Здесь мы представляем протокол для воспроизводимого поколения свиных яичек органоидов с тестом специфической архитектуры тканей с использованием коммерчески доступной системы культуры микроколодцев.
Органоиды представляют трехмерные структуры, состоящие из нескольких типов клеток, которые способны переопределять архитектуру тканей и функции органов in vivo. Формирование органоидов открыло различные возможности фундаментальных и трансляционных исследований. В последние годы органоиды яичек заинтересовались мужской репродуктивной биологией. Личикулярные органоиды позволяют изучать клеточные взаимодействия, развитие тканей и микросреду нишу зародышевых клеток и облегчают высокую пропускную способность наркотиков и скрининга токсичности. Метод необходим для надежного и воспроизводимого генерации яичек органоидов с testis специфической архитектуры тканей. Система культуры микроколодцев содержит плотный массив микроколодцев в форме пирамиды. Яичек клетки, полученные из допубертатных яичек центрифугируются в эти микроуэллы и культивируется для создания яичек органоидов с яичка конкретных архитектуры тканей и клеточных ассоциаций. Тысячи однородных органоидов могут быть созданы с помощью этого процесса. Протокол, представленный здесь, будет представлять широкий интерес для исследователей, изучающих мужское размножение.
В последние годы наблюдается возрождение интереса к трехмерным (3D) органоидам. Различные органы, такие как кишечник1,желудок2,поджелудочная железа3,4,печень5,и мозг6 были успешно выведены в 3D органоидных систем. Эти органоиды имеют архитектурное и функциональное сходство с органами in vivo и более биологически актуальны для изучения микроокружения тканей, чем монослойные системы культуры7. В результате, органоиды яичек начали набирать интерес, а также8,9,10,11,12. Большинство методов сообщили до сих пор являются сложными, невысокой пропускной записи10 и требуют добавления ECM белков8,10. Эта сложность также приводит к проблемам с воспроизводимостью. Необходим простой и воспроизводимый метод, позволяющий выравлить органоиды яичек с клеточными ассоциациями, которые подобны яичкам in vivo.
Недавно мы сообщили о системе для удовлетворения этихтребований 12. Используя свинью в качестве модели, мы использовали центробежный подход к принудительной агрегации в системе микроколодцов. В системе микроколодцов, каждый из скважин содержит большое количество одинаковых небольших микровелл13. Это позволяет для генерации многочисленных сфероидов равномерного размера. Система микроскважин позволила пообразить большое количество однородных органоидов с архитектурой, специфичной для яичек. Система проста и не требует добавления белков ECM.
Мы создали простой метод, который позволяет последовательное, повторяемое поколение большого количества яичек органоидов с архитектурой тканей, которая похожа на testis in vivo12. Хотя подход был разработан с использованием свиных яичек клеток, это более широко применимо также ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH/NICHD HD091068-01 доктору Ине Добрински.
100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |