Summary
Une méthode fiable et facilement reproductible pour la préparation de neurocomanes d’or photoluminescents fonctionnables et de leur détection directe à l’intérieur des cellules HeLa par cytométrie de flux et microscopie confocale de balayage laser est décrite.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, les nanoamas d’or fluorescent (AUNC) ont connu une popularité croissante dans les applications biologiques et d’énormes efforts ont été consacrés à leur développement. Dans ce protocole, une méthode récemment développée et facile pour la préparation des AuNC solubles, biocompatibles et colloïde stables ont été décrites en détail. Cette synthèse chimique ascendante à température ambiante fournit des AUNC facilement fonctionnels recouverts d’acide thioctique et de polyéthylène glycol modifié au thiol dans une solution aqueuse. L’approche synthétique ne nécessite ni solvants organiques ni échange de ligands supplémentaires, ni connaissance approfondie de la chimie synthétique pour se reproduire. Les AuNC qui en résultent offrent des acides carboxyliques de surface gratuits, qui peuvent être fonctionnalisés avec diverses molécules biologiques portant un groupe d’amine libre sans nuire aux propriétés photoluminescentes des AuNC. Une procédure rapide et fiable pour la quantification cytométrique de flux et la formation image microscopique confocale de l’absorption d’AuNC par les cellules de HeLa a également été décrite. En raison du grand changement de Stokes, un réglage approprié des filtres dans la cytométrie de débit et la microscopie confocienne est nécessaire pour une détection efficace de la photoluminescence proche infrarouge des AuNC.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, ultrasmall (2 nm) nanoclusters d’or photoluminescents (PL AuNC) ont émergé comme des sondes prometteuses pour la recherche fondamentale et les applications pratiques1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Leurs nombreuses caractéristiques souhaitables comprennent une photostabilité élevée, des maxima d’émissions de thon, de longues durées de vie d’émission, de grands changements stokes, une faible toxicité, une bonne biocompatibilité, un dégagement rénal et une bioconjugation facile. Les AUCN PL peuvent fournir une photoluminescence du bleu à la région spectrale proche infrarouge (NIR), selon le nombre d’atomes dans l’amas11 et la nature du ligand de surface12. NIR (650-900 nm) les AuCN émettant sont particulièrement prometteurs pour l’imagerie in vitro et in vivo à long terme des cellules et des tissus, car ils offrent un rapport signal-bruit élevé en raison d’un chevauchement minimal avec l’autofluorescence intrinsèque, une dispersion et une absorption plus faibles, et une pénétration élevée des tissus de la lumière NIR13,14.
Ces dernières années, diverses approches qui tirent parti des interactions covalentes Au-S ont été développées pour préparer les AUCN NIR-PL plafonnés à une variété de ligands contenant du thiol13,15,16,17. Pour les applications biomédicales, les AUNC doivent être fonctionnalisés avec un composant biologique pour faciliter les interactions contraignantes. Ainsi, les auNC avec une grande stabilité colloïdale qui sont facilement fonctionnables chez les solvants aqueux sont hautement souhaitables. L’objectif global du protocole actuel est de décrire une préparation précédemment rapportée de18 AuNC avec un groupe d’acide carboxylique fonctionnel sur la surface en employant l’acide thioctic et le polyéthylène glycol (PEG) dans un environnement aqueux en détail et leur conjugaison avec des molécules portant une amine primaire suivant la méthode d’accouplement acide-amine. En raison de la facilité de synthèse et de la haute reproductibilité, ce protocole peut être utilisé et adapté par des chercheurs issus de milieux non chimiques.
L’une des principales exigences pour les applications des AuNC dans la recherche biomédicale est la capacité d’observer et de mesurer les AUNC à l’intérieur des cellules. Parmi les méthodes disponibles pour surveiller l’absorption des nanoparticules par les cellules, la cytométrie des débits (FCM) et la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) offrent des méthodes robustes et à haut débit qui permettent des mesures rapides de l’internalisation des nanomatériaux fluorescents dans un grand nombre de cellules19. Ici, la méthode FCM et CLSM pour la mesure et l’analyse directes des PNC à l’intérieur des cellules, sans avoir besoin de colorants supplémentaires, ont également été présentées.
