Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af IKK-bindings domænet NEMO

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

Vi beskriver protokoller for strukturen bestemmelse af IKK-bindende domæne NEMO af X-ray crystallography. Metoderne omfatter protein ekspression, rensning og karakterisering samt strategier for vellykket krystal optimering og struktur bestemmelse af proteinet i sin ubundne form.

Abstract

NEMO er et stilladser protein, der spiller en vigtig rolle i NF-κB-vejen ved at samle IKK-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Ved aktivering er ikk Complex fosforylerer iκb molekyler, som fører til NF-κb nuklear translokation og aktivering af Target gener. Hæmning af NEMO/IKK interaktion er en attraktiv terapeutisk paradigme for graduering af NF-κB pathway aktivitet, gør NEMO et mål for hæmmere design og opdagelse. For at lette processen med opdagelse og optimering af NEMO-hæmmere, vi konstrueret en forbedret konstruktion af IKK-bindende domæne NEMO, der ville give mulighed for struktur bestemmelse af proteinet i APO form og mens bundet til små molekylvægt hæmmere. Her præsenterer vi den strategi, som anvendes til design, udtryk og strukturel karakterisering af IKK-bindende domæne NEMO. Proteinet udtrykkes i E. coli -celler, opløseliseret under Denaturerings betingelser og renses gennem tre kromatografiske trin. Vi diskuterer protokoller for at få krystaller til struktur bestemmelse og beskrive data erhvervelse og analyse strategier. Protokollerne vil finde bred anvendelighed til strukturen bestemmelse af komplekser af NEMO og små molekyle hæmmere.

Introduction

NF-κB-vejen aktiveres som reaktion på en række stimuli, herunder cytokiner, mikrobielle produkter og stress, for at regulere ekspression af målgener, der er ansvarlige for inflammatorisk og immunrespons, celledød eller overlevelse og spredning1. Patologier, herunder inflammatoriske og autoimmune sygdomme og kræft2,3,4,5 er blevet korreleret til hyperaktivering af stien, som har gjort graduering af NF-κb aktivitet et første mål for udviklingen af nye terapier6,7.

Især den kanoniske NF-κB-vej adskiller sig fra den ikke-kanoniske vej, der er ansvarlig for lymfadorganogenesen og B-celle aktivering, af den tidligere afhængighed af stilladset protein NEMO (NF-κB Essential modulator8) til samlingen af ikk-komplekset med kinaser ikkα og ikkβ. IKK-komplekset er ansvarligt for fosforyleringen af IκBα (hæmmer af κB), der er målrettet mod nedbrydning, hvilket frigør NF-κB-dimere til at omplacere til kernen for gentransskription1 og er derfor et attraktivt mål for udviklingen af inhibitorer til at moduere NF-κb aktivitet.

Vores forskning fokuserer på karakterisering af protein-protein interaktion mellem NEMO og IKKβ, målretning NEMO for udvikling af små molekyler hæmmere af IKK komplekse dannelse. Den minimale binding domæne NEMO, der kræves for at binde IKKβ, omfatter rester 44-111, og dens struktur er blevet fastlagt i kompleks med et peptid svarende til IKKβ sekvens 701-7459. Nemo og ikkβ danner en fire-Helix bundle, hvor Nemo dimer rummer de to skruelinjer af ikkβ (701-745) i en aflang åben rille med en udvidet interaktions grænseflade. IKKβ (734-742), også kendt som NEMO-binding domæne (NBD), definerer den vigtigste hot-spot for binding, hvor de to essentielle tryptophans (739.741) begrave dybt i NEMO lomme. Detaljerne i den komplekse struktur kan støtte i struktur-baserede design og optimering af små molekyle hæmmere rettet mod NEMO. Samtidig er det vanskeligt, at binding af et lille molekyle eller peptid ville genskabe i NEMO den fulde konformationsmæssige ændring (dvs. omfattende åbning af NEMO coiled-Coil dimer) forårsaget af binding af den lange IKKβ (701-745), som observeret i krystal, og strukturen af ubundet NEMO eller NEMO bundet til en lille molekyle hæmmer kan repræsentere et bedre mål for struktur-baserede stof design og inhibitor optimering.

Fuld længde NEMO og mindre trunkering konstruktioner, der omfatter IKK-bindende domæne har vist sig ufuldstændigt for struktur beslutsomhed i ubundet form via røntgenkrystallografi og nuklear magnetisk resonans (NMR) metoder10, som fik os til at designe en forbedret version af ikk-bindende domæne Nemo. Faktisk, NEMO (44-111) i ubundet form er kun delvist foldet og gennemgår konformationel udveksling og vi derfor indstillet til at stabilisere sin dikemeje struktur, coiled-Coil fold og stabilitet, samtidig bevare binding affinitet for IKKβ. Ved at tilføje tre heptads af ideelle dikemeje oprullet-Coil sekvenser11 på N-og C-Termini af proteinet, og en serie af fire punktmutationer, vi genererede Nemo-eeaa, en konstruktion fuldt dikemeje og foldet i en oprullet spole, som reddede ikk-bindende affinitet til nanomolær rækkevidde som observeret for fuld længde Nemo12. Som en yderligere fordel, vi håbede de coiled-Coil adaptere (baseret på GCN4 sekvens) ville lette krystallisering og i sidste ende støtte i røntgen struktur bestemmelse via molekylære udskiftning. Oprullet-Coil adaptere har været på samme måde udnyttes til både øge stabiliteten, forbedre opløsningen adfærd og lette krystallisering for trikemeje oprullet Coils og antistof fragmenter13,14. NEMO-EEAA er let udtrykkes og renses fra Escherichia. coli -celler med et Klødet histidin-tag, er opløseligt, foldet i en stabil, dikemeje, rullet spole og er let krystalliseret, med diffraktion til 1,9 Å. Tilstedeværelsen af de bestilte coiled-Coil regioner i GCN4 kunne desuden støtte i udfasning af data fra krystaller af NEMO-EEAA ved molekyl udskiftning ved hjælp af den kendte struktur af GCN415.

I betragtning af de opnåede resultater med APO-NEMO-EEAA, mener vi de protokoller, der er beskrevet her, kunne også anvendes til krystalliseringen af NEMO-EEAA i nærværelse af små peptider (som NBD peptid) eller små molekyle hæmmere, med det mål at forstå kravene til NEMO hæmning og struktur-baseret optimering af indledende bly hæmmere til høj affinitet I betragtning af den plasticitet og dynamiske karakter af mange coiled-Coil domæner16, kan brugen af de coiled-Coil adaptere finde mere generel anvendelighed i medvirken strukturel beslutsomhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. konstruktion af konstruktion til krystallografi

  1. Klon sekvensen af NEMO-EEAA som i tidligere publikation12 i en vektor for ekspression i E. coli ved hjælp af T7 promotoren, herunder et N-terminal Hexa-histidintag og et proteasespaltings sted.
    Bemærk: i denne protokol, vi brugte en vektor modificeret til at omfatte en N-terminal Hexa-histidine tag og en tobak etch virus (TEV) kavaler plads10. Denne vektor letter spaltning af hans tag for protein krystallisering og efterlader kun den korte forlængelse af GSW rester før starten af den ønskede protein sekvens. Den vektor, hvorfra dette blev afledt, og alternative vektorer er opført i tabellen over materialer. I denne protokol blev efterfølgende ændringer af den oprindelige NEMO (44-111) sekvens introduceret trinvis, som beskrevet tidligere10, ved hjælp af side instrueret mutagenese. Vi oprindeligt forsøgte at stabilisere NEMO coiled-Coil dimer tilføje den ideelle coiled-Coil adaptere (i en længde på mindst tre heptads) til N-terminalen eller C-terminalen ende eller til begge. Den dobbelte oprullet spole var den mest lovende fra tidligere krystalliserings forsøg, og det blev efterfølgende modificeret introducerer mutationer for at forbedre krystalliseringen som beskrevet tidligere12.

2. storstilet udtryk for hans6 Tagged Nemo-EEAA

  1. Transformér konstruktionen til BL21 (DE3) kompetente celler. Opbevares ved-80 °C som en celle glycerol bestand.
  2. Dag 1 – Forbered en celle starterkultur. I en 125 mL Erlenmeyerkolbe tilsættes 20 mL fantastisk bouillon opløsning og 20 μL af et 100 mg/mL-lager af ampicillin. Tilsæt et par mikroliter celle glycerol lager (fra-80 °C opbevaring af BL21 (DE3) kompetente celler transformeres med vektor).
  3. 10 mL start kulturen rystes natten over ved 37 °C, 220 rpm (ca. 15 timer).
  4. Dag 2 – fra starteren fortyndes til en OD600 = 0,1 i 250 ml fantastisk bouillon. Tilsæt ampicillin til en slutkoncentration på 100 μg/mL. Vokse til en OD600 = 0,8-1,0.
    1. Tilsæt isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til 500 μM, og Udvid i 4 timer ved 37 °C.
    2. Foranstaltning OD600 af induceret kultur efter 4 h. kultur skal nå en OD600 = 6-10.

3. rensning af hans6 Tagged Nemo-EEAA

  1. Spin cellekultur ned ved 3.800 x g i 20 minutter ved 4 °c.
  2. Gem celle pellet og kassér mediet.
    Bemærk: celle pellet kan gemmes og opbevares ved-20 °C på dette tidspunkt, til rensning på et senere tidspunkt.
  3. Cellerne opslæmmes i 40 mL lyse buffer indeholdende 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM MgCl2, 0,5 mm phenylmethylsulfonylfluorid, 2 mm dithiothreitol (DTT) og 3 ΜL Benzonase-nuklease.
    Bemærk: den anvendte nikkel immobiliserede metalionaffinitets kromatografi (IMAC) er kompatibel med 2 mM DTT. Alternativt kan 0,2 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) udnyttes.
  4. Opdel resuspenderede celler i to 20-25 mL aliquoter.
  5. Lysere cellerne ved hjælp af fransk presse (omtrentlig tryk 25.000 PSI), gentage 2-3 gange for hver alikvot (i det kolde rum).
    Bemærk: Alternativt kan cellerne lyseres ved sonikering (ikke testet i denne protokol).
  6. Tilsæt urinstof til celle lysatet til en endelig koncentration på 8 M, gør det muligt at inkubere på en gynge platform i mindst 2 h eller op til natten. Dette og alle følgende rensningstrin, med undtagelse af dialyse, kan udføres ved stuetemperatur.
  7. Dag 3-Overfør lysatet til ultracentrifuge rør og balance vægt, hvilket sikrer lysat fylder rør til mindst 3/4 fuld. Drej lysatet ved 125.000 x g i 45 min ved 25 °c. Supernatanten hældes i et 100 mL bægerglas til lastning på søjlen.
    Bemærk: centrifugering ved 4 °C vil få urinstof til at gå ned.
  8. På et hurtigt væskekromatografi system fjernes ethanol fra iMac 5 ml kolonne med 25 ml ultrarent H2O ved 5 ml/min., efterfulgt af 25 ml elueringsbuffer indeholdende 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, derefter 25 ml bindings buffer indeholdende 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazol, 2 mm DTT, 8 M urinstof, pH 8,0.
  9. Indlæs urinstof inkuberet supernatanten ved 3 mL/min på IMAC-søjlen, og opsamler strømmen. Kolonnen for 10 kolonne volumener vaskes med bindings buffer ved 3 mL/min.
  10. Refold NEMO-EEAA konstruere på kolonne ved at vaske kolonne med refolding buffer til 20 kolonne volumener ved 3 mL/min, indeholdende 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM DTT, pH 8,0.
  11. Udfør gradient eluering af NEMO-EEAA, fra 10 til 500 mM imidazol over en 12-kolonne volumen gradient, indsamle alle eluat i fraktion samling plade (1 mL fraktioner).
  12. Fortsæt eluering ved 500 mM imidazol for to kolonne volumener, fortsætter med at indsamle.
  13. Kør natriumdodecyl sulfat (SDS)-polyacrylamid gel elektroforese (side) af fraktioner for at bestemme NEMO-EEAA tilstedeværelse i elueringsfraktioner.
    Bemærk: vi brugte 10% acrylamid, MES buffer.
  14. Gruppe fraktioner, der indeholder rent målprotein.
  15. Mål proteinkoncentrationen ved Bradford assay17.
    Bemærk: Dette er nødvendigt for at estimere mængden af proteasehæmmere for tagspaltning.

