Summary
Een betrouwbare en gemakkelijk reproduceerbare methode voor de voorbereiding van functionalizable, nabij-infrarood uitzendende fotoluminescente goudnanoclusters en hun directe detectie in HeLa-cellen door stromingscytometrie en confocale laserscanningmicroscopie wordt beschreven.
Abstract
In de afgelopen tien jaar, fluorescerende goud nanoclusters (AuNCs) zijn getuige van een groeiende populariteit in biologische toepassingen en enorme inspanningen zijn gewijd aan hun ontwikkeling. In dit protocol is een onlangs ontwikkelde, facile methode voor de bereiding van in water oplosbaar, biocompatibel en colloïdaally stabiel nabij-infrarood uitzendende AuNC's in detail beschreven. Deze kamertemperatuur, bottom-up chemische synthese biedt gemakkelijk functionalizable AuNOCs bedekt met thioctisch zuur en thiol-gemodificeerde polyethyleenglycol in waterige oplossing. De synthetische aanpak vereist noch organische oplosmiddelen of extra ligand uitwisseling, noch uitgebreide kennis van synthetische chemie te reproduceren. De resulterende AuNOCs bieden vrije oppervlakte carboxylic zuren, die kunnen worden gefunctionaliseerd met verschillende biologische moleculen met een vrije amine groep zonder nadelige gevolgen voor de fotoluminescente eigenschappen van de AuNOCs. Een snelle, betrouwbare procedure voor flow cytometrische kwantificering en confocale microscopische beeldvorming van AuNC opname door HeLa cellen ook beschreven. Door de grote Stokes-verschuiving is een goede instelling van filters in stromingscytometrie en confocale microscopie noodzakelijk voor een efficiënte detectie van nabij-infrarood fotoluminescentie van AuNC's.
Introduction
In de afgelopen tien jaar zijn ultrakleine (≤ 2 nm) fotoluminescente goudnanoclusters (PL AuNC's) naar voren gekomen als veelbelovende sondes voor zowel fundamenteel onderzoek als praktische toepassingen1,2,33,4,5,,67,8,8,9,10. Hun vele wenselijke kenmerken zijn hoge fotostabiliteit, tunable emissie maxima, lange emissie levensduur, grote Stokes verschuivingen, lage toxiciteit, goede biocompatibiliteit, nierklaring en facile bioconjugatie. PL AuNC's kunnen fotoluminescentie van het blauwe naar het spectrale gebied (NEAR-infrared (NIR) leveren, afhankelijk van het aantal atomen binnen cluster11 en de aard van het oppervlak ligand12. NIR (650-900 nm) die AuNC's uitzenden zijn bijzonder veelbelovend voor langdurige in vitro en in vivo beeldvorming van cellen en weefsels, omdat ze een hoge signaal-ruisverhouding bieden als gevolg van minimale overlap met intrinsieke autofluorescentie, zwakkere verstrooiing en absorptie, en hoge weefselpenetratie van NIR-licht13,14.
In de afgelopen jaren zijn verschillende benaderingen ontwikkeld die gebruik maken van covalente interacties van Au-S om NIR-PL AuNC's voor te bereiden, afgetopt met een verscheidenheid aan thiolbevattende liganden13,15,16,17. Voor biomedische toepassingen moeten AuNC's worden gefunctionaliseerd met een biologische component om bindende interacties te vergemakkelijken. AuNC's met een hoge colloïdale stabiliteit die gemakkelijk te functionaliseren zijn in waterig oplosmiddel, zijn dus zeer wenselijk. Het algemene doel van het huidige protocol is om een eerder gerapporteerde18 preparaat van AuNOCs met een functionalizable carboxylic zuurgroep op het oppervlak te beschrijven door thioctisch zuur en polyethyleenglycol (PEG) in een waterige omgeving in detail te gebruiken en hun vervoegingsmoleculen met een primaire amine volgens de zuur-aminekoppelingsmethode. Vanwege het gemak van synthese en hoge reproduceerbaarheid, kan dit protocol worden gebruikt en aangepast door onderzoekers met een niet-chemische achtergrond.
Een van de belangrijkste vereisten voor toepassingen van AuNC's in biomedisch onderzoek is de mogelijkheid om AuNC's in cellen te observeren en te meten. Onder de beschikbare methoden om de opname van nanodeeltjes door cellen te monitoren, bieden flow cytometrie (FCM) en confocale laserscanmicroscopie (CLSM) robuuste, hoge doorvoermethoden die snelle metingen van internalisatie van fluorescerende nanomaterialen in een groot aantal cellen mogelijk maken19. Hier zijn ook FCM- en CLSM-methode voor directe meting en analyse van PL AuNC's in cellen gepresenteerd, zonder dat extra kleurstoffen nodig zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van nabij-infrarode emitterende AuNOCs (1)
- Voeg 7,8 mg (37,8 μmol) thioctisch zuur (TA) en 60 μL van 2 M NaOH toe tot 23,4 mL ultrazuiver water (weerstand 18,2 MΩ.cm bij 25 °C) en roer (ten minste 1.000 tpm) tot het volledig oplost (~15-20 min). Voor een snellere ontbinding van TA, sonicate het mengsel. Voor de synthese wordt een vers bereide TA-oplossing aanbevolen.
