Summary

Producción, cristalización y determinación de la estructura del dominio vinculante iKK de NEMO

Published: December 28, 2019
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Summary

Describimos los protocolos para la determinación de la estructura del dominio de unión IKK de NEMO por cristalografía de rayos X. Los métodos incluyen la expresión de proteínas, purificación y caracterización, así como estrategias para la optimización exitosa del cristal y la determinación de la estructura de la proteína en su forma no unida.

Abstract

NEMO es una proteína de andamiaje que desempeña un papel esencial en la vía NF-B mediante el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. Tras la activación, el complejo IKK fosforila las moléculas de I-B que conducen a la translocación nuclear NF-B y a la activación de genes diana. La inhibición de la interacción NEMO/IKK es un paradigma terapéutico atractivo para la modulación de la actividad de la vía NF-B, haciendo de NEMO un objetivo para el diseño y el descubrimiento de inhibidores. Para facilitar el proceso de descubrimiento y optimización de los inhibidores NEMO, diseñamos una construcción mejorada del dominio de unión IKK de NEMO que permitiría la determinación de la estructura de la proteína en forma de apo y mientras se unía a inhibidores de peso molecular pequeño. Aquí presentamos la estrategia utilizada para el diseño, expresión y caracterización estructural del dominio de enlace IKK de NEMO. La proteína se expresa en células de E. coli, solubilizadas en condiciones de desnaturalización y purificadas a través de tres pasos cromatográficos. Discutimos los protocolos para la obtención de cristales para la determinación de la estructura y describimos las estrategias de adquisición y análisis de datos. Los protocolos encontrarán una amplia aplicabilidad a la determinación de la estructura de los complejos de NEMO y los inhibidores de moléculas pequeñas.

Introduction

La vía NF-B se activa en respuesta a una variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, productos microbianos y estrés, para regular la expresión de genes diana responsables de la respuesta inflamatoria e inmunitaria, la muerte celular o la supervivencia y proliferación1. Patologías incluyendo enfermedades inflamatorias y autoinmunes y cáncer2,3,4,5 se han correlacionado con la hiperactivación de la vía, que ha hecho de la modulación de la actividad NF-B un objetivo principal para el desarrollo de nuevas terapias6,7.

La vía canónica NF-B, en particular, se distingue de la vía no canónica, responsable de la linfoorganogénesis y la activación de las células B, por la dependencia de la primera de la proteína de andamios NEMO (modulador esencial NF-B8) para el montaje del complejo IKK con las quinasas IKK y IKK. El complejo IKK es responsable de la fosforilación de I-B (inhibidor de la B) que se dirige a su degradación, liberando los dimers NF-B para translocar se translocando al núcleo para la transcripción génica1 y por lo tanto es un objetivo atractivo para el desarrollo de inhibidores para modular la actividad NF-B.

Nuestra investigación se centra en la caracterización de la interacción proteína-proteína entre NEMO e IKK, dirigida a NEMO para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas de formación compleja IKK. El dominio de unión mínimo de NEMO, necesario para unir IKK, abarca los residuos 44-111, y su estructura se ha determinado en complejo con un péptido correspondiente a la secuencia 701-7459de IKK. NEMO e IKK forman un paquete de cuatro hélices donde el dimer NEMO acomoda los dos hélices de IKK(701-745) en una ranura abierta alargada con una interfaz de interacción extendida. IKK-(734-742), también conocido como el dominio de unión NEMO (NBD), define el punto caliente más importante para la unión, donde los dos triptófanos esenciales (739,741) entierran profundamente dentro del bolsillo nemo. Los detalles de la estructura compleja pueden ayudar en el diseño basado en la estructura y la optimización de pequeños inhibidores de moléculas dirigidos a NEMO. Al mismo tiempo, es difícil que la unión de una molécula pequeña o péptido recree en NEMO el cambio de conformación completo (es decir, la apertura extensiva del dimer de bobina enrollada NEMO) causada por la unión de la larga IKK(701-745), como se observa en el cristal, y la estructura de NEMO o NEMO unido a un inhibidor de molécula pequeña puede representar un mejor objetivo para el diseño de fármacos basados en la estructura y la optimización de inhibidores.

Nemo de longitud completa y construcciones de truncamiento más pequeñas que abarcan el dominio de unión IKK han demostrado ser intratables para la determinación de la estructura en la forma no enlazada a través de los métodos10de cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear (NMR), lo que nos llevó a diseñar una versión mejorada del dominio de unión IKK de NEMO. De hecho, NEMO (44-111) en forma no enlazada sólo está parcialmente plegado y se somete a un intercambio conformación y, por lo tanto, nos fijamos para estabilizar su estructura dimerica, pliegue de bobina enrollada y estabilidad, preservando al mismo tiempo la afinidad de unión para IKK. Al anexar tres heptads de secuencias de bobinas enrolladas dimíricas ideales11 en el N-y C-termini de la proteína, y una serie de mutaciones de cuatro puntos, generamos NEMO-EEAA, una construcción totalmente dimerica y doblada en una bobina enrollada, que rescató la afinidad de unión IKK al rango nanomolar como se observó para la longitud completa de NEMO12. Como ventaja adicional, esperábamos que los adaptadores de bobina enrollada (basados en la secuencia GCN4) facilitarían la cristalización y eventualmente ayudarían en la determinación de la estructura de rayos X a través del reemplazo molecular. Los adaptadores de bobina enrollada se han utilizado de manera similar para aumentar la estabilidad, mejorar el comportamiento de la solución y facilitar la cristalización de bobinas recortadas y fragmentos de anticuerpos13,14. NEMO-EEAA se expresa y purifica fácilmente a partir de células de Escherichia. coli con una etiqueta de Histidina escleable, es soluble, doblado en una bobina de bobinado tenue estable y se cristaliza fácilmente, con difracción a 1,9o. La presencia de las regiones ordenadas de bobinas enrolladas de GCN4 podría ayudar adicionalmente a la eliminación gradual de los datos de los cristales de NEMO-EEAA mediante reemplazo molecular utilizando la estructura conocida de GCN415.

Dados los resultados obtenidos con apo-NEMO-EEAA, creemos que los protocolos descritos aquí también podrían aplicarse a la cristalización de NEMO-EEAA en presencia de pequeños péptidos (como el péptido NBD) o inhibidores de moléculas pequeñas, con el objetivo de comprender los requisitos para la inhibición de NEMO y la optimización basada en la estructura de los inhibidores iniciales de plomo a alta afinidad. Dada la plasticidad y la naturaleza dinámica de muchos dominios de bobina sin bobina16,el uso de los adaptadores de bobina enrollada podría encontrar una aplicabilidad más general para ayudar a la determinación estructural.

Protocol

1. Diseño de la construcción para cristalografía Clonar la secuencia de NEMO-EEAA como en la publicación anterior12 en un vector para la expresión en E. coli utilizando el promotor T7, incluyendo una etiqueta de hexa-histidina N-terminal y un sitio de escisión de proteasa.NOTA: En este protocolo, utilizamos un vector modificado para incluir una etiqueta N-terminal hexa-histidina y un sitio de escote del Virus etch del Tabaco (TEV)10. Este vector…

Representative Results

Clonación, expresión y purificación del dominio iKK vinculante de NEMO.El protocolo seguido en este estudio para obtener la secuencia final de NEMO-EEAA(Figura 1A),que produjo cristales de calidad de difracción, implicó la expresión y caracterización de todas las construcciones intermedias, incluyendo la adición de los adaptadores de bobina enrollada en N- y C-terminus, las mutaciones C76A, C95S y las mutaciones E56A, E57A. L…

Discussion

Los intentos de cristalización de NEMO en forma no enlazada no tuvieron éxito, incluidos los intentos de usar la proteína de longitud completa y varias construcciones de truncamiento que abarcan el dominio de unión IKK. Nuestra caracterización biofísica del dominio iKK-unión de NEMO (residuos 44-111) por dicroísmo circular, espectroscopia de RMN y anisotropía de fluorescencia indicó que la construcción, aunque capaz de unir IKK, existía en un estado de intercambio conformación, no adecuado para la cristaliza…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Profesor D. Madden, por muchas discusiones útiles a lo largo de este proyecto. Agradecemos al profesor D. Bolon por el regalo del plásmido que contiene la bobina enrollada GCN4 optimizada. Agradecemos al Dr. B. Guo por los plásmidos NEMO. Agradecemos a Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili y Amy E. Kennedy por demostrar el procedimiento. Agradecemos a la Instalación Básica de Cristalografía BioMT y a los departamentos de Química y De Bioquímica y Biología Celular de Dartmouth por el uso del equipo de cristalografía y el personal de BioMT por su apoyo. Esta investigación utilizó la línea de haz AMX de la National Synchrotron Light Source II, una Oficina de Usuarios de Ciencias del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704. Agradecemos al personal de NSLS II por su apoyo. Este trabajo fue financiado por las subvenciones NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 y P20GM113132, y una subvención Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

Materials

20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 – Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

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Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

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