Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO
Summary
Vi beskriver protokoller for strukturen bestemmelse av IKK-bindende domene av NEMO av X-ray crystallography. Metodene omfatter protein uttrykk, rensing og karakterisering, samt strategier for vellykket krystall optimalisering og struktur bestemmelse av proteinet i sin ubundet form.
Abstract
NEMO er et stillas protein som spiller en viktig rolle i NF-KB veien ved å montere IKK-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Ved aktivering IKK komplekse fosforylerer IκB molekyler som fører til NF-KB kjernefysiske translokasjon og aktivering av mål gener. Hemming av NEMO/IKK interaksjon er et attraktivt terapeutisk paradigme for modulering av NF-KB Pathway aktivitet, noe som gjør NEMO et mål for hemmere design og oppdagelse. For å lette prosessen med oppdagelse og optimalisering av NEMO-hemmere, utviklet vi en forbedret konstruksjon av det IKK-bindende domenet til NEMO som ville muliggjøre struktur bestemmelse av proteinet i Apo form og mens bundet til små molekylvekt hemmere. Her presenterer vi strategien benyttet for design, uttrykk og strukturelle karakterisering av IKK-bindende domenet til NEMO. Proteinet uttrykkes i E. coli celler, solubilized under denaturering forhold og renset gjennom tre kromatografiske trinn. Vi diskuterer protokollene for å skaffe krystaller for struktur besluttsomhet og beskriver datainnsamling og analyse strategier. Protokollene vil finne bred anvendelse til strukturen bestemmelse av komplekser av NEMO og små molekyl hemmere.
Introduction
NF-KB-veien aktiveres som svar på en rekke stimuli, inkludert cytokiner, mikrobielle produkter og stress, for å regulere uttrykk for mål gener som er ansvarlige for inflammatorisk og immunrespons, celle død eller overlevelse og spredning1. Patologi inkludert inflammatoriske og autoimmune sykdommer og kreft2,3,4,5 har vært korrelert til hyperactivation av veien, som har gjort modulering av NF-KB aktivitet en førsteklasses mål for utvikling av nye terapier6,7.
Den kanoniske NF-KB veien spesielt skilles fra ikke-kanoniske veien, ansvarlig for lymphorganogenesis og B-celle aktivering, av den tidligere avhengighet av stillas proteinet NEMO (NF-KB essensielle modulator8) for montering av ikk-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Den IKK komplekset er ansvarlig for fosforylering av IκBα (inhibitor av KB) som mål den for degradering, frigjør NF-KB dimers til translocate til kjernen for genet transkripsjon1 og er derfor et attraktivt mål for utvikling av hemmere å modulere NF-KB aktivitet.
Vår forskning fokuserer på karakterisering av protein-protein interaksjon mellom NEMO og IKKβ, målretting NEMO for utvikling av små molekyler hemmere av IKK kompleks formasjon. Den minimale bindende domene av NEMO, som kreves for å binde IKKβ, omfatter rester 44-111, og dens struktur har blitt bestemt i komplekse med et peptid tilsvarende IKKβ sekvens 701-7459. NEMO og IKKβ danner en fire-Helix bunt der NEMO dimer rommer de to helikser av IKKβ (701-745) i en langstrakt åpen Groove med en utvidet interaksjon grensesnitt. IKKβ (734-742), også kjent som NEMO-bindende domene (neste arbeidsdag), definerer det viktigste hot-spot for binding, hvor de to essensielle tryptophans (739 741) begraver dypt inne i NEMO-lommen. Detaljene i den komplekse strukturen kan hjelpe til med struktur BAS ert design og optimalisering av små molekyl hemmere som er rettet mot NEMO. På samme tid, er det vanskelig at bindingen av et lite molekyl eller peptid ville gjenskape i NEMO hele conformational endring (dvs. omfattende åpning av NEMO spiral-coil dimer) forårsaket av binding av den lange IKKβ (701-745), som observert i krystall, og strukturen av ubundet NEMO eller NEMO bundet til en liten molekyl inhibitor kan representere et bedre mål for struktur-basert narkotika design og hemmer optimalisering.
Full lengde NEMO og mindre avkorting konstruksjoner som omfatter IKK-binding domenet har bevist intractable for struktur bestemmelse i ubundet form via røntgen crystallography og kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) metoder10, som fikk oss til å designe en forbedret versjon av ikk-binding domene av Nemo. Faktisk er NEMO (44-111) i ubundet form bare delvis foldet og gjennomgår conformational utveksling og vi derfor satt til å stabilisere sin dimeric struktur, spiral-coil fold og stabilitet, og samtidig bevare bindende affinitet for IKKβ. Ved å føye tre heptads av ideelle dimeric spiral-coil sekvenser11 på N-og C-Termini av proteinet, og en serie på fire punkt mutasjoner, genererte vi Nemo-aeee, en konstruere fullt dimeric og foldet i en spiral spiral, som reddet ikk-binding affinitet til nanomolar området som observert for full lengde Nemo12. Som en ekstra fordel, håpet vi at spiral-coil adaptere (basert på GCN4 sekvensen) ville lette krystallisering og til slutt bistand i X-ray struktur besluttsomhet via molekylær erstatning. Spiral-spole adaptere har blitt brukt på samme måte både for å øke stabiliteten, forbedre løsnings atferden og tilrettelegge for krystallisering for trimeric spiral spoler og antistoff fragmenter13,14. NEMO-AEEE er lett uttrykt og renset fra Escherichia. coli celler med en spaltbare histidin tag, er løselig, foldet i en stabil dimeric spiral coil og er lett krystallisert, med diffraksjon til 1,9 å. Tilstedeværelsen av de bestilte spiral-coil regionene i GCN4 kan i tillegg bistand i å fase dataene fra krystaller av NEMO-AEEE av molekylær erstatning ved hjelp av den kjente strukturen i GCN415.
Gitt resultatene oppnådd med Apo-NEMO-AEEE, tror vi protokollene beskrevet her kan også brukes til krystallisering av NEMO-AEEE i nærvær av små peptider (som neste arbeidsdag peptid) eller små molekyl hemmere, med mål om å forstå kravene til NEMO hemming og struktur-basert optimalisering av innledende føre hemmere til høy affinitet. Gitt plastisitet og dynamiske natur mange spiral-coil domener16, kan bruken av spiral adaptere finne mer generell anvendelse i å hjelpe strukturelle besluttsomhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Krystallisering forsøk på NEMO i den ubundne formen var mislykket, inkludert forsøk med full lengde protein og flere avkorting konstruksjoner som omfattet det IKK-bindende domenet. Våre Biofysiske karakterisering av ikk-binding domenet til Nemo (rester 44-111) av sirkulære dichroism, NMR spektroskopi og fluorescens anisotropien indikerte at konstruksjonen, om enn i stand til å binde IKKβ, eksisterte i en tilstand av conformational Exchange, ikke egnet for krystallisering9,<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Prof. D. Madden, for mange nyttige diskusjoner gjennom dette prosjektet. Vi takker Prof D. Bolon for gaven av plasmider inneholder optimalisert GCN4 spiral coil. Vi takker Dr. B. Guo for NEMO plasmider. Vi takker Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili og Amy E. Kennedy for å demonstrere prosedyren. Vi takker BioMT Crystallography Core Facility og avdelingene for kjemi og biokjemi & Cell Biology på Dartmouth for bruk av Crystallography utstyr og BioMT personell for deres støtte. Denne forskningen anvendt det AMX beamline av det nasjonal Synchrotron lyset kilde II, en U.S. avdeling av energi (DOE) kontor av vitenskap bruker Letter operert for DOE kontor av vitenskap av Brookhaven nasjonal laboratorium under kontrakt nei. DE-SC0012704. Vi takker de ansatte på NSL II for deres støtte. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 og P20GM113132, og en Munck-Pfefferkorn Novel og Interactive stipend.
Materials
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 – Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
References
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
- Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
- Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
- Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
- Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
- Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
- Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
- Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
- Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
- Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), 1611-1622 (2017).
- Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
- Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
- Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
- Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), (2019).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, 2126-2132 (2004).
- Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
- Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Tickle, I. J., et al. . STARANISO. , (2018).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
- Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
- Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
- D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).
