم. استخدام rastering لتحديد أفضل المناطق علي الكريستال لجمع20.

12-معالجه بيانات الاشعه السينية

  1. معالجه مجموعه البيانات إلى الدقة الأعلى التي تم جمعها (1.8 Å) مع XDS IDXREF البرنامج لتحديد المساحة ، خليه وحده ، ومحتوي المذيبات.
  2. دمج البيانات باستخدام برنامج دمج XDS.
  3. عمليه تحجيم كثافة من برنامج XDS اكسسكل باستخدام STARANISO الخادم ، وذلك باستخدام I/الشامل ط قطع يعني من 1.2 لسطح الحد من الانكسار للبيانات.
    ملاحظه: لن يتم قص البيانات في الاهليلجي الحقيقي. الاحتفاظ بجميع البيانات أعلاه الأول/المجمل من 1.2 قطع. ستكون الإحصاءات المتعلقة بالبيانات المحسوبة لاكتمال الكروية ضعيفه بسبب الاقتطاع غير الكروي. وكان اكتمال اهليلجيه 88 ٪ مع اعلي القرارات من: 1.88 Å ، 2.10 Å و 2.55 Å علي طول * ، b * و c المحور ، علي التوالي.

13-الحل الهيكلي

  1. الاستفادة من هيكل الاشعه السينية من GCN4 (PDB: 4DMD)15 كنموذج البحث عن الاستبدال الجزيئي باستخدام mrage21 في فينيكس22. تم تعريف هيكل 4DMD في MRage بأنه "الفرقة" ، وحل MRage بنيت بنجاح جزء الهيكل المطابق لمحول لفائف N-الطرفية من نيمو-EEAA ، متماثلة لنموذج البحث ، لكل من السلاسل في dimer.
    ملاحظه: إيقاف تصحيح تباين في فيزر ، أو سيتم زيادة تحجيم البيانات مره أخرى.
  2. الاستفادة من الجولات المتعاقبة من البناء التلقائي23 في فينيكس والبناء اليدوي (باستخدام 2fo-fc و fo-fc الخرائط ، في coot24) لبناء ما تبقي من الهيكل.
  3. بناء البقايا التي لا تزال مفقوده في النموذج بناء علي خرائط 2Fo-fc وf-fc ، وذلك باستخدام coot24.
    ملاحظه: المرحلة الاخيره تنطوي علي بناء 4 بقايا N-الطرفية و 4 المخلفات C-الطرفية لكل مونومر. كما تم تعديل وضع السيدهين يدويا حسب الحاجة.
  4. حساب خريطة حذف مركب باستخدام فينيكس وإغفال 10 ٪ من الهيكل.

14-صقل الهيكل

  1. صقل الهياكل مع فينيكس صقل. تشغيل التحسينات الاوليه ضد الأوزان السائبة المذيبات والكيمياء الفراغية ، والاسترخاء RMSbond والقيود Rmsbond إلى 0.01 و 1.0 ، علي التوالي. استمر في الصقل علي العوامل B الفردية ومعلمات TLS و إشغالات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستنساخ والتعبير وتنقيه مجال الربط IKK من نيمو.
البروتوكول المتبع في هذه الدراسة للحصول علي التسلسل النهائي من نيمو-EEAA (الشكل 1ا) ، الذي أنتج بلورات جوده الانكسار ، وشملت التعبير وتوصيف جميع البنيات الوسيطة ، بما في ذلك أضافه محولات لفائف ملفوف في N-و أو C-المحطة ، والطفرات C76A ، C95S والطفرات E56A ، E57A ويعرض الشكل 1(ب ) هلاما من العينات التي تم جمعها خلال عمليه التنقية علي النحو المبين في المخطط في الشكل 1(ج). يتم التعبير عن البروتين بشكل مفرط في كولاي ويظهر كنطاق تقريبا في علامة الوزن 14 كده ميغاواط علي الهلام SDS-PAGE (حاره 3 ، الخلايا التي تم جمعها في الحصاد وتفكيك في المخزن المؤقت عينه laemmli تستكمل باليوريا 8 M). يبدو البروتين نقيا بعد أول عمود IMAC ويعرض النطاق الترددي والفرقة الثنائية علي مستوي علامات 14 و 28 كيلو واط علي الهلام الخاص ب SDS-PAGE (lane 9). الانقسام TEV هو عمليا كامله بعد البروتوكول والبروتين التملص مع تدفق خلال خلال العمود ايماك الثانية تماما تقريبا باعتبارها dimer ، في ميغاواط المتوقع (الفرقة أدناه 28 ده). يعرض اللوني استبعاد الحجم ذروه واحده التملص بين 60-65 mL والمقابلة في تجربتنا إلى ديمر (الشكل 1د). لفائف ملفوف ديميريك دائما التملص في وقت سابق مما كان متوقعا في SEC بسبب شكل ممدود من لفائف ملفوف ونصف قطرها هيدروديناميكي بالتالي كبيره10. لا يزال نيمو-eeaa في الكسور من الذروة SEC لا تزال تظهر كمونومر والديمر علي هلام الصفحة (الممرات 14-15). ومن المهم الاستفادة من المكثفات التي يحركها الخلايا لمنع التجميع المحتمل للعينه وهطول الامطار عند التركيز.

بلوره نيمو-EEAA
تم الحصول علي بلورات الاوليه من الشاشة التجارية باستخدام الشركة (انظر جدول المواد) ، وذلك باستخدام 1.65 ميكروغرام/مل من نيمو-eeaa في 2 مم تريس ، 100 mm كلوريد الصوديوم ، 2 مم Dtt ، pH 8.0. فحص دقيق أنتج بلورات في 0.1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8.9 ، 5 ٪ بغ-LM ، 3.6 ٪ PEG 20k (الشكل 2ا) ، والتي استخدمت لإنتاج البذور المخزون. تم الحصول علي بلورات النهائي مع البذر في 0.1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 5.8 ٪ بغ-LM ، 5.45 ٪ PEG 20k (الشكل 2ب).

جمع البيانات وتحديد الهيكل
بلورات نيمو-EEAA تعاني من الفسيفساء والمتباينة. بلورات شكلت في P 1 21 1 الفضاء المجموعة ، مع دقه البيانات متفاوتة في * ، b * و c * محور (1.88 å ، 2.10 å و 2.55 å). وترد أمثله علي نبذات الانكسار في الشكل 3. تم الحصول علي البيانات في AMX (17-معرف-1) خط من NSLS II ، مع حجم شعاع من 7 × 5 μm2. وكان حجم الشعاع الصغير ضروريا للتركيز علي الجزء المطلوب من البلورة (الشكل 2ب) وضمان جوده البيانات.

ويتطلب البروتوكول الناجح لتحديد الهيكل اقتطاعا متباين الخواص للبيانات باستخدام خادم STARANISO27 (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi) ، يليه التدريج بالاستبدال الجزيئي باستخدام MRAGE21 داخل فينيكس22 وبنيه ديميريك GCN4 (PDB: 4DMD)15 كنموذج بحث. في الحل من هذا الهيكل التدريجي حاولت في البداية عن طريق وضع العلامات ميثيونين الأصلي مع SeMet. الاشاره شاذة كان أيضا ضعيفه, علي الأرجح واجبه إلى المذيبة يعرض طبيعة من Met95 في الشكل غير منضم من [نيمو] (استعملت SeMet95 كان بنجاح لمراحل من ال [نيمو]/[ايككبت] بنيه9).