- Voeg 10,2 μL HAuCl4·3H2O (470 mg/mL) waterige oplossing toe aan de oplossing.
- Voeg na 15 min 480 μL NaBH4 (1,9 mg/mL) toe onder krachtig roeren (ten minste 1.000 tpm) en roer het reactiemengsel 's nachts onder dezelfde omstandigheden.
LET OP: Bereid de NaBH4-oplossing vers in ijskoud ultrazuiver water en voeg direct na de bereiding toe aan het reactiemengsel.
OPMERKING: De synthese van AuNC's is eenvoudig schaalbaar. Tot 2 L AuNC's werd gesynthetiseerd in een enkele batch, zonder enige verandering in de optische eigenschappen van de deeltjes. - (Kritiek) De volgende dag, zuiveren van de oplossing door het toepassen van drie cycli van centrifugering / filtratie met behulp van een membraan filtratie-apparaat met een moleculair gewicht cut-off van 3 kDa. Zonder deze zuiveringsprocedure werkt de volgende stap niet goed.
- Voeg thiol-klaargenomen polyethyleenglycol (MW 2.000; 15,6 mg; 7,8 μmol) toe aan de oplossing, pas de pH aan op 7-7,5 en roer het mengsel 's nachts om 1te verkrijgen . Zuiver de dispersie door het toepassen van drie cycli van centrifugering / filtratie met behulp van een membraan filtratie-apparaat met een moleculair gewicht cut-off van 3 kDa.
LET OP: Aanpassing van de pH naar 7-7,5 is uiterst belangrijk. Hogere pH kan resulteren in een blauwe verschuiving van emissiemaxima.
2. Vervoeging van 3-(aminopropyl)triphenylfosphoniumbromide (TPP) op het oppervlak van 1
- Meng de 1 oplossing (24 mL) bereid in de vorige stap en 3-(aminopropyl)triphenylfosphonium bromide (12 mg, ~30 μmol). Stel de pH aan op 4,5 met 1 M HCl.
OPMERKING: 3-(Aminopropyl)triphenylfosfonium (TPP) bromidezout werd bereid zoals beschreven in de literatuur20. - Start de reactie door een overmaat aan N-(3-dimethyl-aminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC· HCl) (60 mg, 312 μmol). De pH van de oplossing zal toenemen en mag niet verder gaan dan 6. Houd de pH van het reactiemengsel het eerste uur in de gaten. Als de pH boven de 6 uitstijgt, verlaag deze dan tot 4,5-6 door 1 M HCl toe te voegen.
- Roer het reactiemengsel 's nachts bij kamertemperatuur.
- Zuiver de dispersie door het toepassen van drie cycli van centrifugering / filtratie met behulp van een membraan filtratie-apparaat met een moleculair gewicht cut-off van 3 kDa te verkrijgen 2. Verdun 2 hier met ultrazuiver water tot het oorspronkelijke volume van 24 mL. De concentratie Van Au in de oplossing is 200 μg/mL.
3. Celcultuur
- Culture HeLa cells (HPA culture collection) in Dulbecco's modified Eagle's Medium aangevuld met 10% foetaal runderserum in 5% CO2 bij 37 °C.
- Split en passage van de cellen wanneer ze bereiken ~ 80% samenvloeiing. Om de verwerving van nieuwe mutanten tot een minimum te beperken, mag het aantal celvermeerderingen niet meer dan 30 bedragen.
4. AuNC internalisatie in HeLa-cellen
- Zaad de cellen in een 12-well plaat met een dichtheid van 20.000 cellen/mL (1 mL/well). Het doel is om ~50% samenvloeiing te bereiken na 48 uur.
- Bij 48 uur na het zaaien, het kweekmedium aanzuigen en 400 μL van volledig kweekmedium (voor onbehandelde controles) of 500 μg nanodeeltjes toevoegen in 400 μL van volledig gekweekt medium (voor behandelde monsters) aan elke put. Breng de culturen terug naar een couveuse van 37 °C.
OPMERKING: Toevoeging van grote hoeveelheden AuNC-oplossing heeft een negatieve invloed op de levensvatbaarheid van de cel. AuNC-oplossingen moeten worden geconcentreerd. Aldus 2 die in stap 2.4 wordt verkregen wordt geconcentreerd 100 keer. 40 mL AuNC was geconcentreerd tot 400 μL. Een 25 μL aliquot van deze geconcentreerde oplossing werd toegevoegd aan 400 μL celkweekmedia om de gewenste AuNC-concentratie te verkrijgen. - Na 2 uur internalisatie u de cellen loskoppelen door standaard trypsinisatie volgens het protocol van de fabrikant.
- Verzamel de monsters in polypropyleen microcentrifugebuizen en centrifugeer gedurende 5 min bij 350 x g bij 4 °C.
- Bereid de volgende FCM-buffer voor: voorgekoeld fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7,4) aangevuld met 2% runderserumalbumine bij 4 °C.
- Was de pellets met 1 mL FCM buffer en centrifugeer gedurende 5 min bij 350 x g bij 4 °C.
- De pellet opnieuw opschorten in 500 μL FCM-buffer en monsters opslaan bij 4 °C voordat deze wordt geanalyseerd.
5. Analyse van de stroomcytometrie
- Filter alle monsters met behulp van een 5 mL polystyreen round-bottom buis met een celzeefdop.
- Geef de cytometerconfiguratie op voordat u gegevens verkrijgt met behulp van de instrumentsoftware.
- Format alle dot-plots en histogrammen voor 'Acquisitions'.
- Plot een puntplot met twee parameters van het voorwaartse strooigebied (FSC-A) en het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) om de verdeling van cellen weer te geven. Maak een puntplot met twee parameters van FSC-hoogte (FSC-H) vs. FSC-A om doubletten uit te sluiten. Als u de relatieve fluorescentieintensiteit in het monster wilt controleren, zet u een histogram met één parameter voor het fluorescerende kanaalgebied (FL-A). Gebruik een lineaire schaal om FSC- en SSC-gegevens weer te geven en een logaritmische schaal voor alle fluorescerende parameters.
- Verwerf onbehandeld monster (zonder nanodeeltjes) met een lage stroomsnelheid om toevallige gebeurtenissen te minimaliseren (indien toegestaan door het instrument). Pas tijdens de overname de fotomultiplierbuis (PMT)-spanningen aan om de onbehandelde populatie op schaal op het FSC vs SSC-perceel te krijgen. Pas indien nodig PMT-spanningen aan voor het FL-kanaal om de onbevlekte populatie op de linkerhoek van het histogram te plaatsen.
- Selecteer het specifieke 'gate tab' in de software en teken een geschikte poort rond de gewenste populatie. Cellen in de poort gaan naar het volgende controlepunt.
- Record 10.000 gebeurtenissen per steekproef.
- Neem alle monsters op onder dezelfde instrumentinstellingen.
- Gebruik een geschikt programma om de gegevens van de stroomcytometrie te analyseren.
OPMERKING: Voor sommige toepassingen is mogelijk een aangepaste installatie van filters vereist. Voor filteruitwisseling volgt u altijd de aanbevelingen van de fabrikant in de gebruikershandleiding.
OPMERKING: Het experiment kan worden opgeslagen en opnieuw geladen om de instrumentinstellingen en gatingstrategie te behouden.
OPMERKING: Een zijverstrooiingshoogte (SSC-H) versus zijverstrooiingsgebied (SSC-A) kan ook worden gebruikt voor uitsluiting van doublet. Dit type gating kan gevoeliger zijn omdat de FSC-detector meestal geen PMT is.
6. Internalisatie van 2 in HeLa-cellen voor confocale laserscanningmicroscopie (CLSM)
- Zaad de cellen op een 4-kamer glazen bodem 35 mm schotel met een dichtheid van 250.000 cellen/mL (0,5 mL/kamer). Bewaar de kamer in een couveuse van 37 °C met een CO2-atmosfeer van 5%. Het doel is om ~50% samenvloeiing te bereiken na 24 uur.
- Voeg om 24 uur na het zaaien 100 μg van 2 (of 10 μL uit de voorraadoplossing van 10 mg/mL) toe aan elke schotelkamer met 0,5 mL medium met de cellen (voor behandelde monsters).
- Breng het gerecht terug naar de couveuse. Laat de cellen de AuNC's gedurende 24 uur internaliseren voordat ze worden gebruikt voor CLSM.
- Na de internalisatieperiode, gooi het medium weg en was de cellen met voorverwarmd vers medium gedurende 5 min. Herhaal de wasstap nogmaals. Vul vervolgens elke kamer met 800 μL vers medium.
7. CLSM Imaging van levende Hela cellen gelabeld met 2
- Gebruik voor microscopische beeldvorming 63x olie (n = 1.518) objectieve lens (NA = 1,4) in een confocale microscoop met Plan-Apochromat.
- Monteer de schotel op de omgekeerde microscoop met de kamer opgewarmd tot 37 °C en voorzien van bevochtigde 5% CO2 atmosfeer.
- Om geïnternaliseerde AuNC te detecteren, gebruikt u een 405 nm laserset op 2% vermogen met een geschikte bundelsplitter. Stel het bereik van detectiegolflengten in tussen 650 en 760 nm.
- Stel de resolutie van de afbeelding in op 2048 x 2048 pixels. In de instelling van de acquisitiesnelheid, streven naar een pixel-stilstaande tijd rond 4 μs. Verkrijg het beeld met 2x gemiddeld (lijnmodus, gemiddelde methode gemiddelde). Stel de pinhole in op 1 Airy unit (voor 405 nm licht). Voor een hogere gevoeligheid gebruikt u de fotontellingsmodus.
- Voor de juiste verlichting in het uitgezonden licht met differentiële interferentiecontrast (DIC) gebruikt u de instelling van de condensor en de veldstop van Köhler. Gebruik voor de aanschaf van doorgegeven licht een 488 nm-laser met 0,7% vermogen zonder dat er een fluorescentiedetector is toegewezen. Stel een geschikte bundelsplitter in voor de lasergolflengte.
- Verkrijg twee afbeeldingen voor elk spoor (rode fluorescentie en DIC). Volgen AuNC's door hun rode fluorescentie; celgrenzen worden eenvoudig bepaald in het uitgezonden licht met DIC-afbeeldingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NIR PL AuNCs werden bereid van Au3+ in aanwezigheid van TA, en vervolgens thiol-beëindigd PEG (MW 2.000) was gebonden op het AuNC-oppervlak om 1 te verkrijgen volgens de workflow in figuur 1. Amidic koppeling tussen 1 en 3-(aminopropyl) triphenylfosphonium (TPP) bromide verstrekt 2. Zoals verwacht gaven absorptiespectra (figuur 2a)aan dat AuNOCs 1 en 2 geen karakteristieke oppervlakteplasmonband hebben en een brede emissie vertonen van 550 nm tot 850 nm (Figuur 2b). Na gehechtheid van TPP aan de oppervlakte van 1,steeg PL sterk. De emissie van AuNC's was ook zichtbaar onder UV-licht (365 nm, figuur 2b-begin). Figure 2b De emissie van AuNOCs is stabiel en de emissiegolflengte is onafhankelijk van excitatiegolflengte (Figuur 2c). De emissie-intensiteit is echter maximaal wanneer deze wordt opgewekt met UV-licht.
2 werd gedetecteerd in HeLa cellen door het toezicht op de PL op een stroom cytometer. HeLa-cellen werden gedurende 2 uur geïncubeerd met 2 bij mediaconcentraties tussen 0,5 mg/mL en 2 mg/mL. FCM gegevens bevestigd opname van 2 door HeLa cellen. NIR fluorescentie (>720 nm) was afhankelijk van beide tijd (figuur 3a) en concentratie van 2 (Figuur 3b). Maximale intensiteit werd waargenomen met de 780/60 bandpass filter.
AuNC's in cellen werden niet-invasief afgebeeld met behulp van een standaard confocale laserscanningmicroscoop. Figuur 4 toont het confocale beeld van HeLa-cellen met 2 (200 μg/mL). Na 24 uur incubatie werd helderrood fotoluminescentie van 2 in de cellen waargenomen.
Figuur 1: Synthese van de gouden nanoclusters. Workflow van de voorbereiding van 1 en 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Optische eigenschappen van de gouden nanoclusters. Genormaliseerde (a) absorptiespectra (Inset: Foto van de waterige oplossingen van 1 en 2 onder wit licht) enb)fotoluminescente spectra van 200 μg/mL waterige oplossingen van 1 en 2 (Inset: foto van de AuNC-oplossingen onder UV-licht (365 nm)). c) PL-kaart met excitatie-emissie van 2. Excitatie wordt verschoven door 10 nm stappen. De emissiepiek rond 750 nm is zeer stabiel (verschuift niet met opwinding) en toont een enorme Verschuiving Stokes van opwinding. De meest efficiënte excitatie vindt plaats rond 340 nm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Detectie van gouden nanoclusters in de HeLa-cellen door stromingscytometrie. Internalisering van 2 in HeLa cellen werd bestudeerd met behulp van FCM. De histogrammen tonen (a) tijd- en (b) concentratie-afhankelijke opname van AuNCs door HeLa cellen. In het tijdsafhankelijke experiment waren HeLa-cellen onbehandeld (controle; 0 h) of behandeld met 1,28 mg/mL 2 en voor de aangegeven tijdstippen bij 37 °C geïncubeerd. De cellen werden vervolgens gewassen met PBS en geanalyseerd door FCM. In het concentratieafhankelijke experiment waren HeLa-cellen onbehandeld (controle; 0 mg/mL) of behandeld met de aangegeven concentraties van 2 en op dezelfde manier verwerkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: CLSM imaging van HeLa cellen geëtiketteerd met de gouden nanoclusters. HeLa-cellen werden geïncubeerd met 2 (200 μg/mL) gedurende 24 uur en afgebeeld met CLSM. (a) Staat voor rood fluorescentiekanaal (650-760 nm); b) uitgezonden lichtkanaal (DIC) enc) is overlayvana ) enb). Schaalbalk, 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: Stabiliteitstest van 1. Fotoluminescentie spectra van 1 op 1 M NaCl om 0 uur en na 72 uur. De intensiteit werd genormaliseerd aan maxima. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NIR-emitterende AuNO's werden gesynthetiseerd met behulp van een bottom-up benadering waarbij de goudprecursoroplossing (HAuCl4)werd behandeld met geschikte thiolliganden, gevolgd door reductie van Au3+. Vermindering van metaalionen in waterige oplossing hebben de neiging om te aggregeren en resulteert in grote nanodeeltjes in plaats van ultrakleine NC's21. Om ultrakleine PL AuNCs (≤2 nm) voor te bereiden, werden de synthetische omstandigheden aangepast om de vorming van grote deeltjes te voorkomen en de vorming van ultrakleine clusters te bevorderen. De aard van de liganden die worden gebruikt om het AuNC-oppervlak te capteren, speelt ook een belangrijke rol bij het beïnvloeden van de structuur, de elektronische en optische eigenschappen van de deeltjes12,22,23,24,26,26,,2828,29,30. Daarom is het kiezen van geschikte liganden die ultrakleine clusters kunnen stabiliseren de sleutel tot het verkrijgen van zeer fluorescerende AuNC's. Thiol-bevattende liganden zijn de meest gebruikte stabilisatoren in de synthese van AuNO's, als gevolg van de sterke covalente binding tussen thiolen en goud. Een eerder rapport31 geeft aan dat liganden op basis van multithiolen veel beter zijn dan monothiolliganden bij stabilisatie van PL AuNC's. Multi-thiolliganden zorgen voor een verbeterde colloïdale stabiliteit voor AuNC's vanwege het hogere aantal bindingsplaatsen tussen ligand en AuNC-oppervlak. Bidentate thiol TA werd gebruikt voor de synthese van NIR PL AuNCs omdat het veel verbeterde colloïdale stabiliteit biedt aan AuNC's over een breed scala van ongunstige omstandigheden in vergelijking met monothiol liganden32. TA biedt ook waterige fasegroei van nanodeeltjes met discrete groottecontrole, en belangrijker nog, het biedt een carboxylic zuurgroep op het oppervlak van de nanodeeltjes die kunnen worden gebruikt voor vervoeging van biologisch relevante moleculen33,34.
TA stabiliseert AuNOCs door elektrostatische afstoting veroorzaakt door gedeprotoneerde carboxylaatgroepen op het oppervlak35. Echter, in zure oplossingen, TA-beschermde AuNOCs worden colloïdaal instabiel als gevolg van protonatie van de carboxylaat groep. Nanodeeltjes kunnen elektrosterisch worden gestabiliseerd, in plaats van puur elektrostatisch. Deze aanpak zorgt voor colloïdale stabilisatie, zelfs in aanwezigheid van hoge zoutconcentraties en pH-veranderingen, wat belangrijk is voor biomedische toepassingen. Om elektrostische stabilisatie toe te staan aan de TA-AuNCs, werden de clusters vervolgens gefunctionaliseerd met thiol-terminated PEG (MW 2.000) bij een 5:1 molaire verhouding van TA:PEG, wat 1 oplevert (Figuur 1). Voor een succesvolle bevestiging van thiol-beëindigde PEG, moeten TA-AuNCs worden gezuiverd. Functionalisering van AuNC met PEG heeft de waterige oplosbaarheid bij zure pH en een toename van colloïdale stabiliteit in hoge ionische sterkte media verbeterd. Het is belangrijk dat de bevestiging van thiol-beëindigde PEG wordt uitgevoerd bij pH 7.0-7.5. Een hogere pH zou leiden tot een blauwe verschuiving van de emissiemaxima. Niet-gebonden liganden werden verwijderd door centrifugering/filtratie met behulp van een membraanfiltratie-apparaat met een moleculaire gewichtscut-off van 3 kDa. De liganden die geassocieerd worden met nanodeeltjes ervaren een aanzienlijke lijnverbreding in 1H NMR in vergelijking met vrije liganden, die piekopdrachten en integratie kunnen verdoezelen36. Aanzienlijk brede 1H NMR piek geassocieerd met thioctisch zuur en thiol-gemodificeerde polyethyleenglycol suggereert dat de liganden zijn gebonden aan het AuNC-oppervlak en verwijdering van vrije liganden18. Succesvolle integratie van lichtgevende AuNC's in een biologisch milieu vereist stabiliteit ten opzichte van omstandigheden, zoals een hoge ionische sterkte omdat biologische media rijk zijn aan meer dan ionen. De stabiliteit van 1 werd geverifieerd door het monitoren van de fotoluminescentie in 1 M NaCl over een periode van 72 uur. Geen significante verandering in de eigenschappen van de fotoluminescentie in 1 M NaCl duidt op een hoge stabiliteit van de AuNC's (Aanvullende figuur 1). AuNC's waren langer dan een jaar stabiel in gebufferde oplossingen zonder enig neerslagbewijs (gegevens niet getoond).
1 biedt carboxylic zuur op het oppervlak. Carbodiimide gebaseerde koppelingreagentia worden op grote schaal gebruikt om carboxylic zuren covalently te koppelen aan amines via de vorming van amide bond37. De meest gebruikte carbodiimide gebaseerde koppeling reagens in waterige oplossing is 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC∙HCl). EDC∙HCl is gebruikt voor covalente koppeling van TPP bromide met 1 om 2te verkrijgen. Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is de vervoeging van moleculen met een primaire aminegroep via amidebindingvorming zonder afbreuk te doen aan fluorescentie en colloïdale stabiliteit. Uit de karakterisering van elektronenmicroscopie met een hoge resolutie (HRTEM) bleek dat de AuNC's 1 en 2 beide een gemiddelde diameter hebben van 1,15 ± 0,2 nm, wat aangeeft dat de functionele koppeling de kerngrootte van de AuNC's niet verandert18. Als alternatief kunnen de gratis carboxylgroepen worden geactiveerd met EDC en Sulfo-NHS38. Oplossingen van 1 en 2 opgewonden met een UV-lamp (365 nm) fluoresceren helder rood (Figuur 1b, begin),terwijl ze verschijnen lichtgeel onder omgevingsverlichting (Figuur 1a,inset). TPP-vervoeging verhoogt de AuNC PL als gevolg van metaal-naar-ligand ladingoverdracht (MLCT)18.
Nanodeeltjes kunnen nadelige biologische effecten veroorzaken die hun toepassingen in de biologie kunnen beperken. Om de cytotoxiciteit van 2 op HeLa-cellen te evalueren, werd XTT (natrium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfopenyl)-5-[(fenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium binnenzout) uitgevoerd. HeLa-cellen die gedurende 48 uur met 2 (200 μg/mL) werden behandeld, vertoonden geen verlies van cellevensvatbaarheid in vergelijking met controlecellen. Deze observatie suggereert AuNO's zijn biocompatibel, waardoor ze veelbelovende kandidaten als fluorescerende sondes voor toepassing in biologisch onderzoek.
Wanneer opgewonden met een 405 nm laser, 2 biedt een brede emissie met een maximum rond ~ 750 nm. De extreem grote Stokes shift (~ 350 nm) maakt het mogelijk het uitgezonden licht betrouwbaar te onderscheiden van de spannende lichtbron; De FCM-filterinstelling moet echter op de juiste manier worden geconfigureerd. Voor 2 is het 780/60 nm bandpassfilter ideaal vanwege de breedte van het filter en het feit dat het emissiemaximum van AuNC's zich in dezelfde regio bevindt. Het is van groot belang om brede bandpassfilters te gebruiken op het gebied van emissiemaxima voor een efficiënte detectie van PL39,40,41,42. Het tijd- en dosisafhankelijke fluorescentiesignaal van cellen die met 2 worden behandeld, suggereert dat FCM kan worden gebruikt om gemakkelijk celstudies te monitoren met Behulp van AuNC's. Toen de incubatietijd werd verhoogd tot 24 uur, was een concentratie van 40 μg/mL van 2 voldoende om AuNC's te detecteren door fluorescentie in FCM (gegevens niet getoond). Echter, voor korte incubatietijden (1-2 uur), hogere concentraties van AuNC's nodig zijn. Deze methode voor het detecteren van AuNCCs door NIR fluorescentiesignaal met een standaard stroomcytometer zal helpen de potentiële toepassingen van AuNC's in de biomedische wetenschap verder te verbreden. De hier beschreven aanpak kan worden gebruikt om tarieven en mechanismen van cellulaire opname14te beoordelen, relaties tussen nanodeeltjesconcentratie en cellulaire toxiciteit, of effecten van oppervlaktechemie op nanoclusteropname op een snelle en kwantitatieve manier met behulp van FCM.
Cellulaire opname van 2 door HeLa cellen werd afgebeeld door CLSM. Na 24 uur incubatie heldere rode emissie van 2 werd gedetecteerd bij opwinding met 405 nm laser. Echter, een 405 nm laser prikkelt ook de intrinsieke fluorophores in de cellen. Om het signaal van AuNC te onderscheiden van autofluorescentie, werd de emissie van AuNC verzameld boven 650 nm. De aantrekkelijke eigenschappen, zoals heldere nabij-infrarood luminescentie, hoge colloïdale stabiliteit, goede biocompatibiliteit en bovenstaande resultaten tonen aan dat de AuNC's veelbelovende beeldvormingsmiddelen zijn voor biomedische en cellulaire beeldvormingstoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sommige delen van de methoden en resultaten werden eerder gepresenteerd in het artikel door Pramanik et al.18 Hier, deze methoden zijn omgezet in praktische point-by-point protocollen. De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs zijn Alzbeta Magdolenova dankbaar voor haar hulp bij flow cytometrie. De auteurs erkennen de financiële steun van GACR project Nr. 18-12533S. Microscopie werd uitgevoerd in het Laboratorium voor Confocale en Fluorescentie Microscopie mede gefinancierd door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling en de staatsbegroting van de Tsjechische Republiek, projecten nr. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 en CZ.2.16/3.1.00/21515, ondersteund door het Tsjechisch-BioImaging grote RI-project LM2015062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
| XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt) | Thermo Fisher Scientific | X12223 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223 |
References
- Wang, Y., Chen, J., Irudayaraj, J. Nuclear Targeting Dynamics of Gold Nanoclusters for Enhanced Therapy of HER2+ Breast Cancer. ACS Nano. 5 (12), 9718-9725 (2011).
- Chen, L. Y., Wang, C. W., Yuan, Z., Chang, H. T. Fluorescent Gold Nanoclusters: Recent Advances in Sensing and Imaging. Analytical Chemistry. 87 (1), 216-229 (2015).
- Dongyun, C., Zhentao, L., Li, N., Lee, J. Y., Xie, J., Lu, J. Jianmei Amphiphilic Polymeric Nanocarriers with Luminescent Gold Nanoclusters for Concurrent Bioimaging and Controlled Drug Release. Advanced Functional Materials. 23 (35), 4324-4331 (2013).
- Tan, X., Jin, R. Ultrasmall metal nanoclusters for bio-related applications. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (6), 569-581 (2013).
- Yuan, X., Luo, Z., Yu, Y., Yao, Q., Xie, J. Luminescent Noble Metal Nanoclusters as an Emerging Optical Probe for Sensor Development. Chemistry - An Asian Journal. 8 (5), 858-871 (2013).
- Zheng, K., Setyawati, M. I., Leong, D. T., Xie, J. Antimicrobial Gold Nanoclusters. ACS Nano. 11 (7), 6904-6910 (2017).
- Li, Q., et al. Design and mechanistic study of a novel gold nanocluster-based drug delivery system. Nanoscale. 10 (21), 10166-10172 (2018).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Au10-12(SG)10-12 Nanomolecules for High Tumor Specificity and Cancer Radiotherapy. Advanced Materials. 26 (26), 4565-4568 (2014).
- Zhang, X. D., et al. Ultrasmall Glutathione-Protected Gold Nanoclusters as Next Generation Radiotherapy Sensitizers with High Tumor Uptake and High Renal Clearance. Scientific Reports. 5, 8669 (2015).
- Zhang, X. D., et al. Enhanced Tumor Accumulation of Sub-2 nm Gold Nanoclusters for Cancer Radiation Therapy. Advanced Healthcare Materials. 3 (1), 133-141 (2014).
- Zheng, J., Zhang, C., Dickson, R. M. Highly Fluorescent, Water-Soluble, Size-Tunable Gold Quantum Dots. Physical Review Letters. 93 (7), 077402 (2004).
- Wu, Z., Jin, R. On the Ligand's Role in the Fluorescence of Gold Nanoclusters. Nano Letters. 10 (7), 2568-2573 (2010).
- Lin, C. A. J., et al. Synthesis, Characterization, and Bioconjugation of Fluorescent Gold Nanoclusters toward Biological Labeling Applications. ACS Nano. 3 (2), 395-401 (2009).
- Yang, L., Shang, L., Nienhaus, G. U. Mechanistic aspects of fluorescent gold nanocluster internalization by live HeLa cells. Nanoscale. 5 (4), 1537-1543 (2013).
- Mishra, D., et al. Aqueous Growth of Gold Clusters with Tunable Fluorescence Using Photochemically Modified Lipoic Acid-Based Ligands. Langmuir. 32 (25), 6445-6458 (2016).
- Wu, Z., Gayathri, C., Gil, R. R., Jin, R. Probing the Structure and Charge State of Glutathione-Capped Au25(SG)18 Clusters by NMR and Mass Spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 131 (18), 6535-6542 (2009).
- Stamplecoskie, K. G., Kamat, P. V. Size-Dependent Excited State Behavior of Glutathione-Capped Gold Clusters and Their Light-Harvesting Capacity. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 11093-11099 (2014).
- Pramanik, G., et al. Gold nanoclusters with bright near-infrared photoluminescence. Nanoscale. 10 (8), 3792-3798 (2018).
- Salvati, A., et al. Quantitative measurement of nanoparticle uptake by flow cytometry illustrated by an interlaboratory comparison of the uptake of labelled polystyrene nanoparticles. NanoImpact. 9, 42-50 (2018).
- Zhang, C. J., et al. Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity. Angewandte Chemie. 128 (44), 13974-13978 (2016).
- Shang, L., Dong, S., Nienhaus, G. U. Ultra-small fluorescent metal nanoclusters: Synthesis and biological applications. Nano Today. 6 (4), 401-418 (2011).
- Higaki, T., et al. Controlling the Atomic Structure of Au30 Nanoclusters by a Ligand-Based Strategy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (23), 6694-6697 (2016).
- Li, G., et al. Tailoring the Electronic and Catalytic Properties of Au25 Nanoclusters via Ligand Engineering. ACS Nano. 10 (8), 7998-8005 (2016).
- Kim, A., Zeng, C., Zhou, M., Jin, R. Surface Engineering of Au36(SR)24 Nanoclusters for Photoluminescence Enhancement. Particle & Particle Systems Characterization. 34 (8), 1600388 (2017).
- Chevrier, D. M., et al. Molecular-Scale Ligand Effects in Small Gold–Thiolate Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 140 (45), 15430-15436 (2018).
- Yuan, X., Goswami, N., Chen, W., Yao, Q., Xie, J. Insights into the effect of surface ligands on the optical properties of thiolated Au25 nanoclusters. Chemical Communications. 52 (30), 5234-5237 (2016).
- Yuan, X., Goswami, N., Mathews, I., Yu, Y., Xie, J. Enhancing stability through ligand-shell engineering: A case study with Au25(SR)18 nanoclusters. Nano Research. 8 (11), 3488-3495 (2015).
- Jiang, J., et al. Oxidation at the Core-Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence. The Journal of Physical Chemistry C. 118 (35), 20680-20687 (2014).
- Padelford, J. W., Wang, T., Wang, G. Enabling Better Electrochemical Activity Studies of H2O-Soluble Au Clusters by Phase Transfer and a Case Study of Lipoic-Acid-Stabilized Au22. ChemElectroChem. 3 (8), 1201-1205 (2016).
- Wang, T., Wang, D., Padelford, J. W., Jiang, J., Wang, G. Near-Infrared Electrogenerated Chemiluminescence from Aqueous Soluble Lipoic Acid Au Nanoclusters. Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6380-6383 (2016).
- Aldeek, F., Muhammed, M. A. H., Palui, G., Zhan, N., Mattoussi, H. Growth of Highly Fluorescent Polyethylene Glycol- and Zwitterion-Functionalized Gold Nanoclusters. ACS Nano. 7 (3), 2509-2521 (2013).
- Oh, E., Susumu, K., Goswami, R., Mattoussi, H. One-Phase Synthesis of Water-Soluble Gold Nanoparticles with Control over Size and Surface Functionalities. Langmuir. 26 (10), 7604-7613 (2010).
- Nair, L. V., Nazeer, S. S., Jayasree, R. S., Ajayaghosh, A. Fluorescence Imaging Assisted Photodynamic Therapy Using Photosensitizer-Linked Gold Quantum Clusters. ACS Nano. 9 (6), 5825-5832 (2015).
- Porret, E., et al. Hydrophobicity of Gold Nanoclusters Influences Their Interactions with Biological Barriers. Chemistry of Materials. 29 (17), 7497-7506 (2017).
- Shang, L., et al. One-Pot Synthesis of Near-Infrared Fluorescent Gold Clusters for Cellular Fluorescence Lifetime Imaging. Small. 7 (18), 2614-2620 (2011).
- Wu, M., et al. Solution NMR Analysis of Ligand Environment in Quaternary Ammonium-Terminated Self-Assembled Monolayers on Gold Nanoparticles: The Effect of Surface Curvature and Ligand Structure. Journal of the American Chemical Society. 141 (10), 4316-4327 (2019).
- Gao, X., Cui, Y., Levenson, R. M., Chung, L. W. K., Nie, S. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots. Nature Biotechnology. 22 (8), 969-976 (2004).
- Bartczak, D., Kanaras, A. G. Preparation of Peptide-Functionalized Gold Nanoparticles Using One Pot EDC/Sulfo-NHS Coupling. Langmuir. 27 (16), 10119-10123 (2011).
- Dutta, D., Sailapu, S. K., Chattopadhyay, A., Ghosh, S. S. Phenylboronic Acid Templated Gold Nanoclusters for Mucin Detection Using a Smartphone-Based Device and Targeted Cancer Cell Theranostics. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (4), 3210-3218 (2018).
- Retnakumari, A., et al. CD33 monoclonal antibody conjugated Au cluster nano-bioprobe for targeted flow-cytometric detection of acute myeloid leukaemia. Nanotechnology. 22 (28), 285102 (2011).
- Pyo, K., et al. Highly Luminescent Folate-Functionalized Au22 Nanoclusters for Bioimaging. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700203 (2017).
- Fernández, T. D., et al. Intracellular accumulation and immunological properties of fluorescent gold nanoclusters in human dendritic cells. Biomaterials. 43, 1-12 (2015).