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Protocol
1. Préparation des auNC électroluminescents électroluminescents (1)
- Ajouter 7,8 mg (37,8 kmol) d’acide thioctique (TA) et 60 ll de 2 M NaOH à 23,4 ml d’eau ultrapure (résistance 18,2 M.cm à 25 oC) et remuer (au moins 1 000 tr/min) jusqu’à ce qu’il se dissout complètement (15-20 min). Pour une dissolution plus rapide de TA, sonicate le mélange. Pour la synthèse, une solution TA fraîchement préparée est recommandée.
- Ajouter 10,2 L de HAuCl4'3H2O (470 mg/mL) de solution aqueous à la solution.
- Après 15 min, ajouter 480 lil de NaBH4 (1,9 mg/mL) en remuant vigoureusement (au moins 1 000 tr/min) et remuer le mélange de réaction dans les mêmes conditions pendant la nuit.
REMARQUE : Préparez la solution NaBH4 dans de l’eau ultrapure glacée et ajoutez au mélange de réaction immédiatement après la préparation.
REMARQUE : La synthèse des AUNC est facilement évolutive. Jusqu’à 2 L d’AuNC a été synthétisé en un seul lot, sans aucun changement dans les propriétés optiques des particules. - (Critique) Le lendemain, purifier la solution en appliquant trois cycles de centrifugation/filtration à l’aide d’un dispositif de filtration membranaire avec une coupure de poids moléculaire de 3 kDa. Sans cette procédure de purification, l’étape suivante ne fonctionne pas correctement.
- Ajouter le polyéthylène glycol à base de thiol (MW 2 000; 15,6 mg; 7,8 omol) à la solution, ajuster le pH à 7-7,5 et remuer le mélange pendant la nuit pour obtenir 1. Purifier la dispersion en appliquant trois cycles de centrifugation/filtration à l’aide d’un dispositif de filtration membranaire avec une coupure de poids moléculaire de 3 kDa.
REMARQUE : L’ajustement du pH à 7-7,5 est extrêmement important. Un pH plus élevé peut entraîner un déplacement bleu des maxima d’émission.
2. Conjugaison de 3-(aminopropyl)triphenylphosphonium bromide (TPP) sur la surface de 1
- Mélanger la solution 1 (24 ml) préparée dans l’étape précédente et le bromure de triphenylphosphonium 3-(aminopropyl)triphenylphosphonium (12 mg, 30 'mol). Ajuster le pH à 4,5 avec 1 M HCl.
REMARQUE : 3-(Aminopropyl)triphenylphosphonium (TPP) le sel de bromure a été préparé tel que décrit dans la littérature20. - Commencez la réaction en ajoutant un excès de N-(3-dimethyl-aminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlorure (EDC HCl) (60 mg, 312 'mol). Le pH de la solution augmentera et ne devrait pas être autorisé à aller au-delà de 6. Surveiller le pH du mélange de réaction pendant la première heure. Si le pH augmente au-dessus de 6, réduisez-le à 4,5 à 6 en ajoutant 1 M HCl.
- Remuer le mélange de réaction toute la nuit à température ambiante.
- Purifier la dispersion en appliquant trois cycles de centrifugation/filtration à l’aide d’un dispositif de filtration membranaire avec un seuil de poids moléculaire de 3 kDa pour obtenir 2. Dilute 2 obtenu ici avec de l’eau ultrapure au volume initial de 24 ml. La concentration d’Au dans la solution est de 200 g/mL.
3. Culture cellulaire
- Cellules De culture HeLa (collection de culture HPA) dans Eagle’s Medium modifié de Dulbecco complété par 10% de sérum bovin fœtal dans 5% de CO2 à 37 oC.
- Diviser et passer les cellules lorsqu’elles atteignent la confluence à 80 %. Pour minimiser l’acquisition de nouveaux mutants, le nombre de propagations cellulaires ne doit pas dépasser 30.
4. AuNC internalisation dans les cellules HeLa
- Ensemencer les cellules dans une plaque de 12 puits à une densité de 20 000 cellules/mL (1 ml/puits). L’objectif est d’atteindre 50% de confluence après 48 h.
- À 48 h après l’ensemencement, aspirez le milieu de culture et ajoutez 400 l de milieu de culture complet (pour les contrôles non traités) ou 500 g de nanoparticules dans 400 l de milieu de culture complet (pour les échantillons traités) à chaque puits. Retournez les cultures dans un incubateur de 37 oC.
REMARQUE : L’ajout de volumes élevés de solution AuNC nuit à la viabilité de la cellule. Les solutions AuNC doivent être concentrées. Ainsi, 2 obtenus dans l’étape 2.4 est concentré 100 fois. AuNC de 40 mL était concentré à 400 ll. Un aliquot de 25 L de cette solution concentrée a été ajouté à 400 L de culture cellulaire pour obtenir la concentration désirée AuNC. - Après 2 h d’intériorisation, détachez les cellules par trypsinisation standard selon le protocole du fabricant.
- Recueillir les échantillons dans des tubes de microcentrifuge de polypropylène et de centrifugeuse pendant 5 min à 350 x g à 4 oC.
- Préparer le tampon FCM suivant: pré-réfrigéré phosphate tamponné salin (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM NaH2PO4, pH 7,4) complété par 2% de sérum bovin albumin à 4 oC.
- Laver les granulés avec 1 mL de tampon FCM et centrifugeuse pendant 5 min à 350 x g à 4 oC.
- Réutilisez le granulé dans 500 l de tampon FCM et entreposez des échantillons à 4 oC avant l’analyse.
5. Analyse de cytométrie d’écoulement
- Filtrer tous les échantillons à l’aide d’un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml avec un capuchon à tension cellulaire.
- Avant d’acquérir des données à l’aide du logiciel d’instrument, spécifiez la configuration du cytomètre.
- Formatez tous les points-intrigues et histogrammes pour 'Acquisitions'.
- Tracer une parcelle à deux paramètres de la zone de dispersion vers l’avant (FSC-A) et de la zone de dispersion latérale (SSC-A) pour afficher la distribution des cellules. Pour exclure les doublets, créez une parcelle à deux paramètres de hauteur FSC (FSC-H) vs FSC-A. Pour surveiller l’intensité relative de fluorescence dans l’échantillon, tracez un histogramme à un seul paramètre pour la zone du canal fluorescent (FL-A). Utilisez une échelle linéaire pour représenter les données FSC et SSC, ainsi qu’une échelle logarithémique pour tous les paramètres fluorescents.
- Acquérir un échantillon non traité (sans nanoparticules) à un faible débit afin de minimiser les événements coïncidents (si l’instrument le permet). Lors de l’acquisition, ajustez les tensions du tube photomultiplier (PMT) pour obtenir la population non traitée sur l’échelle sur la parcelle FSC vs SSC. Si nécessaire, ajustez les tensions PMT pour que le canal FL place la population non contaminée sur le coin gauche de l’histogramme.
- Sélectionnez l’onglet porte spécifique dans le logiciel et dessinez une porte appropriée autour de la population désirée. Les cellules à l’intérieur de la porte se déplaceront vers le prochain point de contrôle.
- Enregistrez 10 000 événements par échantillon.
- Enregistrez tous les échantillons dans les mêmes paramètres d’instruments.
- Utilisez un programme approprié pour analyser les données de cytométrie du débit.
REMARQUE : Certaines applications peuvent nécessiter une configuration personnalisée des filtres. Pour l’échange de filtres toujours suivre les recommandations de la fabrication dans le guide utilisateur.
REMARQUE : L’expérience peut être sauvegardée et rechargée pour préserver les paramètres de l’instrument et la stratégie de gating.
REMARQUE : Une hauteur de dispersion latérale (SSC-H) vs zone de dispersion latérale (SSC-A) peut également être utilisée pour l’exclusion de doublet. Ce type de gating peut être plus sensible car le détecteur FSC n’est généralement pas un PMT.
6. Internalisation de 2 dans les cellules HeLa pour la microscopie confocale de balayage laser (CLSM)
- Ensemencer les cellules sur un plat de 35 mm à fond de verre de 4 chambres à une densité de 250 000 cellules/mL (0,5 ml/chambre). Gardez la chambre dans un incubateur de 37 oC avec 5% de CO2 atmosphère. L’objectif est d’atteindre 50% de confluence après 24 h.
- À 24 h après l’ensemencement, ajouter 100 g de 2 (ou 10 l de la solution de stock de 10 mg/mL) à chaque chambre à vaisselle contenant 0,5 ml de milieu avec les cellules (pour les échantillons traités).
- Remettre le plat à l’incubateur. Laissez les cellules internaliser les AuNC pendant 24 h avant de les utiliser pour le CLSM.
- Après la période d’internalisation, jetez le milieu et lavez les cellules avec un milieu frais pré-réchauffé pendant 5 min. Répétez une fois de plus l’étape de lavage. Remplissez ensuite chaque chambre de 800 ll de milieu frais.
7. CLSM Imagerie des cellules Hela vivantes étiquetées avec 2
- Pour l’imagerie microscopique, utilisez une lentille objective d’huile de 63x (n - 1,518) (NA 1,4) au microscope confocal avec Plan-Apochromat.
- Monter le plat sur le microscope inverti étape avec la chambre réchauffée à 37 oC et fourni avec une atmosphère humidifiée de CO2.
- Pour détecter AuNC intériorisé, utilisez un laser de 405 nm réglé à 2% de puissance avec un sépara teur de faisceau approprié. Définissez la gamme de longueurs d’onde de détection entre 650 et 760 nm.
- Définissez la résolution de l’image à 2048 x 2048 pixels. Dans le réglage de la vitesse d’acquisition, visez un temps de fonctionnement de pixel autour de 4 's. Acquérir l’image avec une moyenne de 2x (mode ligne, moyenne de la méthode moyenne). Réglez le trou d’épingle à 1 unité aérée (pour 405 nm de lumière). Pour une plus grande sensibilité, utilisez le mode photon-comptage.
- Pour une illumination correcte dans la lumière transmise avec contraste d’interférence différentielle (DIC), utilisez le réglage du condenseur et de l’arrêt de champ de Kôhler. Pour l’acquisition de la lumière transmise, utilisez un laser de 488 nm à 0,7% de puissance sans aucun détecteur de fluorescence assigné. Réglez un séparamètre de faisceau approprié pour la longueur d’onde laser.
- Acquérir deux images pour chaque piste (fluorescence rouge et DIC). Suivre les AuNC par leur fluorescence rouge; les limites cellulaires sont facilement déterminées dans la lumière transmise avec des images DIC.
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Representative Results
NIR PL AuNCs ont été préparés à partir d’Au3 en présence de TA, puis LE PEG (MW 2 000) a été lié sur la surface d’AuNC pour obtenir 1 suite au flux de travail indiqué à la figure 1. Couplage amidique entre 1 et 3-(aminopropyl) triphenylphosphonium (TPP) bromure fourni 2. Comme prévu, les spectres d’absorption(figure 2a) ont indiqué que les AuCN 1 et 2 n’ont pas de bande de plasmon de surface caractéristique et montrent une émission générale de 550 nm à 850 nm(figure 2b). Après l’attachement du PTP à la surface de 1, le PL a fortement augmenté. Les émissions des AuCN étaient également visibles sous la lumière UV (365 nm, figure 2b inset). L’émission des AuNC est stable et la longueur d’onde d’émission est indépendante de la longueur d’onde d’excitation(figure 2c). Cependant, l’intensité des émissions est maximale lorsqu’elle est excitée par la lumière UV.
2 a été détecté à l’intérieur des cellules HeLa en surveillant le PL sur un cytomètre de flux. Les cellules HeLa ont été incubées pendant 2 heures avec 2 aux concentrations de médias entre 0.5 mg/mL et 2 mg/mL. Les données de la FCM ont confirmé l’absorption de 2 par les cellules HeLa. La fluorescence NIR (720 nm) dépendait à la fois du temps(figure 3a) et de la concentration de 2 (figure 3b). L’intensité maximale a été observée avec le filtre de bande de 780/60.
AuNCs dans les cellules ont été photographiés non-invasivement en utilisant un microscope à balayage laser confocque standard. La figure 4 montre l’image confocale des cellules HeLa tachées de 2 (200 g/mL). Après 24 h d’incubation photoluminescence rouge vif de 2 à l’intérieur des cellules a été observée.
Figure 1 : Synthèse des nanoamas d’or. Flux de travail de la préparation de 1 et 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Propriétés optiques des nanoamas d’or. Normalisé (a) spectra d’absorption (Inset: Photographie des solutions aqueuses de 1 et 2 sous la lumière blanche) et (b) spectra photoluminescent de 200 'g/mL solutions aqueous de 1 et 2 (Inset: photographie des solutions AuNC sous la lumière UV (365 nm)). c) Carte PL Excitation-émission de 2. L’excitation est décalée de 10 nm. Le pic d’émission autour de 750 nm est très stable (ne change pas avec excitation) et montre un énorme changement Stokes de l’excitation. L’excitation la plus efficace se produit autour de 340 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Détection des nanoamas d’or à l’intérieur des cellules HeLa par cytométrie d’écoulement. L’internalisation de 2 dans les cellules HeLa a été étudiée utilisant FCM. Les histogrammes montrent ( a )l’absorptiondépendante du temps et (b)des AuNC par les cellules HeLa. Dans l’expérience dépendante du temps, les cellules HeLa n’ont pas été traitées (contrôle; 0 h) ou traitées avec 1,28 mg/mL 2 et incubées à 37 oC pour les heures indiquées. Les cellules ont ensuite été lavées avec PBS et analysées par FCM. Dans l’expérience dépendante de la concentration, les cellules HeLa n’ont pas été traitées (contrôle; 0 mg/mL) ou traitées avec les concentrations indiquées de 2 et traitées de la même manière. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Imagerie CLSM des cellules HeLa étiquetées avec les nanoamas d’or. Les cellules HeLa ont été incubées avec 2 (200 g/mL) pour 24 h et illustrées avec CLSM. (a) Représente le canal de fluorescence rouge (650-760 nm); b) le canal de lumière transmis (DIC) et (c) est superposé de (a) etb. Barre d’échelle, 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Test de stabilité de 1. Spectra photoluminescence de 1 naCl sur 1 M à 0 h et après 72 h. L’intensité a été normalisée à la maxima. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
Les AuNC émettant du NIR ont été synthétisés à l’aide d’une approche ascendante dans laquelle la solution de précurseur d’or (HAuCl4) a été traitée avec des ligands thiol appropriés, suivis d’une réduction de Au3 . La réduction des ions métalliques dans la solution aqueuse ont tendance à s’agréger et se traduit par de grandes nanoparticules plutôt que des NCs ultrasmall21. Pour préparer les AUCN PL ultrasmall (2 nm), les conditions synthétiques ont été ajustées pour empêcher la formation de grosses particules et favoriser la formation d’amas d’ultrasmall. La nature des ligands utilisés pour couronner la surface auNC joue également un rôle important dans l’influence de la structure, propriétés électroniques et optiques des particules12,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Par conséquent, le choix de ligands appropriés capables de stabiliser les clusters ultrasmall est la clé pour obtenir des AuNCs très fluorescents. Les ligands contenant du thiol sont les stabilisateurs les plus couramment utilisés dans la synthèse des AuNC, en raison du lien covalent fort entre les thiols et l’or. Un rapport précédent31 indique que les ligands multithiol-basés sont de loin supérieurs aux ligands monothiol dans la stabilisation des AUNC PL. Les ligands multi-thiol offrent une stabilité colloïdale accrue aux AuNC en raison du nombre plus élevé de sites de liaison entre la surface de ligand et d’AuNC. Bidentate thiol TA a été utilisé pour la synthèse des AUCN PL NIR parce qu’il fournit une stabilité colloïdale beaucoup améliorée aux AuNC sur un large éventail de conditions défavorables par rapport aux ligands monothiol32. TA fournit également la croissance de phase aqueuse des nanoparticules avec un contrôle de taille discret, et surtout, il offre un groupe d’acide carboxylique à la surface des nanoparticules qui peuvent être utilisées pour la conjugaison des molécules biologiquement pertinentes33,34.
TA stabilise les AuNC par répulsion électrostatique causée par des groupes de carboxylate déprotonés à la surface35. Cependant, dans les solutions acides, les AUNC protégés par TA deviennent colloïdement instables en raison du protonation du groupe carboxylate. Les nanoparticules peuvent être stabilisées électrosterically, plutôt que purement électrostatique. Cette approche assure une stabilisation colloïdale même en présence de fortes concentrations de sel et de changements de pH, ce qui est important pour les applications biomédicales. Pour conférer la stabilisation électrosterique aux TA-AuNC, les grappes ont ensuite été fonctionnalisées avec PEG (MW 2 000) à un rapport molaire de 5:1 de TA:PEG, donnant 1 (figure 1). Pour réussir l’attachement de PEG thiol-terminé, TA-AuNCs doit être purifié. La fonctionnalisation d’AuNC avec PEG a amélioré la solubilité aqueuse au pH acide et une augmentation de la stabilité colloïdale dans les milieux à forte résistance ionique. Il est important que l’attachement de PEG thiol-terminé soit effectué à pH 7.0-7.5. Un pH plus élevé entraînerait un déplacement bleu des maxima d’émission. Des ligands non liés ont été enlevés par centrifugation/filtration à l’aide d’un dispositif de filtration de membrane avec une coupure de poids moléculaire de 3 kDa. Les ligands qui sont associés aux nanoparticules connaissent un élargissement significatif de la ligne dans 1H NMR par rapport aux ligands gratuits, ce qui peut obscurcir les affectations de pointe et l’intégration36. Significativement large 1H NMR pic associé à l’acide thioctique et le polyéthylène glycol thiol modifié suggère que les ligands sont liés à la surface auNC et l’élimination des ligands libres18. L’intégration réussie des auNC luminescents dans un environnement biologique exige la stabilité sur des conditions, telles que la force ionique élevée parce que les médias biologiques sont riches en excès d’ions. La stabilité de 1 a été vérifiée en surveillant la photoluminescence dans 1 M NaCl sur une période de 72 h. Aucun changement significatif dans les propriétés de photoluminescence dans 1 M NaCl n’indique une grande stabilité des AuNC(figure supplémentaire 1). Les AUNC sont restés stables en solution tamponnée pendant plus d’un an sans aucune preuve de précipitations (données non montrées).
1 offre de l’acide carboxylique à la surface. Les réactifs d’accouplement basés sur le carbodiimide sont largement utilisés pour relier les acides carboxyliques à des amines par la formation de la liaison amide37. Le réactif d’accouplement à base de carbodiimide le plus couramment utilisé dans la solution aqueuse est le chlorure de carbodiimide de carbodiimide de 1-éthyyl-3(dimethylaminopropyl) (EDC-HCl). EDC-HCl a été utilisé pour le couplage covalent du bromure de TPP avec 1 pour obtenir 2. Un des principaux avantages de ce protocole est la conjugaison des molécules avec un groupe primaire d’amine par la formation de liaison de amide sans compromettre la fluorescence et la stabilité colloïdale. La caractérisation de la microscopie électronique de transmission haute résolution (HRTEM) a montré que les AuNC 1 et 2 ont tous deux un diamètre moyen de 1,15 à 0,2 nm, ce qui indique que le couplage fonctionnel ne modifie pas la taille du noyau des AuNCs18. Alternativement, les groupes carboxyl gratuits peuvent être activés à l’aide d’EDC et Sulfo-NHS38. Solutions de 1 et 2 excités avec une lampe UV (365 nm) fluoresce rouge vif(figure 1b, encart), alors qu’ils apparaissent jaune clair sous l’éclairage ambiant (Figure 1a,inset). La conjugaison du PTP augmente le transfert de charge de métal à ligand d’AuNC PL (MLCT)18.
Les nanoparticules peuvent causer des effets biologiques indésirables qui peuvent limiter leurs applications en biologie. Pour évaluer la cytotoxicité de 2 sur les cellules HeLa, XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium sel intérieur) analyse de viabilité de la cellule. Les cellules HeLa traitées avec 2 (200 g/mL) pendant 48 h n’ont montré aucune perte de viabilité cellulaire par rapport aux cellules témoins. Cette observation suggère que les AUNC sont biocompatibles, ce qui en fait des candidats prometteurs comme sondes fluorescentes pour l’application dans la recherche biologique.
Lorsqu’il est excité avec un laser de 405 nm, 2 fournit une émission large avec un maximum d’environ 750 nm. Le très grand changement de Stokes (350 nm) permet de distinguer de façon fiable la lumière émise de la source lumineuse excitante; cependant, le réglage du filtre FCM doit être configuré de manière appropriée. Pour 2, le filtre à bandpass 780/60 nm est idéal en raison de l’étendue du filtre et du fait que le maximum d’émission des AuNC se trouve dans la même région. Il est très important d’utiliser de larges filtres à bandpass dans la région des maxima d’émissions pour une détection efficace de PL39,40,41,42. Le signal de fluorescence dépendant du temps et de la dose provenant de cellules traitées avec 2 suggère que le FCM peut être utilisé pour surveiller commodément les études cellulaires à l’aide d’AuNC. Lorsque le temps d’incubation a été porté à 24 h, une concentration de 40 g/mL de 2 était suffisante pour détecter les AuNC par fluorescence dans la FCM (données non montrées). Cependant, pour les temps d’incubation courts (1-2 h), des concentrations plus élevées d’AuNC sont nécessaires. Cette méthode de détection des AuCN par le signal de fluorescence NIR avec un cytomètre de débit standard aidera à élargir davantage les applications potentielles des AuCN en sciences biomédicales. L’approche décrite ici pourrait être utilisée pour évaluer les taux et les mécanismes de l’absorption cellulaire14, les relations entre la concentration de nanoparticules et la toxicité cellulaire, ou les effets de la chimie de surface sur l’absorption de nanocluster d’une manière rapide et quantitative en utilisant FCM.
L’absorption cellulaire de 2 par les cellules DeLa a été image de CLSM. Après 24 h d’incubation émission rouge vif de 2 a été détecté sur l’excitation avec 405 nm laser. Cependant, un laser de 405 nm excite également les fluorophores intrinsèques à l’intérieur des cellules. Pour distinguer le signal d’AuNC de l’autofluorescence, l’émission d’AuNC a été collectée au-dessus de 650 nm. Les propriétés attrayantes, telles que la luminescence proche infrarouge lumineuse, la stabilité colloïdale élevée, une bonne biocompatibilité et des résultats ci-dessus démontrent que les AuNC sont des agents d’imagerie prometteurs pour les applications d’imagerie biomédicale et cellulaire.
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Disclosures
Certaines parties des méthodes et des résultats ont déjà été présentés dans l’article par Pramanik et coll.18 Ici, ces méthodes ont été converties en protocoles pratiques point par point. Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Les auteurs sont reconnaissants à Alzbeta Magdolenova pour son aide avec la cytométrie du flux. Les auteurs reconnaissent le soutien financier du projet Nr. 18-12533S du GACR. La microscopie a été réalisée au Laboratoire de microscopie confocale et fluorescence cofinancée par le Fonds européen de développement régional et le budget de l’Etat de la République tchèque, projets non. CZ.1.05/4.1.00/16.0347 et CZ.2.16/3.1.00/21515, et soutenu par le grand projet tchèque-BioImaging LM2015062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | TCI Chemicals | D1601 | https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en®ion=CZ |
| Disodium hydrogen phosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 15130-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf |
| DL-Thioctic acid, 98% | Alfa Aesar | L04711 | https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/ |
| Hydrochloric acid 35% | PENTA s.r.o. | 19350-11000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf |
| Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min | Alfa Aesar | 36400 | https://www.alfa.com/en/catalog/036400/ |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000 | Sigma-Aldrich | 743127 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en®ion=CZ |
| Potassium chloride | PENTA s.r.o. | 16200-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452882 | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en®ion=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE |
| Sodium chloride | PENTA s.r.o. | 16610-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf |
| Sodium dihydrogenphosphate dihydrate | PENTA s.r.o. | 12330-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf |
| Sodium hydroxide pellets | PENTA s.r.o. | 15740-31000 | https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf |
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