Summary
该协议描述了如何测量卡内沙布迪炎的肠道渗透性。该方法有助于对肠道健康进行与肠道细菌与其宿主相互作用相关的基础生物学研究，并有助于筛选出益生菌和化学制剂，以治疗漏肠综合征和炎症性肠病。
Abstract
在活生物体中，肠道高渗透性是导致许多炎症性肠病 （IBDs） 的严重症状。Caenorhabditis elegans是一种非哺乳动物动物模型，由于其寿命短、透明度高、成本效益高和缺乏动物伦理问题而被广泛用作测定系统。本研究开发了一种方法，通过高通量图像分析系统，研究不同细菌和3，3'-二丁二醇甲烷（DIM）对大肠杆菌肠道渗透性的影响。蠕虫感染了不同的肠道细菌或与DIM共处理48小时，并喂食氟西辛异体酸（FITC）-dextran过夜。然后，通过比较蠕虫体内的荧光图像和荧光强度，对肠道渗透性进行了研究。这种方法还可能识别影响动物模型中肠道渗透性的益生菌和致病性肠道细菌，并有效检查有害或促进健康的化学品对肠道渗透性和肠道健康的影响。然而，该协议在遗传水平上也有相当大的局限性，特别是用于确定哪些基因被改变来控制疾病，因为这种方法主要用于表型测定。此外，这种方法仅限于准确确定哪些致病基物引起炎症或增加蠕虫肠道在感染期间的渗透性。因此，需要进一步深入研究，包括利用突变细菌和线虫研究分子遗传机制，以及细菌的化学成分分析，以充分评估细菌和化学物质在确定肠道渗透性方面的作用。
Introduction
肠道渗透性被认为是与肠道微生物群和粘膜免疫相关的主要障碍之一，并可能受到多种因素的影响，如肠道微生物群修饰、上皮损伤或粘液层改变1。最近的论文报道了通过分析肠道细胞层2的荧光通量率来测量培养的人类肠道细胞的肠道渗透性的有效方案，但研究论文较少，提供了一个合适的程序来测量线虫的肠道渗透性，特别是在C.elegans中，使用FITC-dextran染色。
有两个代表性的协议，用于测量C.elegans的肠道渗透性使用尼罗河红3和二氧化钠（或蓝精灵测定）4，5。在此协议中，我们使用 FITC-dextran（平均分子量 10，000），其分子量远远高于尼罗河红 （MW = 318.37） 和二氧化钠 （MW = 792.85）。FITC-dextran 比尼罗河红或二氧化钠染料更类似于实际大分子营养素，如碳水化合物，这些营养素通过肠道层被吸收。无需荧光显微镜即可轻松评估用二氧化钠（蓝色蓝精灵染料）喂养的C. elegans的肠道渗透性。然而，在蓝精灵测定中，由于缺乏标准化，对肠道渗透性进行定量分析比较困难，应手动评估4、5。在尼罗河红测定中，尼罗河红也污渍细胞中的脂液滴，这可能干扰C.elegans6的肠道渗透性的精确测定。本方案能够快速、准确地定量分析使用各种肠道细菌和化学品治疗的大肠杆菌的肠道渗透性，同时避免不特定的脂质染色。
由于价格实惠、易于操作、动物伦理问题有限、寿命短，是生物领域的一种典型模型，有利于快速实验。特别是，在整个C.elegans基因组公布后，发现C.elegans基因组中近40%的基因与导致人类疾病的基因有正交。此外，透明体允许在生物体内观察，这有利于研究细胞事件和荧光应用在细胞生物学，例如，干细胞染色与DAPI或免疫组织化学9。C. elegans经常被用作实验动物，研究肠道微生物群与宿主之间的相互作用;此外，C.elegans用于筛选促进健康的益生菌10、11、12以及促进肠道健康的膳食化学品13、14。
假单核菌和肠球菌是已知的肠道细菌，对胃肠道系统有负面影响，特别是肠道的结肠上皮细胞15，16。因此，测量这些细菌触发的肠道渗透性是筛选和开发新药所必需的，这些药物可以恢复和减少细菌炎症和感染造成的损害。在这个协议中，我们测试了这些肠道细菌对大肠杆菌渗透性的影响。
我们还报告一个优化的协议，用于测试化学物质的肠道渗透性。为此，我们使用3，3'-二氧化铝甲烷（DIM）作为模型化学，因为DIM是一种生物活性代谢物化合物，来自Indole-3-卡宾醇，存在于布拉西卡食品植物中，据报道对小鼠17、18的IBD有治疗作用。此外，我们最近发现DIM改善肠道渗透功能障碍，在培养的人类肠道细胞以及模型线虫C.elegans19。
在这项研究中，我们使用了三种不同的实验条件。首先，我们测量了不同细菌，P.aeruginosa和E.粪便对肠道渗透性的影响（图1）。其次，我们测量了活和热灭活P.aeruginosa对肠道渗透性的影响（图2）。第三，我们测量了DIM（一种化学模型）对用P.aeruginosa喂养的C.elegans的肠道渗透性的影响（图3）。
本研究的目的是开发优化的规程，以测量大肠杆菌的肠道渗透性，通过处理各种肠道细菌和化学品而改变。
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Protocol
1.准备P.aeruginosa PAO1和大肠杆菌OP50培养
- 准备500 mL的灭菌卢里亚-贝尔塔尼（LB）介质（表1），并将一个P.aeruginosa的单个菌落接种到介质中。在 37°C 下孵育培养 14 至 15 小时，摇动速度为 150 rpm。
- 将细菌培养物均匀地分配到两个500 mL离心管中，并在4°C下以3，220 x g将管离心30分钟。
- 去除上清液，直到体积为50 mL（初始体积的十分之一），然后重新悬浮细菌颗粒。
- 将浓缩细菌培养物储存在4°C，直到使用。P.aeruginosa培养物的储存期可达1个月，但新鲜培养能更好地诱发肠道损伤。
注：可以在此处暂停该协议。除了整个活细菌外，细菌培养物的上清液还可用于测试肠道细菌的影响19。 - 为了制备大肠杆菌OP50，在DYT介质中培养大肠杆菌OP50（表1），然后应用与上述步骤类似的步骤，但将体积减小到原始体积的六分之一。 例如，如果初始体积为 500 mL，则在移除上清液后，剩余体积约为 83 mL。
注：可以在此处暂停该协议。
2. 培养肠球菌KCTC 3206 文化
- 准备500 mL的消毒脑心脏输注（BHI）汤（表1）。
- 将一个菌落接种到500 mL的BHI肉汤中，并在37°C和150 rpm的摇动培养箱中孵育培养14-15小时。
- 将细菌培养物均匀地分配到两个500 mL离心管中，并在4°C下以3，220 x g将管离心30分钟。
- 取出上清液，直到体积为 50 mL（初始体积的十分之一），然后重新悬浮颗粒。
- 将浓缩细菌培养物储存在4°C，直到使用。新鲜培养能更适用于测试对肠道渗透性的影响。
注：可以在此处暂停该协议。
3. 制备热灭活大肠杆菌OP50和热灭活P.aeruginosa PAO1培养物
- 培养和收获上述细菌（步骤1.1~1.3）。
- 热灭活大肠杆菌OP50或P.aeruginosaPAO1培养如前所述20，21，22。对于热失活，在65°C（水浴）孵育再悬浮细菌30分钟。
- 将浓缩细菌培养物冷却至室温，并将其储存在4°C，直到使用。存储期可达 1 个月。
注：可以在此处暂停该协议。
4. 制备线虫生长介质（NGM）板，以测试不同细菌对大肠杆菌肠道渗透性的影响
- 将1.25克肽、1.5克NaCl、8.5克琼脂、磁搅拌器和487.5mL蒸馏水放入500 mL玻璃瓶中（表1）。
- 将混合物混合好，在121°C下将混合物高压灭菌15分钟，在水浴中冷却至55°C30分钟。
- 从水浴中取出培养基，将组件（0.5 mL的1M CaCl2，0.5 mL的胆固醇，0.5 mL的MgSO 4，12.5 mL的KPO4）（表1）加入NGM，并混合良好。
注：除胆固醇（溶解在绝对乙醇中）外，所有单个组件都必须进行高压灭武，并且每个实验步骤都必须在干净的工作台上进行。 - 将 20 mL 的 NGM 分配到每个 90 x 15 mm 培养皿中，让琼脂在室温（约 20°C）下在干净的工作台上凝固。NGM 板可在 4°C 下存储长达一个月。
注：可以在此处暂停该协议。用于 FITC-dextran 染色的 NGM 板采用相同的程序（从步骤 4.1_4.3 开始）。10 mL 的 NGM 被分配到每个 60 x 15 mm 培养皿中，允许在室温（约 20 °C）的清洁工作台上凝固。 - 在将培养物传播到 NGM 板上之前，从 4°C 冰箱中取出细菌培养物，彻底涡旋培养物。
- 在每个新鲜的NGM板中加入总共800μL的细菌培养物，让这些板在20°C的培养箱中过夜干燥。
注：对于第一个实验（图1），准备了两个带有大肠杆菌OP50的NGM板，一个带有P.aeruginosa PAO1的NGM板，以及一个带有E.粪便KCTC3206的NGM板。对于第二个实验（图2），准备了两个带活大肠杆菌OP50的NGM板，一个带有活P.aeruginosa PAO1的NGM板，以及一个带有热灭活P.aeruginosa PAO1的NGM板。
5. 制备NGM板，用于测试化学（DIM）对用P.aeruginosa喂养的C.elegans的肠道渗透性的影响
- 在 500 mL 玻璃瓶 （NGM Agar） 中加入 0.5 克肽、0.6 克 NaCl、195 mL 蒸馏水、磁性搅拌器和 6.8 克琼脂粉。
- 将 0.5 克肽、0.6 克 NaCl、195 mL 蒸馏水以及无琼脂的磁性搅拌器添加到另一个 500 mL 玻璃瓶 （NGM 汤）。
- 在 121°C 下，将两瓶（从步骤 5.1–5.2）、一个空 100 mL 玻璃瓶和一个空 500 mL 玻璃瓶进行 15 分钟的高压灭菌。然后，让含有瓶子的培养基在水浴中冷却至55°C30分钟。将琼脂培养基保存在水浴中，取出装有汤的瓶子（从步骤5.2开始），以便下一步。
- 将添加剂化学品添加到 NGM 肉汤中：0.4 mL 的 1 M CaCl 2，0.4 mL 的胆固醇 （mL），0.4 mL 的 1 M MgSO4和 10 mL 的 1 M KPO4（所有这些成分都必须除乙醇中的胆固醇外进行灭菌）。然后，在55°C下用磁搅拌器彻底搅拌混合物。
- 用二甲基硫酸盐 （DMSO） 标记高压灭菌的空 500 mL 玻璃瓶，用 DIM 标记高压灭菌的空 100 mL 玻璃瓶。
- 将 50 mL 的 NGM 肉汤转移到标有 DIM 标签的 100 mL 瓶中。将 500 μL 的 20 mM DIM 库存加入瓶中，搅拌均匀。
注：DIM 溶解在 DMSO（20 mM DIM 库存中）。 - 快速从水浴中取出 NGM 琼脂介质，将 50 mL 的 NGM 琼脂培养基加入标有 DIM 标签的瓶子中，然后彻底混合。
- 将含有 DIM 的 20 mL 等分位放入每个 90 mm x 15 mm 培养皿中。从此步骤中，可以制成大约五个包含 DIM 的 NGM 板。
注：每个 NGM 板中 DIM 的最终浓度为 100 μM。 - 要准备含 DMSO 的 NGM 板，将 150 mL 的 NGM 肉汤转移到标有 DMSO 标签的 500 mL 瓶中。将 1.5 mL 的 DMSO 添加到瓶子中，搅拌均匀。
- 将 150 mL 的 NGM 琼脂剂添加到 DMSO 标记的瓶子中，并彻底混合。
- 将含有 DMSO 的 20 mL 等分位放入每个 90 mm x 15 mm 培养皿中。从此步骤中，可以制成大约 15 个包含 DMSO 的 NGM 板。
注：每个 NGM 板 DMSO 的最终浓度为 0.5%。 - 在室温下将板固化至少 3 小时，并将其储存在 4°C 下，直到使用。
注：可以在此处暂停该协议。 - 从 4°C 冰箱（从步骤 1.4）中取出大肠杆菌OP50 或P. aeruginosa PAO1 培养基，并正确涡旋培养基，然后再扩散到 NGM 板上。
- 将800 μ0 μL的大肠杆菌OP50或P.aeruginosa PAO1细菌培养物放入每个新鲜的NGM琼脂板，让板在20°C的培养箱中过夜干燥。
注：可以在此处暂停该协议。对于第三个实验（图3），准备了两个含DMSO的NGM板，涂有活大肠杆菌OP50，一个含有DMSO的NGM板涂有活的P.aeruginosa PAO1，以及一个涂有活P.aeruginosa PAO1的含DIM的NGM板。
6. 准备年龄同步的C.埃莱甘人
- 在固体NGM板上种植蠕虫，用大肠杆菌OP50喂养它们，直到达到所需的人群。
- 使用时间鸡蛋产卵方法或漂白溶液处理，如前20、23、24所述，同步卵子。
7. 细菌或DIM和FITC-dextran喂养的处理
- 在NGM板上在20°C孵育64小时的年龄同步卵子，辅以活大肠杆菌OP50作为食物。
- 用S缓冲液清洗年龄同步的L4幼虫，并将其（超过500只蠕虫）转移到含有不同细菌和化学物质的治疗NGM板（在步骤4.6和5.14之后的说明中描述）。在20°C孵育48小时。
注：根据所使用的细菌和化学品，治疗时间从24小时到72小时不等。DIM的治疗或预防效果也可以评估通过预处理蠕虫与病原体，然后治疗蠕虫与DIM（治疗效果）或预处理蠕虫与DIM，然后用病原体治疗（预防效果）19。 - 要制备 FITC-dextran 补充板，将 2 mL 的热灭活大肠杆菌OP50 与 4 毫克 FITC-dextran 混合。然后，将 100 μL 的 FITC-dextran 和大肠杆菌OP50 混合物分成 20 个新鲜的 NGM 琼脂板（60 mm x 15 mm），让板在干净的长凳上干燥 1 小时。
注：每个 NGM 板中 FITC-dextran 的最终浓度为 20 μg/mL。 - 在车辆控制处理中，无需 FITC-dextran 即可制备 5 个含大肠杆菌OP50 的 NGM 板。为此，将 100 μL 热灭活大肠杆菌OP50 分到每个新鲜的 NGM 琼脂板（60 mm x 15 mm），让板在干净的工作台上干燥 1 小时。
注：对于每个独立实验，需要15个FITC-dextran补充NGM板和5个无FITC-dextran的NGM板。 - 经过48小时处理（从步骤7.2开始），用S缓冲液清洗蠕虫，将蠕虫转移到FITC-dextran补充板和NGM板，而不带FITC-dextran，并在一夜之间孵育板（14-15小时）。
注：对于每个治疗组，需要5次FITC-dextran染色（或车辆控制进给）的复制。 - 用S缓冲液清洗蠕虫，让它们在新鲜的NGM琼脂板中爬行1小时。
注：对于每个独立实验，总共需要 20 个新鲜的 NGM 板。在此步骤中，您可以使用没有或用大肠杆菌OP50 补充的 NGM 板。 - 在黑色 96 孔平底板的每个孔中加入 50 μL 的 4% 甲醛溶液。将大约 50 个蠕虫从每个 NGM 板转移到每个孔中，用于荧光测量。1 至 2 分钟后，彻底清除每个井中的所有甲醛，并加入 100 μL 的安装介质以涂覆油井。
注：甲醛溶液 （4%）用于固定和修复蠕虫。对于每个治疗组，使用5口井（5次复制）进行图像分析。
8. 使用 Oreetta 成像系统成像C. elegan，并通过测量 FITC-dextra-荧光摄取测定肠道渗透性
注：荧光立体显微镜可用于图像分析，而不是奥佩雷塔系统。
- 使用奥佩雷塔高含量成像系统捕获荧光图像并测量荧光强度，并使用 Harmony 软件分析图像。
- 在 Harmony 软件中，按图标打开盖子打开盖子，并将板放入机器中。
- 设置参数。
- 单击"设置"，选择板类型（96 孔角平底）并添加通道（亮场和 EGFP 通道）。
- 调整布局。转到布局选择，然后选择"跟踪"并调整参数（第一张图片为 1 μm，平面数为 10，距离为 1 μm）。
- 选择其中一个处理井和一个捕获字段，然后按"测试"在"运行"实验部分检查图片是否令人满意。
- 如果图片令人满意，请返回到"设置"部分，然后按屏幕末尾的"重置"图标。然后，选择所有目标井和适当数量的捕获字段。
- 再次转到Run 实验并输入板名，然后按"开始"开始处理。
- 要测量荧光的强度，转到图像分析部分并输入图像。通过选择EGFP通道和方法B找到细胞。 将公共阈值调整为0.5，面积调整为>200μm2，分割因子为3.0，单个阈值为0.18，对比度大于0.18。然后，计算强度属性并选择平均值作为输出。按"应用"图标保存设置。
- 转到"评估"部分，通过获取热图和数据表来测量强度。将读出参数设置为单元格 + 强度单元格 EGFP 平均值 = 每孔均值，然后开始评估。
注：可以在此处暂停该协议。 - 要从 Operetta 中提取数据，请单击"设置"按钮并选择"数据管理"。
- 选择"写入存档"，然后打开浏览并选择文件。
- 要选择该文件，请单击左角的小+信号，然后单击"测量"并选择"板名称"。
- 选择该文件，然后单击"确定"。
- 通过单击活动路径上的"浏览"信号来选择保存文件的路径。
- 单击"开始"以保存数据文件。
注：可以在此处暂停该协议。
9. 氟利昂的FITC-dextran荧光的统计分析
- 导入数据并使用统计软件计算均值和标准差 （SD）。
- 通过方差 （ANOVA） 单向分析（ANOVA），然后进行图基的多重比较测试，分析显著差异。
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Representative Results
与P.aeruginosa PAO1一起孵育后，C.elegans在蠕虫体内的FITC-dextran荧光明显增加，而孵育后与其他两种细菌菌株的荧光相比（图1）。用大肠杆菌OP50、P.aeruginosa PAO1和E.粪便KCTC3206喂养的蠕虫的荧光强度分别为100.0±6.6、369.7~38.9和105.6~10.6%。 数据强调，P.aeruginosa对上皮肠道屏障造成更严重的损伤，因此，蠕虫的肠道渗透性明显增加。基于这一结果，FITC-dextran可以很容易地穿透肠道层，因此选择P.aeruginosa作为筛选DIM效应的潜在候选病原体。虽然粪便是一种肠道病原体，可以产生细胞外超氧化物和过氧化氢，损害结肠上皮细胞DNA15，在某些情况下，E. 粪便也被称为潜在的益生菌，因为它能够产生细菌素对一些病原体25，26。益生菌的功能包括坚持上皮表面，人体胃肠道的持久性，免疫刺激和对肠道病原体的对抗活性26。因此，与车辆控制蠕虫相比，用E.粪便孵育的蠕虫的肠道渗透性保持不变。结果表明，通过荧光强度的增加可以研究感染量，P.aeruginosa比其他菌株引起更多的肠道渗透。
图2显示了基于虫体内FITC-dextran荧光强度的活灭和热灭活P.aeruginosa PAO1之间的差异。荧光图像和统计数据都表明，病原体在热失活后不会触发对线虫的任何毒性。Aeruginosa可以产生外毒素A-一种强效细胞外细胞毒素，对许多动物是致命的27。Exo毒素A可以通过在45°C至60°C28加热迅速消除。因此，热灭活化P.aeruginosa不能损害蠕虫肠道上皮的渗透性。P.aeruginosa PAO1培养物的上清明显损坏了肠道渗透性，因此，培养上清液代替全P.aeruginosa细胞可用于诱导肠道渗透功能障碍19。上清液含有内毒素、外毒素A和脂多糖29，这些成分已知能诱导细胞毒性30，31。因此，上清液的这些成分可能会影响肠道渗透性，虽然我们没有检查外毒素和脂多糖对C.elegans肠道渗透性的直接影响。
与P.aeruginosa单次治疗相比，48 h的DIM联合处理显著降低了蠕虫肠道内的FITC-dextran荧光强度（图3C，D）。单路方差分析与图基的多重比较试验的统计分析表明，使用DIM治疗后，平均荧光强度与仅P.aeruginosa治疗的荧光强度相比，显著降低。用P.aeruginosa和P.aeruginosa加DIM治疗的蠕虫的荧光强度分别为486.3±41.7和414.2±25.0%（图3E）。基于这一结果，DIM可被视为治疗细菌感染引起的肠道渗透功能障碍的良好天然产品。结果表明，DIM能减轻肠道细胞的细胞炎症，降低肠道的渗透性。这一结果与小鼠模型获得的结果相似，在小鼠模型中，DIM显示结肠32的炎症显著减少。
图1：不同细菌对大肠杆菌肠道渗透性的影响。 蠕虫的显微镜图像，包括亮场、FITC 荧光（绿色通道）和合并图像。来自 （A）大肠杆菌OP50 的蠕虫的显微镜图像，无需 FITC-dextran 喂养，（B）大肠杆菌与 FITC-dextran 喂养，（C） P. aeruginosa PAO1 与 FITC-dextran 喂养，以及 （D） E. 粪便KCTC3206 与 FITC-dextran 喂养。刻度条 = 1 毫米（白色）和 200 μm（黑色）。年龄同步的L4幼虫在用大肠杆菌（A、B）、P.aeruginosa（C）和E.粪便（D）种子的NGM板中孵育了48小时。然后，蠕虫被转移到含有FITC-dextran（B-D）的车牌上，但车辆控制（A）除外。（E） 不同细菌治疗的FITC荧光强度。FITC荧光的较高百分比表明肠道渗透率较高。列和误差条指示均值 = SD =P < 0.001 与车辆控制存在显著差异。•P < 0.001 与 FITC-dextran 处理的蠕虫有显著差异，这些蠕虫用P. aeruginosa PAO1 喂养（ANOVA，n = 5）。此图代表两个独立实验。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：活和热灭活P.aeruginosa PAO1对C.elegans肠道渗透性的影响。来自 （A） 活大肠杆菌OP50 的显微镜图像，无需 FITC-dextran 喂养，（B） 带 FITC-dextran 喂养的活大肠杆菌， （C） 带 FITC-dextran 喂养的活P. aeruginosa PAO1 与 FITC-dextran 喂养，以及 （D） 热灭活P. aeruginosa与 FITC-dextran 喂养。刻度条 = 1 毫米（白色）和 200 μm（黑色）。年龄同步的L4幼虫在NGM板中孵育48小时，种子为活大肠杆菌（A，B），活的P.aeruginosa（C），和热灭活的P.aeruginosa（D）。 然后，蠕虫被转移到含有FITC-dextran（B-D）的车牌上，但车辆控制（A）除外。（E） FITC 荧光强度比较活和热灭活P. aeruginosa PAO1.列和误差条指示平均值 = SD =P < 0.001 和 =P < 0.01，与车辆控制存在显著差异。•P < 0.001 与 FITC-dextran 处理的蠕虫有显著差异，这些蠕虫用活的P. aeruginosa PAO1 喂养（ANOVA，n = 5）。此图代表两个独立实验。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：DIM对喂食P.aeruginosa的C.elegans的肠道渗透性的影响。来自 （A）大肠杆菌OP50 的蠕虫的显微镜图像，无需 FITC-dextran 喂养，（B）大肠杆菌与 FITC-dextran 喂养，（C ）带FITC-dextran 喂养的大肠杆菌，以及 （D） P. aeruginosa和 DIM （100 μM） 与 FITC-dextran 喂养的联合处理。刻度条 = 1 毫米（白色）和 200 μm（黑色）。年龄同步的L4幼虫在NGM板中孵育48小时，种子为活大肠杆菌（A，B），活的P.aeruginosa（C），活的P.aeruginosa和DIM（D）。然后，蠕虫被转移到含有FITC-dextran（B-D）的车牌上，但车辆控制（A）除外。（E） FITC荧光强度表明，胆酸的肠道渗透性受DIM影响。列和误差条指示均值 = SD =P < 0.001 与车辆控制存在显著差异。•P < 0.001 和=P < 0.01 与用P. aeruginosa PAO1 喂养的 FITC-dextran 处理蠕虫有显著差异（ANOVA，n = 5）。此图代表两个独立实验。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
通过利用这种新方法确定C.elegans的肠道渗透性，结合自动荧光显微镜和定量图像分析，可以确定肠道微生物或化学物质在体内引起的差异，特别是在C.elegans肠道中。该协议适用于肠道渗透性调查，并适用于许多任务，如在应力条件下的活性氧物种 （ROS） 测定和形态检查，由于其方便和易于操作。此外，该方法还可用于确定治疗和预防方法对C.elegans中多种病原体的影响。特别是，它可能是研究不同细菌菌株的机制的有效方案，包括有害和有用的细菌。一些具有类似结构的病原体和益生菌对宿主33、34产生不同的影响。此过程有助于评估细菌正在利用的机制，以及靶向基质可在细胞外或细胞内分泌的位置。此外，该方法还有助于强化热处理在病原体失活中起关键作用的假设。
但是，在此过程中也存在一些困难。首先，每个板中的蠕虫数量对于统计上有意义的结果和可靠的蠕虫检测非常重要，因此建议70-90%的汇合（每孔至少50个蠕虫）。因此，应进行试验实验，以获得合适的蠕虫。其次，板材性能是影响图像质量和强度测定的重要因素之一，尤其是底层材料。在一些高级实验中，玻璃底部因其出色的光学质量而成为测量荧光的最佳选择。然而，由于价格高，聚苯乙烯底部经常被使用，虽然质量不如玻璃底部高。最后，对C. elegan的板涂层方法需要优化。在本实验中，应用了荧光安装介质，因为它可以保存和增强组织部分的标签，但它无法正确固定板底部的蠕虫。
该协议有限制;由于Elegans是线虫，因此应进行进一步的实验，如在人类肠道细胞单层和哺乳动物中进行评估。该方法测定了喂食致病菌和化学物质的大肠杆菌的质型变化。因此，应进一步阐明肠道细菌的致病或益生菌作用背后的分子和遗传机制以及化学物质的治疗效果。致病性细菌感染和化学物质的治疗作用所施加的特定信号通路可以使用各种突变细菌和突变蠕虫进行评估。此外，进一步深入研究肠道细菌的致病性和益生菌作用的化学成分将是有益的。
在这里，我们报告一个实验方案，用于使用FITC-dextran喂养，测量用不同细菌和化学品处理的大肠杆菌的肠道渗透性。我们相信，这些方案将有助于基础生物学研究，如研究肠道微生物群与肠道健康之间的相互作用，以及开发益生菌和保健品，以预防和治疗肠道健康问题。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国科学技术研究院的校内研究资助（2E29563）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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