تمت محاولة تحليل البيانات الاوليه مع اقتطاع كرويه من البيانات إلى 2.3 Å. هذه المجموعة من البيانات لا يمكن ان تكون بنجاح علي مراحل من قبل استبدال الجزيئية ولكن تم الحصول علي حل باستخدام السيد رشيد25 وهيكل نيمو (44-111) في مجمع مع IKKβ (701-745) كنموذج بحث (PDB: 3BRV)9. تعذر صقل هذا النموذج الاولي بنجاح. استخدمنا خادم الانكسار المتباين في جامعه كاليفورنيا26 إلى بيضاوي الشكل باقتطاع البيانات وأزاله تفاوت من التحجيم متباين الخواص. ويمكن ان تكون مجموعه البيانات المجهزة حديثا علي مراحل بالاستعاضة الجزيئية. لزيادة تحسين البيانات ، استخدمنا خادم STARANISO27 لاقتطاع متباين الخواص من البيانات وتم تصحيح السعات مع عامل تصحيح متباين الخواص مع تقدير بايزيه28. وقد استخدمت هذه البيانات ، التي أسفرت عن زيادة في عدد الانعكاسات الفريدة ل19,560 ، لصقل الهيكل. مركب حذف الخرائط حيث تحسب مع فينيكس ، باستثناء 10 ٪ من الذرات في وقت ، ومقارنه مع نموذج الهيكل النهائي ، للتاكد من ان الهيكل لم يكن متحيزا من قبل النموذج الذري. النموذج البلوري مكتمل باستثناء البقايا الاولي والاخيره في سلسله ا من نيمو-EEAA ، والتي لم يلاحظ كثافة الكترون.

نيمو-EEAA هو ديميريك ، غير النظامية ، لفائف ملفوف موازيه من ~ 175 Å في الطول. وتشمل المنطقة لفائف ملفوف العادية تسلسل محول لفائف المثالي في N-المحطة (بقايا 20-50) وأول اثنين من الهبات من التسلسل الصحيح نيمو (بقايا 51-65). لفائف ملفوف العادية موجودة أيضا في C-المحطة ، بدءا من نيمو بقايا 97 وتشمل C-الطرفية المثالي لفائف محول لفائف (الشكل 4ا). الجزء المركزي ، وتشمل البقايا نيمو 66-98 يعرض مسافات متداخلة أكبر (التباعد بين الحلزونية يذهب من متوسط قيمه 7.6 Å في هيكل ملفوف لفائف العادية إلى حد اقصي 11.5 Å في المنطقة غير النظامية) وغير المستمر واجهه مسعور مقارنه مع لفائف ملفوف المثالي. هذه المنطقة من نيمو يمثل أيضا واجهه لربط ikkβ ويخضع لتغيير المطابقة علي يجند ملزمه. الهيكل المنضم ikkβ يعرض أكثر انفتاحا ملفوف لفائف التشكيل لاستيعاب يجند مع تباعد بين حلزونية أكبر من 1.0 إلى 2.2 Å في هذه المنطقة (الشكل 4ب)12. في البقايا البنية apo Leu93 ، Met94 ، Lys96 ، Phe97 و Arg101 يتم تحويلها نحو مركز لفائف ملفوف لغزو جيب الربط (المسافة cα-cα لPhe97 هو أكثر صرامة من قبل 2.9 Å) ، مع التاثير العام لإغلاق المشقوق مسعور الكبيرة التي تستضيف يجند في هيكل ikkβ-منضم.

Figure 1
الشكل 1: تنقيه نيمو-EEAA. (ا) محاذاة التسلسل من نيمو من الإنسان العاقل، موس Musculus وبوس بوفيس والمهندسة نيمو-eeaa. يتم تسطير تسلسل محولات لفائف ملفوف ، ويتم تمييز الطفرات باللون البرتقالي. (ب) هلام من الكسور التي تم جمعها اثناء التعبير والتنقية (كما هو مسمي ويشار اليه في الرسم البياني للتدفق 1c). 10 ٪ اكريلاميد ، ميس العازلة. (ج) مخطط انسيابي لتنقيه نيمو-eeaa. (D) حجم الاستبعاد الشخصية التي تشير إلى ديمر من نيمو-eeaa (الأزرق). في اللون الأخضر ، يشار إلى علامات الوزن الجزيئي (كده). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المورفولوجية وحجم بلورات نيمو-EEAA. (ا) بلوره من نيمو-eeaa من شاشه مصفوفة متفرقة الاولي ، غير مصنفه. وقد استخدم هذا النوع من الكريستال لبذر لمحاولات التبلور اللاحقة (0.1 M تريس الأس الهيدروجيني 8.0 ، 5 ٪ بغ-LM ، 3.6 ٪ PEG 20k ؛ مع محلول البروتين في تريس 2 مم ، 100 mM NaCl 2 مم DTT ، pH 8.0). (B) الكريستال المستخدمة لجمع البيانات (0.1 M تريس الأس الهيدروجيني 8.0 ، 5.8 ٪ بغ-LM ، 5.45 ٪ PEG 20k ، مع محلول البروتين في 2 مم تريس ، 100 Mm nacl 2 مم Dtt ، pH 8.0). والمساحة التقريبية المستخدمة لجمع البيانات دائريه باللون الأحمر. يتم تعريف شريط مقياس لطول 100 μm في الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: بيانات البلورات التي تم الحصول عليها من بلورات نيمو. (ا) الصورة الجانبية لانكسار الاشعه السينية لبلوره نيمو المبكرة: تشير الشرائط الممدودة إلى الفسيفساء في البلورة. (ب) الصورة الجانبية لانكسار الاشعه السينية لبلورات نيمو-eeaa المحسنة. يتم رسم خاتم القرار في قرار المكانية من 2.5 Å. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: هيكل نيمو غير المنضم. (ا) يظهر نيمو-eeaa ديمر كشريط ، الضوء الأزرق = محولات لفائف ملفوف ، الأزرق = نيمو (51-112). (B) superposition من أبو نيمو-eeaa الهيكل (الأزرق ، PDB: 6MI3) نيمو (44-111) من الهيكل المنضم IKKβ (الرمادي ، PDB: 3BRV ، ikkβ لا يتم عرض) ، كما هو مبين شرائط ؛ يتم محاذاة الهياكل علي سلسله A ، المنطقة 44-111 فقط. وقد عدل هذا الرقم من المنشور السابق12. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كانت محاولات بلوره نيمو في النموذج غير المنضم غير ناجحه ، بما في ذلك محاولات استخدام البروتين بالطول الكامل والعديد من ثوابت الاقتطاع التي تشمل مجال ربط IKK. الخصائص الفيزيائية الحيوية لدينا من مجال الربط ikk من نيمو (بقايا 44-111) بواسطة ثنائيه التعميم ، nmr الطيفية والفلورية المتباينة أشارت إلى ان بناء ، وان كان قادرا علي ربط ikkβ ، وجدت في حاله تبادل المطابقة ، وليس مناسبه لبلوره9،10. نهجنا ينطوي علي هندسه بناء المجال IKK ملزم من نيمو التي اعتمدت أكثر استقرارا ، مطوية والاصليه مثل التكوين ، والقضاء علي المرونة التي منعت تبلور. المثالي ملفوف لفائف المجال محولات تنصهر إلى N-و C-تيرميني من نيمو (44-111) تسلسل تقدم ميزه استقرار ديميريك ملفوف لفائف اضعاف من نيمو الأصلي وتسهيل تبلور14. تم رصد سلوك سلسله من ثوابت البروتين في كل خطوه من خلال الصفحة SDS ، وحجم الفصل اللوني ، وثنائيه الابعاد الدائرية ، والتباين الفلوري والطيفي nmr ، كما هو موضح في وقت سابق10،12. علي الرغم من التحسن التدريجي في جميع المعلمات المطلوبة لا بناء أسفرت بلورات جوده الانكسار حتى الطفرات E56A, E57A وقدمت. وكانت الطفرات اعلي تاثير الطفرات التي اقترحها القصور الحراري السطحي خادم SERp29 التي لا تنطوي علي بقايا المتورطين في النقاط الساخنة من ملزمه ل ikkβ ، كما هو الشان في الهيكل المعقد نيمو/ikkβ. علي الرغم من ان يبني أخرى استقرار البنية المطلوبة من مجال ربط IKK من نيمو من خلال الربط ثنائي كبريتيد السيستين وملزمه IKKβ مع تقارب عاليه وقد وصفت30، والبروتوكول هنا وصف يمثل النهج الناجح الأول لهيكل تحديد المجال ikk ملزم من نيمو في شكل غير منضم.