4. hans6 tag kavalergang og rensning

  1. Tilføj TEV i et 1:10 vægt forhold på TEV: NEMO-EEAA protein for at kløve hans6 -tag. TEV proteasehæmmere blev renset i hus.
    Bemærk: Optimer mængden af TEV, tid og temperatur, der kræves for komplet spaltning separat.
    1. Express TEV protease, S219V mutant18 i BL21 (DE3)-RIL celler og rense som beskrevet tidligere19. Forøg kort cellerne som beskrevet i trin 2, lyse af fransk presse og rense ved hjælp af en IMAC-kolonne. protein opbevares i 25 mM natriumfosfat buffer, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glycerol.
  2. Prøven dialyses natten over (ca. 15 timer) i 4 L af 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, for at give mulighed for spaltning og for at fjerne overskydende imidazol fra prøven til den efterfølgende rensning.
  3. Dag 4 – Fjern prøven fra dialyse. Kør en SDS-SIDERS gel af prøven fra TEV-spaltning for at sikre, at spalningen er fuldført.
  4. På et hurtigt væskekromatografi system fjernes ethanol fra en iMac 5 ml kolonne med 25 ml ultrarent H2O ved 5 ml/min., efterfulgt af 25 ml elueringsbuffer indeholdende 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, derefter bindings buffer indeholdende 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0.
  5. Læg kolonnen på 1 mL/min med TEV-kløvet NEMO-EEAA. Cleaved NEMO-EEAA vil eluere i gennemstrømnings-gennemstrømningen: Saml i en 96 brønd fraktion opsamlings plade (1 mL fraktioner). Kolonnen vaskes for fem kolonne volumener af 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol ved 1 mL/min, og fortsætter med at samle i fraktion opsamlings pladen.
  6. Elute TEV og uncleaved hans6-Nemo-EEAA med tre kolonne volumener af 20 mm Tris, 150 mm nacl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, opsamling eluering i en 50 ml kolbe.
  7. Kør SDS-side gel af gennemstrømnings fraktioner for at bestemme tilstedeværelsen af spaltes Nemo-eeaa.
  8. Poolgennemstrømning fraktioner indeholdende spaltes Nemo-eeaa konstruere, og koncentrere ved hjælp af en omrørt-celle koncentrator til 5 ml. Membran molekylvægt cut-off (MWCO) = 3 kDa.
  9. Ved hjælp af en 3 kDa MWCO membran, dialyze koncentreret prøve i 2 L af 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 for 2 h. Skift dialyse bufferen til 2 liter frisk dialyse buffer til dag-til-nat-dialyse (ca. 15 timer) ved 4 °C.
  10. Dag 5 – læg 5 mL af den dialyserede prøve på en størrelses udelukkelses kromatografi (SEC) 16 mm x 60 cm kolonne (34 μm gennemsnitlig partikelstørrelse) ved 1 mL/min i 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Gentag med yderligere kolonner afhængigt af prøvevolumen.
  11. Pulje fraktioner svarende til dimeriske Nemo-eeaa.
    Bemærk: Nemo-eeaa elutter mellem 60-65 ml, svarende til en større molekylvægt protein, på grund af den aflange karakter af den dikemeje oprullet spole.
  12. Koncentratet anvendes med en rørcelle koncentrator og en MWCO = 3 kDa-membran til en endelig koncentration på 113 μM (1,65 mg/mL).
  13. Af proteinet og opbevares ved 4 °C (stabilt i over 1 måned).

5. screening af sparsomme matrix

Bemærk: protokollen udfører krystalliserings forsøg ved hjælp af kommercielt tilgængelige skærme og opsætning af sidde dråbe eksperimenter ved hjælp af en krystalliserings robot. Krystal billeder indsamles automatisk af en Imager.

  1. Brug af kommercielt tilgængelige sparsomme matrix-skærme (Se tabel over materialer), pipette 60 μl sparsomme matrix opløsning i hver af 96 brøndene på en 2 dråbekammer krystalliserings plade til siddende dråbe damp diffusion (reservoir opløsning).
  2. Ved hjælp af en robot dråbe setter, dispensere 100 nL af proteinopløsning på 1,65 mg/mL i en 1:1 ratio med reservoir opløsning i dråbe 1 for en endelig volumen på 200 nL; derefter 66 nL af proteinopløsning med 134 nL af reservoir opløsning til en endelig volumen på 200 nL i dråbe 2 (1:2 ratio).
  3. Forsegl pladen med 3-tommer-dækkende tætnings tape umiddelbart efter dispensering.
    Bemærk: dråberne vil tørre ud, hvis de udsættes for atmosfære i længere tid end 2-3 min.
  4. Opbevar bakkerne i krystalliserings Imager-lageret ved 20 °C, og kontroller de billeder, som indsamles automatisk for Crystal-tilstedeværelse, startende efter to dage.
    Bemærk: screening af krystallisering forløb parallelt med konstruktions optimering. Oprindelige krystaller dannet under følgende betingelser (kommercielle skærme opført i tabellen over materialer): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30% v/v polyethylenglycol (peg) mme 550, 5% poly-γ-glutaminsyre, 200-400 kDa lavmolekyl vægt polymer (pga-LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PIND 3350, 5% PGA-LM. Sparse matrixskærm krystaller vil have dårlig gitter ensartethed; Derfor vil de Se fattige ved hjælp af tvær polariseret billeddannelse. Brug UV-billeddannelse til at sikre, at krystallerne indeholder protein. Følgende Seed Stock generation trin er nødvendig for at opnå den endelige diffraktion kvalitet krystaller.

6. produktion af frøbestand

Bemærk: vi kan reproducerbart få krystaller til frøproduktion i 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PIND 20K. Men, krystaller vil vise høj mosaiby og er uegnede til dataindsamling på dette stadium.

  1. Ved hjælp af et sæt til frøfremstilling, Forbered frøbestanden ved pipettering ud hele dråbe med krystal til stede, og Placer i 50 μL krystalliserings tilstand løsning i det medfølgende hætteglas.
  2. Vortex frøbestanden i 3 min, pulserende 20 s på og 10 s off.
  3. Serielt fortyndet frøbestand i 1:10 trin ned til 1:10000. Alle fortyndinger opbevares ved 4 °C til yderligere brug.

7. fine skærme

  1. Design fine skærme varierende betingelser for Tris, PGA-LM, og PEG. Variere PEG længde for individuelle bakker.
    Bemærk: den fine skærm, der producerede krystal udnyttet til struktur bestemmelse af NEMO-EEAA, beskæftigede følgende betingelser: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM varierede fra 8 til 0% i kolonne 1-12. Rækker A-H screenet forskellige pinde, med koncentrationer varierende i kolonne 1-12 som følger. A: PIND 200 (0-40% v/v); B: PIND 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PIND 1000 (0-30% w/v); E: PIND 3350 (0-30% w/v); F: PIND 6k (0-30% w/v); G: PIND 10k (0-20% w/v); H: PIND 20K (0-20% w/v). Krystal dukkede op i godt H4 (5,45% w/v PIND 20K, 5,8% w/v PGA-LM). I denne protokol, en protein krystallografi Screen Builder væske handler blev brugt til at bygge skærmene.
  2. Frø et protein lager i et 1:25 volumen forhold på 1:1000 frøfortynding.
    Bemærk: koncentrationen af NEMO-EEAA vil falde en anelse, men krystaller vil stadig danne.
  3. Gentag trin 2 med 1:10000 frøfortynding, samme 1:25 volumen forhold.
  4. Ved hjælp af drop setter, dispensere 100 nL af proteinopløsning på 1,65 mg/mL, med 1:1000 fortynding af frøbestanden i en 1:1 ratio med reservoir opløsning i dråbe 1 for en endelig volumen på 200 nL. Gentag for dråbe 2, men med 1:10000 fortynding af frøbestanden til stede.
  5. Forsegl pladen med 3-tommer-dækkende tætnings tape umiddelbart efter dispensering.
    Bemærk: dråberne vil tørre ud, hvis de udsættes for atmosfære i længere tid end 2-3 min.
  6. Opbevar bakkerne i Imager lageret ved 20 °C, og kontroller de billeder, som er indsamlet efter to dage, for at være krystalklar.
  7. Tjek krystallerne med Cross-polarizer Imager for gitter ensartethed, for at vælge for enkelt betingelser for at oprette følgende bakker.

8. generering af krystaller til dataindsamling

  1. Design enkelt tilstand skærme omkring Tris, PGA-LM, og PEG betingelse, som producerede ensartede krystaller som analyseret af tvær polariserede billeder, og de største krystaller muligt.
    Bemærk: krystaller fra disse betingelser er uregelmæssige i form, for det meste rektangulære tynde plader. Det er nøglen til at vælge en tilstand, hvor kanterne af krystal er veldefinerede og har den største tykkelse muligt.
  2. Lav 20 mL krystalliserings tilstand i hånden.
  3. Ved hjælp af en multi-kanal pipettor, dispensere 60 μL per brønd i en 2 drop-kammer, 96 brønd krystalliserings plade til siddende dråbe damp diffusion.
  4. Forbered frøbestanden som beskrevet i trin 6,2.
  5. Der dispenserer proteinet som beskrevet i trin 6,3.
  6. Forsegl pladen med 3-tommer-dækkende tætnings tape umiddelbart efter dispensering.
    Bemærk: dråberne vil tørre ud, hvis de udsættes for atmosfære i længere tid end 2-3 min.
  7. Opbevar bakkerne i Imager ved 20 °C, og kontroller billederne for Crystal Presence hver dag.
  8. Tjek tvær polariserede billeder af krystallerne for gitter ensartethed, for at vælge krystaller til dataindsamling.

9. bestemmelse af Cryo-protectant

  1. For at teste Cryo-protectanterne, Opret stamopløsninger svarende til krystalliserings betingelserne, men indeholder 30%, 20%, 10% og 5% højere koncentration af hver komponent. Tilsætning af Cryo-protectant volumen vil resultere i en endelig koncentration af komponenter, der er den samme som krystalliserings betingelserne.
    Bemærk: til afprøvning af et Cryo-protektant ved en 30% koncentration i volumen for en 0,1 M Tris krystalliserings tilstand, start med en stamopløsning på 0,143 M Tris, før du tilføjer Cryo-protectant.
  2. Fra et kryo-reagenser-kit, Opret 10 μL prøve til Cryo-protectant test ved at blande 30% efter volumen af Cryo tilstand i 70% af krystalliserings tilstand stamopløsning, for en endelig koncentration på 30% Cryo-protectant i oprindelige krystalliserings betingelser. Bland grundigt.
    1. Brug en pipette på 10 μL til at tage 5 μL test Cryo-beskyttet opløsning og kaste pipet spidsen i flydende nitrogen. Hvis der observeres is, kasseres.
    2. Test alle Cryo-protectanter ved 30%. For de vellykkede løsninger gentages processen med 20%, derefter 10% og 5% af Cryo-protectant.
    3. Udnytte den vellykkede Cryo-protectant løsning med den mindste procentdel af Cryo-protectant, tilsæt 0,5 μL opløsning til en test dråbe med krystaller til stede. Overhold under mikroskop, timing hvor længe krystal varer i tilstanden, hvis ikke ubestemt.
      Bemærk: disse krystaller er kun til test og vil blive kasseret. For NEMO-EEAA er 12% 1,2-propanediol den optimale Cryo-protectant-løsning. 12% tegner sig for fortynding den Cryo-protectant opløsning vil opleve, når det tilsættes krystal faldet på ca. 100 nL, for en omtrentlig slutkoncentration på 1,2-propanediol på 10%.

10. krystal looping

  1. Loop krystaller 1-2 dage før afsendelse til Synchrotron.
    Bemærk: krystaller vil være omtrent 60-100 μm i diameter: 0,05 – 0,10 mm sløjfer er ideelle til looping.
  2. Skær båndet fra toppen af brønden.
  3. Tilsæt 0,5 μL krystalliserings opløsning indeholdende 12% 1,2-propanediol Cryo-protectant direkte til brønden.
    Bemærk: den endelige koncentration af 1,2-propanediol er nu på ca. 10%, på grund af fortynding med 100 nL af drop opløsning (omtrentlig dråbe volumen reduktion fra Initial 200 nL, på grund af damp diffusion).
  4. Loop krystal fra brønden.
    Bemærk: krystaller vokser ofte på bunden af brønden, men vil fjerne med en blid skubbe fra Løkken. Når de er blevet opløst, loop.
  5. Opbevar krystal med Cryo-sløjfer i Pucks nedsænket i væske N2.
  6. Opbevar disse Pucks i flydende N2 i Dewar-kolben, indtil de er klar til afsendelse til røntgen diffraktion ved Synchrotron.

11. data indsamling

  1. Indsamle X-ray diffraktion data. I denne protokol skal du bruge AMX strålinger (id: 17-id-1), national Synchrotron Light source II.
    Bemærk: data blev indsamlet på stedet, men kan indsamles eksternt. Indsamle data i regionen af krystal, som viste gitter ensartethed i tvær polariserede billeder. Placer krystallerne i løkken, så dataindsamlingen ikke involverer "fattige" regioner i krystal, mens krystal roterer i goniometer. Data, som gav den bedste opløsning kom fra indsamling på kanten af en udvidelse af en krystal omkring 5 x 5 μm i størrelse. Brug rastering til at identificere de bedste områder på krystal til at indsamle20.

12. behandling af X-ray-data

  1. Behandl datasæt til højeste opløsning (1,8 Å) med XDS IDXREF-program for at bestemme rumgruppe, enheds celle og opløsningsmiddel indhold.
  2. Integrer data ved hjælp af XDS Integrer program.
  3. Behandl skalerede intensiteter fra XDS XSCALE-programmet ved hjælp af STARANISO-server ved hjælp af I/σI-cutoff-middelværdi på 1,2 for diffraktion-grænseflade for dataene.
    Bemærk: data vil ikke blive skåret i ægte ellipsoide. Opbevar alle data over i/σI af 1,2 cutoff. Statistikken over data beregnet for sfærisk fuldstændighed vil være dårlig på grund af den ikke-sfæriske trunkering. Den elliptiske fuldstændighed var 88% med højeste opløsninger på: 1,88 Å, 2,10 Å og 2,55 Å langs henholdsvis a *, b * og c-aksen.

13. struktur løsning

  1. Udnyt X-ray struktur GCN4 (PDB: 4DMD)15 som en søge model for molekyl erstatning ved hjælp af mrage21 i Phenix22. 4dmd-strukturen blev defineret i mrage som et "ensemble", og mrage-opløsningen byggede med succes struktur delen svarende til N-terminalens coiled-spole adapter af Nemo-eeaa, homolog til søge modellen, for begge kæder i dimer.
    Bemærk: Deaktiver anisotropi korrektion i Phaser, eller data vil blive yderligere skaleret tilbage.
  2. Udnyt efterfølgende runder af Autobuild23 i Phenix og manuel bygning (ved hjælp af 2Fo-fc og fo-fc kort, i Coot24) for at opbygge den resterende del af strukturen.
  3. Manuelt bygge rester mangler stadig i modellen baseret på 2Fo-fc og fo-fc kort, ved hjælp af Coot24.
    Bemærk: den sidste etape omfattede bygning af 4 N-terminal rester og 4 C-Terminal rester for hver monomer. Side kædens placering blev også justeret manuelt efter behov.
  4. Beregn en sammensat udelade kort ved hjælp af PHENIX og en 10% udeladelse af strukturen.

14. strukturforbedring

  1. Raffinere strukturerne med PHENIX raffinere. Kør de indledende justeringer mod bulk-solvent og stereokemi vægte, afslappende RMSbond og RMSangle begrænsninger til henholdsvis 0,01 og 1,0. Fortsæt raffinement på individuelle B-faktorer, TLS parametre, og Beboiteter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning, udtryk og oprensning af IKK-bindende domæne NEMO.
Protokollen fulgte i denne undersøgelse for at opnå den endelige sekvens af NEMO-EEAA (figur 1A), som producerede diffraktion kvalitet krystaller, involveret udtryk og karakterisering af alle de mellemliggende konstruktioner, herunder tilsætning af de coiled-Coil adaptere på N-og eller C-TERMINUS, MUTATIONER C76A, C95S og MUTATIONER E56A, E57A. Figur 1B viser en SDS-siders gel af prøver, der er indsamlet under hele rensningsproceduren som beskrevet i skemaet i figur 1C. Proteinet over udtrykkes i E. coli og optræder som et bånd omtrent ved 14 kDa MW vægt markør på SDS-side gel (Lane 3, celler indsamlet ved høst og lyseres i laemmli-prøve buffer suppleret med 8 M urinstof). Proteinet fremstår rent efter den første IMAC-søjle og viser en monomer og et dimer band på niveau med de 14 og 28 kDa MW-markører på SDS-side gel (Lane 9). TEV spaltning er praktisk taget komplet efter protokollen og proteinet elutter med strømmen igennem under den anden IMAC kolonne næsten udelukkende som en dimer, ved den forventede MW (band under 28 kDa). Størrelse udelukkelse kromatografi viser en enkelt spids eluering mellem 60-65 mL og svarer i vores erfaring til dimer (figur 1D). Den dikemeje oprullet spole altid PS tidligere end forventet på SEK på grund af den aflange form af den oprullet spole og dermed store hydrodynamiske radius10. NEMO-EEAA i fraktioner fra SEC peak vises stadig som en monomer og en dimer på SDS-side gel (Lanes 14-15). Det er vigtigt at udnytte en rørcelle koncentrator for at forhindre prøve eventuel sammenlægning og udfældning ved koncentration.

Krystallisering af Nemo-EEAA
Oprindelige krystaller blev opnået fra en kommerciel skærm ved hjælp af PGA (Se tabel over materialer), udnytter 1,65 μg/ml Nemo-EEAA i 2 mm Tris, 100 mm NaCl, 2 mm DTT, pH 8,0. Fine screening producerede krystaller i 0,1 M Tris pH 8,9, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20K (figur 2A), som blev udnyttet til at producere en frøbestand. Endelige krystaller blev opnået med såning i 0,1 M Tris pH 8,0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20K (figur 2B).

Bestemmelse af data indsamling og-struktur
NEMO-EEAA krystaller lider af mosaiby og Anisotropy. Krystaller dannet i P 1 21 1 rumgruppen, med dataopløsning varierende i a *, b * og c * aksen (1,88 Å, 2,10 å og 2,55 Å). Eksempler på diffraktion-profiler findes i figur 3. Data blev erhvervet ved AMX (17-id-1) strålinger af nsls II, med en stråle størrelse på 7 x 5 μm2. Den lille stråle størrelse var afgørende for at fokusere på den ønskede del af Krystallen (figur 2B) og sikre datakvaliteten.

Den vellykkede protokol for struktur bestemmelse kræver Anisotropisk afkortning af data ved hjælp af staraniso27 server (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi), efterfulgt af indfasning ved molekyl udskiftning ved hjælp af mrage21 inden Phenix22 og strukturen af dimeriske GCN4 (PDB: 4dmd)15 som en søge model. I løsningen af denne struktur fase blev oprindeligt forsøgt ved at mærkning den indfødte methionin med SeMet. Det unormale signal var for svagt, sandsynligvis på grund af den opløsningsmiddel udsatte karakter af Met95 i ubundet form af NEMO (SeMet95 blev med held anvendt til indfasning af NEMO/IKKβ struktur9).

Indledende dataanalyse blev forsøgt med sfærisk afkortning af dataene til 2,3 Å. Dette datasæt kunne ikke med held indfases ved molekyl udskiftning, men en løsning blev opnået ved hjælp af MR-ROSETTA25 og strukturen af Nemo (44-111) i komplekset med ikkβ (701-745) som en søge model (FBF: 3BRV)9. Denne oprindelige model kunne ikke raffineres korrekt. Vi udnyttede diffraktion anisotropi server på UCLA26 til at elliptisk afkorte data og til at fjerne anisotropi af Anisotropisk skalering. Det nyligt behandlede datasæt kan indfases ved molekyl udskiftning. For yderligere at forbedre data, vi ansat STARANISO27 server for Anisotropisk afkortning af data og amplituder blev korrigeret med en Anisotropisk korrektion faktor med Bayesian vurdering28. Disse data, hvilket resulterede i en stigning i antallet af unikke refleksioner til 19.560, blev brugt til struktur raffinement. Komposit udelade kort, hvor beregnet med PHENIX, med undtagelse af 10% af atomerne ad gangen, og sammenlignet med den endelige strukturmodel, for at bekræfte, at strukturen ikke var partisk af den atomare model. Krystallografiske-modellen er komplet med undtagelse af de første og sidste rester i kæde A af Nemo-eeaa, hvor der ikke blev observeret nogen elektron tæthed.

Nemo-eeaa er en homo-dimeric, uregelmæssig, parallel oprullet spole på ~ 175 Å i længden. Den regulære coiled-Coil region omfatter den ideelle coiled-Coil adapter sekvens på N-Terminus (rester 20-50) og de første to heptads af NEMO korrekt sekvens (rester 51-65). En almindelig oprullet spole er også til stede ved c-Terminus, startende ved Nemo rest 97 og omfatter c-terminalens ideelle spole-spole adapter (figur 4A). Den centrale del, der omfatter Nemo-rester 66-98, viser større interhelical-afstande (interhelical-afstand går fra en gennemsnitlig værdi på 7,6 Å i den almindelige oprullet-spole struktur til maksimalt 11,5 Å i den uregelmæssige region) og diskontinuerlig Hydrofobisk grænseflade sammenlignet med en ideel oprullet spole. Denne region af NEMO repræsenterer også grænsefladen for bindende IKKβ og gennemgår en konformationel ændring på ligand binding. Den IKKβ-bundne struktur viser en mere åben coiled-spole konstellation for at rumme ligand med større interhelical-afstand på 1,0 til 2,2 Å i denne region (figur 4B)12. I APO-strukturen flyttes rester Leu93, Met94, Lys96, Phe97 og Arg101 mod midten af den oprullede spole for at invadere ligand-bindings lommen (Cα-Cα-afstanden for Phe97 er strammere med 2,9 Å), med den samlede effekt af at lukke den store hydrofobe kløft, der er vært for ligand i den IKKβ-bundne struktur.

Figure 1
Figur 1: rensning af Nemo-EEAA. (A) sekvens tilpasning af Nemo fra homo sapiens, mus musculus og Bos bovis og den konstruerede Nemo-eeaa. Den coiled-Coil adaptere sekvens er understreget, og mutationer er fremhævet i orange. (B) SDS-siders gel af fraktioner indsamlet under ekspression og rensning (som angivet og refereret i flowdiagram 1c). 10% acrylamid, MES buffer. C) et flowdiagram til rensning af Nemo-EEAA. D) størrelses udelukkelses profil, der angiver DIMEREN for Nemo-eeaa (blå). I grøn er molekylvægt markører (kDa) indikeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: morfologi og størrelse af Nemo-EEAA krystaller. (A) en krystal af Nemo-EEAA fra den oprindelige sparsomme matrixskærm, unseeded. Denne type krystal blev brugt til såning til efterfølgende krystalliserings forsøg (0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20K; med en proteinopløsning i 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, pH 8,0). B) krystal, der anvendes til dataindsamling (0,1 M tris pH 8,0, 5,8% pga-LM, 5,45% peg 20K, med en proteinopløsning i 2 mm tris, 100 mm NaCl 2 mm DTT, pH 8,0). Det omtrentlige område, der bruges til dataindsamling, er cirklet med rødt. Skala bjælken for 100 μm længde er defineret i figuren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Crystallografiske data opnået fra Nemo krystaller. (A) X-ray diffraktion profil af tidlige Nemo krystal: aflange striber indikerer mosaiby i krystal. (B) X-ray diffraktion profil af en optimeret Nemo-EEAA krystal. Opløsnings ringen trækkes ved en rumlig opløsning på 2,5 Å. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: strukturen af ubundet Nemo. (A) Nemo-EEAA dimer vises som et bånd, lyseblå = coiled-Coil adaptere, blå = Nemo (51-112). B) superposition af APO Nemo-EEAA-strukturen (blå, FBF: 6mi3) og Nemo (44-111) fra den ikkβ-bundne struktur (grå, FBF: 3BRV, ikkβ vises ikke), vist som bånd; strukturerne er kun justeret på kæde A, region 44-111. Dette tal er blevet ændret fra den foregående publikation12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Krystalliserings forsøg fra NEMO i ubundet form mislykkedes, herunder forsøg med at bruge fuld længde protein og flere trunkering konstruktioner, der omfatter IKK-binding domæne. Vores biofysiske karakterisering af ikk-bindende domæne af Nemo (rester 44-111) af cirkulær dichroism, NMR spektroskopi og fluorescens anisotropi indikerede, at konstruktionen, omend i stand til at binde ikkβ, eksisterede i en tilstand af konformationel udveksling, ikke egnet til krystallisering9,10. Vores tilgang involverede Engineering en konstruktion af IKK-bindende domæne NEMO, der vedtog en mere stabil, foldet og indfødte-lignende kropsbygning, eliminere den fleksibilitet, der forhindrede krystallisering. Ideelle coiled-Coil domæne adaptere smeltet til N-og C-Termini af NEMO (44-111) sekvens giver fordelen ved at stabilisere den dikemeje coiled-Coil fold af den indfødte NEMO og lette krystallisering14. Opførsel af en serie af protein konstruktioner blev overvåget ved hvert trin gennem SDS-side, størrelses udelukkelse kromatografi, cirkulær dichroism, fluorescens anisotropi og NMR spektroskopi, som beskrevet tidligere10,12. På trods af den progressive forbedring i alle ønskede parametre ingen konstruktion gav diffraktion kvalitet krystaller indtil mutationer E56A, E57A blev introduceret. Mutationer var den højeste effekt mutationer foreslået af overfladen Entropy reduktion server SERp29 , der ikke involverer rester impliceret i hot-spots bindende for ikkβ, som i Nemo/ikkβ komplekse struktur. Selv om andre konstruktioner stabiliserer den ordnede struktur af IKK-bindende domæne NEMO gennem cystein disulfid sammenkædning og bindende IKKβ med høj affinitet er blevet beskrevet30, den her beskrevne protokol repræsenterer den første vellykkede tilgang til struktur bestemmelse af ikk-bindende domæne Nemo i ubundet form.

Protein produktion og-rensning fulgte standardprocedurer i vores laboratorium. Ved cellelyse er en betydelig del af proteinet til stede i den uopløselige fraktion, selv når cellerne vokser efter induktion ved 18 °C, og proteinet blev derfor opløst i 8 M urinstof efter cellelyse og før oprensning og refoldet, mens det var bundet til IMAC-søjlen. Omfattende vask af kolonne bundet protein både under Denaturerings betingelser og efter refolkning er afgørende for et rent produkt efter det første rensningstrin. Den rene NEMO-EEAA har en højere tendens til at bundfælde end de tidligere konstruktioner, men er stadig tilstrækkeligt opløselige under krystalliserings betingelser.

Et kritisk skridt i struktur bestemmelsen var brugen af såning. I en tilgang svarende til microseed matrix screening31, blev frø fra krystal opnået under sparsomme matrix screening anvendt i en yderligere screening af betingelser, efterfulgt af en fin screening runde, med henblik på at bestemme de endelige krystalliserings betingelser. De fleste af de krystaller, der dyrkes i de endelige betingelser viser høj mosaiby og er ikke egnet til dataindsamling. Krystaller blev screenet over flere besøg på strålinger og bedste datakvalitet blev opnået ved at indsamle datasæt på kanten af krystal, hvor den nyeste vækst havde fundet sted. Som den region, der viste gitter ensartethed i tvær polariserede billeder var lille, det var medvirkende til at have adgang til AMX strålinger på nsls II, på grund af den lille stråle størrelse.

Vi har med succes fastlagt strukturen af NEMO-EEAA ved molekyl udskiftning ved hjælp af som en søge modelstrukturen af den dikemeje coiled-Coil af GCN415, som kortlagt til de ideelle coiled-Coil adaptere smeltet på N-og C-TERMINI af Nemo sekvens. Den molekylære udskiftning var vellykket, da GCN4 adaptorer opretholder deres oprindelige struktur, når de fvant til NEMO. Samtidig kunne vi kontrollere, at NEMO bevarer sin indfødte som struktur ved at sammenligne de dele, der ikke er involveret i IKK-binding med den tilsvarende struktur region i NEMO/IKKβ komplekse struktur. Alternativt kunne det være muligt at bruge strukturen af NEMO i NEMO/IKKβ-komplekset (FBF: 3BRV)9 som en molekylær udskiftnings model med fokus på monomer B, som svarer til den kæde, der gennemgår den mindste konformationsmæssige ændring på ligand binding. Denne strategi viste nogle indledende succes ved hjælp af MR-ROSETTA modul af PHENIX.

Endelig var det afgørende for en vellykket struktur beslutsomhed at udnytte alle tilgængelige data i datasæt, ved at ty til en Anisotropisk cut-off af fusionerede intensitet data, som leveres af STARANISO27 server eller diffraktion Anisotropy server på UCLA26.

Den afgørende rolle, som NEMO/IKK-komplekset spiller i NF-kB-vejen, gør det til et ønskværdigt mål for graduering af vejen for terapeutisk intervention. Protein-protein interaktioner, især når der involverer en stor binding interface, er udfordrende at hæmme med små peptider eller små molekyler, og struktur-baserede inhibitor design kan tilbyde en betydelig fordel. De konstruktioner af IKK-bindende domæne NEMO, som vi udviklede overvinde grænserne for den fleksible NEMO (44-111) for at lette krystallisering og struktur beslutsomhed. Da konstruktionen nemt krystalliserer i den ubundne form, forestiller vi, at den samme protokol kan anvendes med succes i krystalliseringen af komplekset af NEMO med små molekyle hæmmere, at bestemme en struktur, der ville give detaljer om bindende tilstande og tillade yderligere ligand forbedringer.

En analyse af krystal emballage i krystalliserings forholdene opnået i dette arbejde indikerer, at ligand Co-krystallisering kan foretrækkes at ligand iblødsætning af APO-protein krystaller. Mens krystal pakning giver plads rundt om dimerens kæde B (6 til 10 Å til nærmeste kæde) og på den ene side af ligand-bindingsstedet (ca. 13 Å i hot spot-området mellem Phe82-Phe87), er den symmetriske bindings lomme helt blokeret af nærliggende kæder, hvilket forhindrer ligand binding.

Oprullede spoler er til stede i en signifikant del af proteomet og er afgørende for deres funktion som molekylære Spacers, stilladser og i kommunikation af konformationsmæssige ændringer16. På trods af deres overflod og relevante roller, er der relativt få strukturer af fuld længde coiled-Coil proteiner. Brugen af coiled-Coil adaptere kan støtte i stabilisering af strukturelle områder af coiled-Coil proteiner samtidig bevare deres oprindelige struktur og støtte i den strukturelle bestemmelse og klarlæggelse af deres funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Prof. D. Madden, for mange nyttige diskussioner i hele dette projekt. Vi takker Prof. D. bolt for den gave af plasmid, der indeholder den optimerede GCN4 oprullet Coil. Vi takker Dr. B. Guo for NEMO Plasmids. Vi takker Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili og Amy E. Kennedy for at demonstrere proceduren. Vi takker biomt krystallografi Core Facility og afdelingerne for kemi og biokemi & Cell Biology på Dartmouth for brugen af krystallografi udstyr og biomt personale for deres støtte. Denne forskning anvendes AMX strålinger af national Synchrotron Light source II, en U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science bruger facilitet drives til Doe Office of Science af Brookhaven National Laboratory under kontrakt nr. DE-SC0012704. Vi takker personalet på NSLS II for deres støtte. Dette arbejde blev finansieret af NIH Grants R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 og P20GM113132 og en roman og interaktiv støtte fra Munck-Pfefferkorn.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Tags

Biokemi NF-κb Nemo iκb kinase (ikk) Nemo bindende domæne (NBD) oprullet Coil X-ray crystallography protein engineering struktur bestemmelse struktur-baserede stof design
Produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af IKK-bindings domænet NEMO
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J.,… More

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter