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Bioengineering

Sintesi di nanocluster d'oro a emissione di infrarossi nel vicino infrarosso per applicazioni biologiche

doi: 10.3791/60388 Published: March 22, 2020

Summary

Viene descritto un metodo affidabile e facilmente riproducibile per la preparazione di nanocluster in oro fotoluminescenti funzionalmente e quasi infrarossi e il loro rilevamento diretto all'interno delle cellule HeLa mediante citometria di flusso e microscopia a scansione laser confocale.

Abstract

Nell'ultimo decennio, i nanocluster fluorescenti dell'oro (AuNC) hanno visto una crescente popolarità nelle applicazioni biologiche e sono stati dedicati enormi sforzi al loro sviluppo. In questo protocollo, è stato descritto in dettaglio un metodo facile e sviluppato di recente per la preparazione di AuNC solubili in acqua, biocompatibili e colloidalmente stabili nel vicino infrarosso. Questa sintesi chimica dal basso verso l'alto a temperatura ambiente fornisce AuNC facilmente funzionalizzabili, con acido tioctico e glicole di polietilene modificato con tiolo in soluzione acquosa. L'approccio sintetico non richiede né solventi organici né ulteriori scambi di ligandi né un'ampia conoscenza della chimica sintetica da riprodurre. Gli AuNC risultanti offrono acidi carboxillici di superficie gratuiti, che possono essere funzionalizzati con varie molecole biologiche che portano un gruppo di ammine libero senza influire negativamente sulle proprietà fotoluminescenti degli AuNC. È stata inoltre descritta una procedura rapida e affidabile per la quantificazione citometrica del flusso e l'imaging microscopico confocale dell'assorbimento dell'AuNC da parte delle cellule HeLa. A causa del grande spostamento di Stokes, è necessaria una corretta impostazione dei filtri nella citometria di flusso e nella microscopia confocale per rilevare in modo efficiente la fotoluminescenza nel vicino infrarosso degli AuNC.

Introduction

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Nell'ultimo decennio, ultrapiccoli nanocluster di oro fotoluminescenti (PL AuNC) sono emersi come sonde promettenti sia per la ricerca fondamentale che per le applicazioni pratiche1,2,3,4,5,6,7,8,9,10.2 Le loro molteplici caratteristiche sono l'elevata fotostabilità, la massima le emissioni regolabili, le lunghe emissioni di durata, i grandi spostamenti di Stokes, la bassa tossicità, la buona biocompatibilità, la clearance renale e la facile bioconcentrazione. PL AuNC è in grado di fornire la fotoluminescenza dalla regione spettrale blu a quella del vicino infrarosso (NIR), a seconda del numero di atomi all'interno del cluster11 e della natura del ligando superficiale12. Le schede di interfaccia di rete (650-900 nm) che emettono AuNC sono particolarmente promettenti per l'imaging a lungo termine in vitro e in vivo di cellule e tessuti, in quanto offrono un elevato rapporto segnale-rumore a causa della minima sovrapposizione con l'autofluorescenza intrinseca a dispersione, l'indebolimento e l'assorbimento e un'elevata penetrazione dei tessuti della luce NIR13,14.

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati vari approcci che sfruttano le interazioni covalenti Au-S per preparare NIR-PL AuNCC limitato con una varietà di ligandi contenenti thiol13,15,16,17. Per applicazioni biomediche, le AuNC devono essere funzionalizzate con una componente biologica per facilitare le interazioni di legame. Pertanto, gli AuNC ad alta stabilità colloidale che sono facilmente funzionalizzabili in un solvente acquoso sono altamente desiderabili. L'obiettivo generale dell'attuale protocollo è quello di descrivere una precedente preparazione di18 AuNC con un gruppo di acido carboxillico funzionalizzabile sulla superficie utilizzando acido tiottico e glicole di polietilene (PEG) in un ambiente acquoso in dettaglio e la loro coniugazione con molecole che portano un ammine primario seguendo il metodo di accoppiamento acido-amine. A causa della facilità di sintesi e dell'elevata riproducibilità, questo protocollo può essere utilizzato e adattato dai ricercatori provenienti da contesti non chimici.

Uno dei requisiti chiave per l'applicazione delle AuNC nella ricerca biomedica è la capacità di osservare e misurare gli acchi all'interno delle cellule. Tra i metodi disponibili per monitorare l'assorbimento delle nanoparticelle da parte delle cellule, la citometria di flusso (FCM) e la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) offrono metodi robusti e ad alta produttività che consentono misurazioni rapide dell'internalizzazione dei nanomateriali fluorescenti in un gran numero di cellule19. Qui, è stato presentato anche il metodo FCM e CLSM per la misurazione diretta e l'analisi delle PL AuNC all'interno delle cellule, senza la necessità di coloranti aggiuntivi.

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Protocol

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1. Preparazione di AuNC emittente nel vicino infrarosso (1)

  1. Aggiungete 7,8 mg (37,8 m. di acido tioctico) (TA) e 60-L di 2 M NaOH a 23,4 mL di acqua ultrapura (resistività 18,2 M.cm a 25 gradi centigradi) e mescolate (almeno 1.000 giri/m) fino a quando non si scioglie completamente (15-20 min). Per una più rapida dissoluzione di TA, sonicare la miscela. Per la sintesi, si raccomanda una soluzione TA appena preparata.
  2. Aggiungete alla soluzione 10,2 l di HAuCl4x 3H2O (470 mg/mL) di soluzione acquosa.
  3. Dopo 15 min, aggiungere 480 s L di NaBH4 (1,9 mg/mL) sotto agitazione vigorosa (almeno 1.000 giri/m) e mescolare la miscela di reazione nelle stesse condizioni durante la notte.
    NOTA: Preparare la soluzione NaBH4 in acqua ultrapura ghiacciata e aggiungere alla miscela di reazione immediatamente dopo la preparazione.
    NOTA: la sintesi degli AuNC è facilmente scalabile. Fino a 2 L di AuNC è stato sintetizzato in un unico lotto, senza alcuna modifica nelle proprietà ottiche delle particelle.
  4. (Critico) Il giorno successivo, purificare la soluzione applicando tre cicli di centrifugazione/filtrazione utilizzando un dispositivo di filtrazione a membrana con un peso molecolare cut-off di 3 kDa. Senza questa procedura di purificazione, il passaggio seguente non funziona correttamente.
  5. Aggiungere alla soluzione il glicole di polietilene terminato (MW 2.000; 15,6 mg; 7,8 ml), regolare il pH a 7-7,5 e mescolare la miscela durante la notte per ottenere 1. Purificare la dispersione applicando tre cicli di centrifugazione/filtrazione utilizzando un dispositivo di filtrazione a membrana con un taglio di peso molecolare di 3 kDa.
    NOTA: la regolazione del pH a 7-7,5 è estremamente importante. Un pH più alto può provocare uno spostamento blu della massima le emissioni.

2. Coniugazione di 3-(aminopropyl)triphenylphosphonium bromuro (TPP) sulla superficie di 1

  1. Mescolare la soluzione 1 (24 mL) preparata nel passaggio precedente e il bromuro di tribilphosphonium (12 mg, 30 dollari). Regolare il pH a 4,5 con 1 M HCl.
    NOTA: 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) sale bromuro è stato preparato come descritto nella letteratura20.
  2. Iniziare la reazione aggiungendo un eccesso di N-(3-dimetil-aminopropyl)-Ncloridrato di ethylcarbodiimide (EDC HCl) (60 mg, 312 mol). Il pH della soluzione aumenterà e non dovrebbe essere consentito di andare oltre 6. Monitorare il pH della miscela di reazione per la prima ora. Se il pH supera 6, ridurlo a 4,5–6 aggiungendo 1 M HCl.
  3. Mescolare la miscela di reazione durante la notte a temperatura ambiente.
  4. Purificare la dispersione applicando tre cicli di centrifugazione/filtrazione utilizzando un dispositivo di filtrazione a membrana con un taglio di peso molecolare di 3 kDa per ottenere 2. Diluire 2 ottenuto qui con acqua ultrapura al volume iniziale di 24 mL. La concentrazione di Au nella soluzione è di 200 g/mL.

3. Cultura cellulare

  1. Cellule Culture HeLa (collezione di coltura HPA) nel mezzo aquila di Dulbecco, integrato con il 10% di siero bovino fetale in 5% CO2 a 37 gradi centigradi.
  2. Dividere e passare le cellule quando raggiungono la confluenza dell'80%. Per ridurre al minimo l'acquisizione di nuovi mutanti, il numero di propagazioni cellulari non deve superare 30.

4. Internon AuNC nelle cellule HeLa

  1. Semina le cellule in una piastra di 12 pozze a una densità di 20.000 cellule / mL (1 mL/ pozzetto). L'obiettivo è quello di raggiungere il 50% di confluenza dopo 48 h.
  2. A 48 h dopo la seming, aspirare il mezzo di coltura e aggiungere 400 -L di mezzo di coltura completo (per i controlli non trattati) o 500 g di nanoparticelle in 400 -L di mezzo coltivato completo (per i campioni trattati) a ciascuno di essi. Riportare le culture a un incubatore di 37 gradi centigradi.
    NOTA: l'aggiunta di elevati volumi di soluzione AuNC influisce negativamente sulla fattibilità cellulare. Le soluzioni AuNC devono essere concentrate. Così 2 ottenuto al punto 2.4 è concentrato 100 volte. 40 mL AuNC era concentrata a 400 .L. Per ottenere la concentrazione AuNC desiderata, è stato aggiunto un'aliquota di 25 aliquote di questa soluzione concentrata a 400 -L di coltura cellulare.
  3. Dopo 2 h di internalizzazione, staccare le cellule per trypsinizzazione standard secondo il protocollo del produttore.
  4. Raccogliere i campioni in tubi di microcentrifuga di polipropilene e centrifugare per 5 min a 350 x g a 4 gradi centigradi.
  5. Preparare il seguente buffer FCM: salina buffersforata pre-raffreddamento (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7,4) integrato con albumina di siero bovina del 2% a 4 gradi centigradi.
  6. Lavare i pellet con 1 mL di buffer FCM e centrifugare per 5 min a 350 x g a 4 gradi centigradi.
  7. Risospendere il pellet in 500 , l of FCM buffer e conservare i campioni a 4 gradi centigradi prima dell'analisi.

5. Analisi della citometria di flusso

  1. Filtrare tutti i campioni utilizzando un tubo rotondo-inferiore in polistirolo da 5 mL con un tappo a colino cellulare.
  2. Prima di acquisire i dati utilizzando il software dello strumento, specificare la configurazione del citometro.
  3. Formattare tutti i punti grafici e gli istogrammi per 'Acquisizioni'.
  4. Tracciare un grafico a due parametri dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) e dell'area di dispersione laterale (SSC-A) per mostrare la distribuzione delle celle. Per escludere i doppietti, creare un grafico a due parametri dell'altezza FSC (FSC-H) e FSC-A. Per monitorare l'intensità di fluorescenza relativa nel campione, tracciare un istogramma a parametro singolo per l'area del canale fluorescente (FL-A). Utilizzare una scala lineare per rappresentare i dati FSC e SSC e una scala logaritmica per tutti i parametri fluorescenti.
  5. Acquisire il campione non trattato (senza nanoparticelle) a bassa portata per ridurre al minimo gli eventi coincidenti (se consentito dallo strumento). Durante l'acquisizione, regolare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) per ottenere la popolazione non trattata in scala sul grafico FSC vs SSC. Se necessario, regolare le tensioni PMT affinché il canale FL punti la popolazione non macchiata nell'angolo sinistro dell'istogramma.
  6. Selezionare la specifica 'scheda cancello' nel software e disegnare un cancello appropriato intorno alla popolazione desiderata. Le celle all'interno del cancello si sposteranno al checkpoint successivo.
  7. Registra 10.000 eventi per campione.
  8. Registrare tutti i campioni nelle stesse impostazioni dello strumento.
  9. Utilizzare un programma appropriato per analizzare i dati della citometria del flusso.
    NOTA: alcune applicazioni potrebbero richiedere l'impostazione personalizzata dei filtri. Per lo scambio di filtri sempre seguire le raccomandazioni del manichino nella guida utente.
    NOTA: l'esperimento può essere salvato e ricaricato per preservare le impostazioni dello strumento e la strategia di gating.
    NOTA: un grafico di altezza di dispersione laterale (SSC-H) e area di dispersione laterale (SSC-A) può essere utilizzato anche per l'esclusione di doppietto. Questo tipo di gating può essere più sensibile in quanto il rivelatore FSC non è di solito un PMT.

6. Internalizzazione di 2 nelle cellule HeLa per microscopia a scansione laser confocale (CLSM)

  1. Semina le cellule su un piatto di 35 mm a 4 camere a una densità di 250.000 celle/mL (0,5 mL/camera). Conservare la camera in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera di CO2 del 5%. L'obiettivo è quello di raggiungere il 50% di confluenza dopo 24 ore.
  2. A 24 h dopo la semina, aggiungere 100 g di 2 (o 10 l dalla soluzione di riserva di 10 mg/mL) ad ogni camera piatta contenente 0,5 mL di mezzo con le cellule (per i campioni trattati).
  3. Riportare il piatto nell'incubatrice. Lasciate che le cellule internamente gli AMC per 24 h prima di utilizzarli per CLSM.
  4. Dopo il periodo di internalizzazione, scartare il mezzo e lavare le cellule con un mezzo fresco preriscaldato per 5 min. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio. Quindi riempire ogni camera con 800 l. di mezzo fresco.

7. CLSM Imaging di cellule Hela vive etichettate con 2

  1. Per l'imaging microscopico, utilizzare l'olio 63x (n - 1,518) lente obiettivo (NA - 1,4) in un microscopio confocale con Plan-Apochromat.
  2. Montare il piatto sullo stadio invertito al microscopio con la camera riscaldata a 37 gradi centigradi e fornita di atmosfera umidizzata 5% CO2.
  3. Per rilevare AuNC internalizzato, utilizzare un set laser da 405 nm a una potenza del 2% con uno splitter a fascio appropriato. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda di rilevamento tra 650 e 760 nm.
  4. Impostare la risoluzione dell'immagine su 2048 x 2048 pixel. Nell'impostazione della velocità di acquisizione, puntare a un tempo di permanemento dei pixel intorno a4 s. Acquisire l'immagine con una media di 2 volte (modalità linea, media del metodo). Impostare il foro stenopeico su 1 unità Airy (per 405 nm luce). Per una maggiore sensibilità, utilizzare la modalità di conteggio dei fotoni.
  5. Per una corretta illuminazione nella luce trasmessa con contrasto di interferenza differenziale (DIC), utilizzare l'impostazione del condensatore e dell'arresto del campo da parte di K'hler. Per l'acquisizione della luce trasmessa, utilizzare un laser da 488 nm allo 0,7% di potenza senza alcun rilevatore di fluorescenza assegnato. Impostare uno splitter di fascio appropriato per la lunghezza d'onda laser.
  6. Acquisire due immagini per ogni traccia (fluorescenza rossa e DIC). Traccia refluete dalla loro fluorescenza rossa; i confini delle celle sono facilmente determinabili nella luce trasmessa con le immagini DIC.

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Representative Results

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NiR PL AuNCCs sono stati preparati da Au3 in presenza di TA, e poi thiol-terminato PEG (MW 2,000) è stato legato sulla superficie AuNC per ottenere 1 seguendo il flusso di lavoro mostrato Figura 1. L'accoppiamento amidico tra 1 e 3-aminopropile) triphenylphosphonium (TPP) bromuro fornito 2. Come previsto, gli spettri di assorbimento (Figura 2a) indicavano che gli AuNC 1 e 2 non hanno una banda di plasmon di superficie caratteristica e mostrano un'ampia emissione da 550 nm a 850 nm (Figura 2b). Dopo l'attaccamento del TPP alla superficie di 1, il PL è aumentato fortemente. L'emissione dalle AuNC era visibile anche sotto la luce UV (365 nm, incastonato nella figura 2b inset). L'emissione dalle AuNC è stabile e la lunghezza d'onda di emissione è indipendente dalla lunghezza d'onda dell'eccitazione (Figura 2c). Tuttavia, l'intensità delle emissioni è massima quando eccitata con la luce UV.

2 è stato rilevato all'interno delle cellule HeLa monitorando il PL su un citometro di flusso. Le cellule HeLa sono state incubate per 2 ore con 2 a concentrazioni di media tra 0,5 mg/mL e 2 mg/mL. Dati FCM confermati l'assorbimento di 2 da celle HeLa. La fluorescenza NIR (>720 nm) dipendeva sia dal tempo (Figura 3a) che dalla concentrazione di 2 (Figura 3b). L'intensità massima è stata osservata con il filtro passa-banda 780/60.

Gli AuNC all'interno delle cellule sono stati immagini in modo non invasivo utilizzando un microscopio a scansione laser confocale standard. La figura 4 mostra l'immagine confocale delle cellule heLa macchiate di 2 (200 g/mL). Dopo 24 h di incubazione brillante fotoluminescenza rosso di 2 all'interno delle cellule è stato osservato.

Figure 1
Figura 1: Sintesi dei nanocluster d'oro. Flusso di lavoro della preparazione di 1 e 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Proprietà ottiche dei nanocluster d'oro. Spettri di assorbimento normalizzati (a) (inset: Fotografia delle soluzioni acquose di 1 e 2 sotto la luce bianca) e(b)spettri fotoluminescenti di 200 soluzioni acquose di 200 soluzioni acquose di 200 soluzioni acquose di 1 e 2 (inset: fotografia delle soluzioni AuNC sotto luce UV (365 nm)). (c) Mappa PL di eccitazione-emissione di 2. L'eccitazione viene spostata di 10 nm. Il picco di emissione di circa 750 nm è molto stabile (non si sposta con l'eccitazione) e mostra un enorme spostamento di Stokes dall'eccitazione. L'eccitazione più efficiente si verifica intorno a 340 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Rilevamento di nanocluster d'oro all'interno delle cellule HeLa per citometria di flusso. L'internalizzazione di 2 nelle cellule HeLa è stata studiata utilizzando FCM. Gli istogrammi mostrano (a) l'assorbimento dipendente dalla concentrazione delle AuNC da parte delle cellule HeLa.b Nell'esperimento dipendente dal tempo, le cellule HeLa non sono state trattate (controllo; 0 h) o trattate con 1,28 mg/mL 2 e incubate a 37 gradi centigradi per i tempi indicati. Le cellule sono state poi lavate con PBS e analizzate da FCM. Nell'esperimento dipendente dalla concentrazione, le cellule HeLa non sono state trattate (controllo; 0 mg/mL) o trattate con le concentrazioni indicate di 2 e trattate allo stesso modo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging CLSM di cellule HeLa etichettate con i nanocluster d'oro. Le cellule HeLa sono state incubate con 2 (200 g/mL) per 24 h e imaged con CLSM. (a) Rappresenta il canale di fluorescenza rossa (650-760 nm); b) il canale luminoso trasmesso (DIC) e (c) è sovrapposto a (a) e (b). Barra della scala, 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare Figura 1: Test di stabilità di 1. Spettri di fotoluminescenza di 1 M NaCl a 0 h e dopo 72 h. L'intensità è stata normalizzata al massimo. Clicca qui per scaricare questa figura.

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Discussion

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Gli AuNC che emettono NIR sono stati sintetizzati utilizzando un approccio bottom-up in cui la soluzione precursore dell'oro (HAuCl4) è stata trattata con ligandi tioli adatti, seguiti dalla riduzione di Au3. La riduzione degli ioni metallici in soluzione acquosa tende ad aggregarsi e si traduce in nanoparticelle di grandi dimensioni piuttosto che in NC ultrapiccoli21. Per preparare gli AuNC PL ultrapiccoli (2 nm), le condizioni sintetiche sono state regolate per prevenire la formazione di particelle di grandi dimensioni e promuovere la formazione di ammassi ultrapiccoli. La natura dei ligandi utilizzati per capovolgere la superficie AuNC svolge anche un ruolo importante nell'influenzare la struttura, le proprietà elettroniche e ottiche delle particelle12,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Pertanto, la scelta di ligandi adatti in grado di stabilizzare cluster ultrapiccoli è la chiave per ottenere AuNC altamente fluorescenti. I ligandi contenenti Thiol sono gli stabilizzatori più comunemente utilizzati in sintesi delle AuNC, a causa del forte legame covalente tra tioli e oro. Una precedente relazione31 indica che i ligandi multithiol-based sono di gran lunga superiori ai ligandi monothiol nella stabilizzazione delle PL AuNC. I ligandi multi-thiol forniscono una maggiore stabilità colloidale agli AuNC a causa del maggior numero di siti di legame tra il ligando e la superficie AuNC. Bidentate thiol TA è stato utilizzato per la sintesi di NIR PL AuNCCs perché fornisce una stabilità colloidale molto migliorata alle AuNC su una vasta gamma di condizioni avverse rispetto ai ligandi monothiol32. TA fornisce anche la crescita di fase acquosa di nanoparticelle con controllo delle dimensioni discrete, e, soprattutto, offre un gruppo di acido carboxylico sulla superficie delle nanoparticelle che possono essere utilizzati per la coniugazione di molecole biologicamente rilevanti33,34.

TA stabilizza gli AMC per repulsione elettrostatica causata da gruppi di carboxylati deprotonizzati sulla superficie35. Tuttavia, nelle soluzioni acide, le AuNC protette da TA diventano colloidalmente instabili a causa della protonazione del gruppo carboxylate. Le nanoparticelle possono essere stabilizzate elettrostericamente, piuttosto che puramente elettrostaticamente. Questo approccio prevede la stabilizzazione colloidale anche in presenza di alte concentrazioni di sale e cambiamenti di pH, che è importante per le applicazioni biomediche. Per conferire la stabilizzazione elettrosterica ai TA-AuNC, i cluster sono stati successivamente funzionalizzati con PEG con terminazione tiol (MW 2.000) a un rapporto di 5:1 molare di TA:PEG, producendo 1 (Figura 1). Per il corretto fissaggio del PEG con terminazione, i TA-AuNC devono essere purificati. La funzionalizzazione di AuNC con PEG ha migliorato la solubilità acquosa al pH acido e un aumento della stabilità colloidale nei supporti ad alta resistenza ionica. È importante che l'attaccamento del PEG terminato di thiol venga eseguito al pH 7.0-7.5. Un pH più elevato comporterebbe uno spostamento blu della massima delle emissioni. I ligandi non legati sono stati rimossi dalla centrifugazione/filtrazione utilizzando un dispositivo di filtrazione a membrana con un taglio di peso molecolare di 3 kDa. I ligandi associati alle nanoparticelle sperimentano un significativo ampliamento della linea in 1H NMR rispetto ai ligandi liberi, che possono oscurare le assegnazioni di picco el'integrazione 36. Il picco NMR significativamente ampio 1H associato all'acido tioctico e al glicole di polietilene modificato di tiolo suggerisce che i ligandi sono legati alla superficie AuNC e alla rimozione dei leganti liberi18. La riuscita integrazione delle AuNC luminescenti in un ambiente biologico richiede stabilità rispetto a condizioni, come l'elevata forza ionica perché i media biologici sono ricchi di eccessi rispetto agli ioni. La stabilità di 1 è stata verificata monitorando la fotoluminescenza in 1 M NaCl per un periodo di 72 h. Nessun cambiamento significativo nelle proprietà della fotoluminescenza in 1 M NaCl indica un'elevata stabilità degli AuNC (Figura supplementare 1). Gli AuNC sono rimasti stabili in soluzione tampone per più di un anno senza alcuna prova di precipitazione (dati non mostrati).

1 offre acido carboxylico sulla superficie. I reagenti di accoppiamento basati su carbodiimide sono ampiamente utilizzati per collegare covalentmente gli acidi carboxililici agli ammine tramite la formazione di un legame amido37. Il reagente di accoppiamento basato sul carbodiimide più comunemente usato nella soluzione acquosa è 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) idrocloruro di carbodiimide (EDC-HCl). EDC- HCl è stato utilizzato per l'accoppiamento covalente del bromuro TPP con 1 per ottenere 2. Uno dei principali vantaggi di questo protocollo è la coniugazione di molecole con un gruppo di ammine primarie tramite la formazione di legami amide senza compromettere la fluorescenza e la stabilità colloidale. La microscopia elettronica a trasmissione ad alta risoluzione (HRTEM) ha mostrato che le AuNC 1 e 2 hanno entrambi un diametro medio di 1,15 x 0,2 nm, il che indica che l'accoppiamento funzionale non altera la dimensione del nucleo degli AuNC18. In alternativa, i gruppi carboxyl gratuiti possono essere attivati utilizzando EDC e Sulfo-NHS38. Soluzioni di 1 e 2 eccitato con una lampada UV (365 nm) fluoresce rosso brillante (Figura 1b, inset), mentre appaiono giallo chiaro sotto illuminazione ambientale (Figura 1a, inset). La coniugazione TPP aumenta l'AuNC PL a causa del trasferimento di carica metallo-ligando (MLCT)18.

Le nanoparticelle possono causare effetti biologici avversi che possono limitare le loro applicazioni in biologia. Per valutare la citotossicità di 2 sulle cellule di HeLa, è stato eseguito il saggio di vitalità della vitalità della cellularità XTT (sodio 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium- sale interno). Le cellule di HeLa trattate con 2 (200 g/mL) per 48 h non hanno mostrato alcuna perdita di vitalità cellulare rispetto alle cellule di controllo. Questa osservazione suggerisce che le AuNC sono biocompatibili, il che li rende candidati promettenti come sonde fluorescenti per l'applicazione nella ricerca biologica.

Quando è eccitato con un laser da 405 nm, 2 fornisce un'ampia emissione con un massimo di circa 750 nm. Lo spostamento estremamente grande di Stokes (350 nm) permette di distinguere la luce emessa in modo affidabile dall'emozionante fonte di luce; tuttavia, l'impostazione del filtro FCM deve essere configurata in modo appropriato. Per 2, il filtro passabanda 780/60 nm è ideale per l'ampiezza del filtro e il fatto che il numero massimo di emissioni di AuNC è nella stessa regione. È molto importante utilizzare ampi filtri a banda nella regione di massima delle emissioni per un rilevamento efficiente di PL39,40,41,42. Il segnale di fluorescenza dipendente dal tempo e dalla dose proveniente dalle cellule trattate con 2 suggerisce che FCM può essere utilizzato per monitorare comodamente gli studi sulle cellule utilizzando AuNC. Quando il tempo di incubazione è stato aumentato a 24 h, una concentrazione di 40 g/mL pari a 2 è stata sufficiente per rilevare gli AuNC mediante fluorescenza in FCM (dati non mostrati). Tuttavia, per brevi tempi di incubazione (1-2 h), sono necessarie concentrazioni più elevate di AuNC. Questo metodo di rilevamento delle AuNC mediante segnale di fluorescenza NIR con un citometro di flusso standard contribuirà ad ampliare ulteriormente le potenziali applicazioni delle AuNC nella scienza biomedica. L'approccio qui descritto potrebbe essere utilizzato per valutare i tassi e i meccanismi di assorbimento cellulare14,le relazioni tra la concentrazione di nanoparticelle e la tossicità cellulare, o gli effetti della chimica di superficie sull'assorbimento dei nanocluster in modo rapido e quantitativo utilizzando FCM.

L'assorbimento cellulare di 2 da parte delle cellule HeLa è stato ripreso da CLSM. Dopo 24 h di incubazione emissione di rosso brillante di 2 è stato rilevato all'eccitazione con laser 405 nm. Tuttavia, un laser da 405 nm eccita anche i fluorofori intrinseci all'interno delle cellule. Per distinguere il segnale di AuNC dall'autofluorescenza, l'emissione da AuNC è stata raccolta sopra 650 nm. Le proprietà interessanti, come la luminescenza luminosa nel vicino infrarosso, l'elevata stabilità colloidale, la buona biocompatibilità e i risultati superiori dimostrano che gli AuNC sono promettenti agenti di imaging per applicazioni di imaging biomedico e cellulare.

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Disclosures

Alcune parti dei metodi e dei risultati sono stati precedentemente presentati nell'articolo di Pramanik et al.18 Qui, questi metodi sono stati convertiti in pratici protocolli punto per punto. Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori sono grati ad Alzbeta Magdolenova per il suo aiuto con la citometria di flusso. Gli autori riconoscono il sostegno finanziario del progetto GACR Nr. 18-12533S. La microscopia è stata effettuata nel Laboratorio di microscopia confocale e fluorescenza cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale e dal bilancio statale della Repubblica ceca, i progetti no. C'.1.05/4.1.00/16.0347 e C'.2.16/3.1.00/21515 e supportati dal progetto RI di grandi dimensioni Ceco-BioImaging LM2015062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride TCI Chemicals D1601 https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4161 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate PENTA s.r.o. 15130-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98% Alfa Aesar L04711 https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35% PENTA s.r.o. 19350-11000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min Alfa Aesar 36400 https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 Sigma-Aldrich 743127 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride PENTA s.r.o. 16200-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882 https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride PENTA s.r.o. 16610-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate PENTA s.r.o. 12330-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets PENTA s.r.o. 15740-31000 https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) Thermo Fisher Scientific X12223 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223

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Sintesi di nanocluster d'oro a emissione di infrarossi nel vicino infrarosso per applicazioni biologiche
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Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).More

Pramanik, G., Keprova, A., Valenta, J., Bocan, V., Kvaková, K., Libusova, L., Cigler, P. Synthesis of Near-Infrared Emitting Gold Nanoclusters for Biological Applications. J. Vis. Exp. (157), e60388, doi:10.3791/60388 (2020).

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