ويتبع إنتاج البروتين وتنقيته الإجراءات القياسية في مختبرنا. علي خليه تحلل جزء كبيره من البروتين حاضره في الكسر غير قابل للذوبان, حتى عندما ينمو الخلايا بعد استقراء في 18 [ك], لذلك البروتين كان [سولبيلزد] في 8 [م] يوريا بعد [سل تحلل] وقبل تنقيه, ويطوي بينما يرتبط إلى العمود IMAC. الغسيل واسعه النطاق العمود البروتين المرتبطة علي حد سواء تحت ظروف الدفن وبعد أعاده الطي حاسمه لمنتج نقي بعد خطوه تنقيه الاولي. النقي نيمو-EEAA لديه ميل اعلي ليعجل من الثوابت السابقة ولكن لا يزال قابل للذوبان بما فيه الكفاية في ظل ظروف التبلور.

ومن الخطوات الحاسمة في تحديد الهيكل استخدام البذر. وفي نهج مماثل لفحص مصفوفة البذور الدقيقة31، استخدمت البذور الماخوذه من البلور الذي تم الحصول عليه اثناء فحص المصفوفات المتفرقة في فحص إضافي للظروف ، تليها جولة فحص دقيقه ، من أجل تحديد ظروف التبلور النهائية. معظم البلورات التي تزرع في الظروف النهائية عرض الفسيفساء عاليه وليست مناسبه لجمع البيانات. وقد تم فحص البلورات خلال عده زيارات لخط العرض وتم تحقيق أفضل جوده للبيانات من خلال جمع مجموعات البيانات علي حافه البلورة ، حيث حدث النمو الأحدث. كما كانت المنطقة التي أظهرت التوحيد شعريه في الصور عبر الاستقطاب الصغيرة ، كان من المفيد ان يكون الوصول إلى AMX beamline في NSLS الثاني ، وذلك بسبب حجم شعاع صغير.

نحن بنجاح تحديد هيكل نيمو-EEAA من قبل استبدال الجزيئية باستخدام كنموذج البحث هيكل ديميريك ملفوف لفائف من GCN415، والتي تم تعيينها إلى محولات ملفوف لفائف المثالي تنصهر في N-و C-تيرميني من تسلسل نيمو. وكان الاستبدال الجزيئي ناجحا حيث ان محولات GCN4 تحافظ علي بنيتها الاصليه عندما تنصهر في نيمو. وفي الوقت نفسه ، يمكننا التحقق من ان نيمو يحافظ علي بنيته الاصليه من خلال مقارنه الأجزاء غير المشاركة في ربط IKK بمنطقه الهيكل المناظرة في الهيكل المركب نيمو/IKKβ. كبديل ، يمكن ان يكون من الممكن استخدام هيكل نيمو في المجمع نيمو/ikkβ (PDB: 3brv)9 كنموذج بحث استبدال الجزيئية ، مع التركيز علي المونومر B ، الذي يتوافق مع السلسلة التي تخضع لتغيير أصغر المطابقة علي يجند ملزمه. وأظهرت هذه الاستراتيجية بعض النجاح الاولي باستخدام وحده السيد روزيتا من فينيكس.

وأخيرا ، كان من الضروري لتصميم بنيه ناجحه للاستفادة من جميع البيانات المتاحة في ورقه البيانات ، من خلال اللجوء إلى وقف متباين الخواص من البيانات كثافة المدمجة ، كما هو منصوص عليه من قبل خادم STARANISO27 أو الخادم تفاوت الانكسار في جامعه كاليفورنيا26.

الدور الأساسي الذي يقوم به مجمع نيمو/IKK في مسار NF-kB يجعله هدفا مرغوبا فيه لتحوير مسار التدخل العلاجي. تفاعلات البروتين والبروتين ، وخاصه عندما تنطوي علي واجهه ملزمه كبيره ، هي تحديا لكبح مع الببتيدات الصغيرة أو جزيئات صغيره ، وتصميم المانع القائم علي الهيكل يمكن ان توفر ميزه كبيره. ان الثوابت التي طورناها في مجال الربط IKK من نيمو التي قمنا بتطويرها تتغلب علي حدود نيمو المرن (44-111) لتسهيل التبلور وتصميم الهيكل. كما البناء بسهوله تبلور في شكل غير منضم ، ونحن نتصور ان البروتوكول نفسه يمكن تطبيقها بنجاح في بلوره مجمع نيمو مع مثبطات جزيء صغير ، لتحديد هيكل من شانه ان يوفر تفاصيل عن وسائط ملزمه والسماح لمزيد من التحسينات.

ويشير تحليل للتغليف البلوري في ظروف التبلور التي تحققت في هذا العمل إلى انه قد يفضل الربط بين البلورة المشتركة لربطها ببلورات أبو-بروتين. في حين توفر التعبئة والتغليف الكريستال بعض المساحة حول سلسله B من ديمر (6 إلى 10 å إلى أقرب سلسله) وعلي وجه واحد من موقع الربط (حوالي 13 å في المنطقة الساخنة بين Phe82-Phe87) ، جيب ملزمه متماثل مسدود تماما من قبل سلاسل القريبة ، ومنع يجند ملزمه.

لفائف ملفوف موجودة في نسبه كبيره في بروتينيه وضرورية في وظيفتها كما الفواصل الجزيئية ، والسقالات وفي الاتصال التغييرات المطابقة16. علي الرغم من وفره والأدوار ذات الصلة ، وهناك عدد قليل نسبيا من الهياكل من البروتينات ملفوف لفائف كامله الطول. استخدام محولات ملفوف لفائف قد تساعد في تثبيت المجالات الهيكلية للبروتينات ملفوف لفائف مع الحفاظ علي بنيتها الاصليه والمساعدة في التصميم الهيكلي وتوضيح وظيفتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر البروفيسور د. مادن علي العديد من المناقشات المفيدة في هذا المشروع. نشكر البروفيسور d. bolon لهديه من البلازميد التي تحتوي علي لفائف ملفوف GCN4 الأمثل. ونشكر الدكتور ب. قوه علي نيمو البلازميدات. ونشكر كريستينا ر. ارنولدي ، وتمار باساشفيلي ، وإيمي ا. كينيدي لإظهارها هذا الاجراء. ونشكر المرفق الأساسي لعلم البلورات البيولوجية وأقسام الكيمياء والكيمياء الحيوية & بيولوجيا الخلية في دارتموث لاستخدام معدات علم البلورات والافراد البيولوجيين لدعمهم. استخدم هذا البحث AMX beamline من المصدر الوطني للضوء Synchrotron الثاني ، وهو مكتب وزاره الطاقة الامريكيه لمرفق المستخدم العلوم تعمل لمكتب وزاره العلوم من قبل مختبر بروكهافن الوطني ببموجب العقد رقم DE-SC0012704. نشكر الموظفين في NSLS II علي دعمهم. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R03AR066130 ، R01GM133844 ، R35GM128663 و P20GM113132 ، ورواية Munck-بفيفيركورن والمنحة التفاعلية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 154 ، NF-κB ، نيمو ، IκB كيناز (IKK) ، نيمو ربط المجال (بنك دبي المحلي) ، لفائف ملفوف ، الاشعه السينية البلورات ، هندسه البروتين ، وتحديد هيكل ، تصميم المخدرات المستندة إلى هيكل
الإنتاج ، البلورة ، وتحديد الهيكل للمجال الملزم IKK من نيمو
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J.,… More

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter