Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi
Summary
Bu protokol, Caenorhabditis elegansbağırsak geçirgenliği ölçmek için nasıl açıklar. Bu yöntem bağırsak bakterileri ve ev sahibi arasındaki etkileşim ile ilgili bağırsak sağlığı temel biyolojik araştırma ve sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları nın tedavisi için probiyotik ve kimyasal ajanları belirlemek için tarama için yararlıdır.
Abstract
Yaşayan organizmalarda, bağırsak hiperpermeability birçok inflamatuar barsak hastalıklarına yol açan ciddi bir belirtidir (IbDs). Caenorhabditis elegans, kısa ömrü, şeffaflığı, maliyet etkinliği ve hayvan etiği sorunlarının eksikliği nedeniyle yaygın olarak bir tahsin sistemi olarak kullanılan memeli olmayan bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, c. elegans’ın yüksek işlemli görüntü analiz sistemi ile bağırsak geçirgenliği üzerine farklı bakterilerin ve 3,3′-diindolylmethane (DIM) etkilerini araştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Solucanlar farklı bağırsak bakterileri ile enfekte edildi veya 48 saat dim ile birlikte tedavi edildi ve floresan isotiyoyanat ile beslenen (FITC)-dextran gecede. Daha sonra, bağırsak geçirgenliği floresan görüntüleri ve solucan cisimleri içindeki floresan yoğunluğu karşılaştırılarak incelendi. Bu yöntem aynı zamanda hayvan modelinde bağırsak geçirgenliğini etkileyen probiyotik ve patojenik bağırsak bakterileri belirlemek için potansiyele sahip olabilir ve bağırsak geçirgenliği ve bağırsak sağlığı üzerinde zararlı veya sağlık teşvik kimyasalların etkilerini incelemek için etkilidir. Ancak, bu protokol aynı zamanda genetik düzeyde bazı önemli sınırlamalar vardır, özellikle hangi genlerin hastalığı kontrol etmek için değiştirilir belirlemek için, Bu yöntem çoğunlukla fenotipik belirlenmesi için kullanılır çünkü. Buna ek olarak, bu yöntem tam olarak hangi patojenik substratların inflamasyona neden olduğunu belirlemek veya enfeksiyon sırasında solucanların bağırsaklarının geçirgenliğini artırmakla sınırlıdır. Bu nedenle, mutant bakteri ve nematodların moleküler genetik mekanizmasının araştırılması nın yanı sıra bakterilerin kimyasal bileşen analizi de dahil olmak üzere daha derinlemesine çalışmalar, bağırsak geçirgenliğini belirlemede bakteri ve kimyasalların işlevini tam olarak değerlendirmek için gereklidir.
Introduction
Bağırsak geçirgenliği bağırsak mikrobiyotası ve mukozal bağışıklık ile ilgili ana engellerden biri olarak kabul edilir ve bağırsak mikrobiyota modifikasyonları, epitel bozukluğu veya mukus tabakası değişiklikleri gibi çeşitli faktörlerden etkilenmesi muhtemeldir1. Son kağıtlar bağırsak hücretabakası2 genelinde floresan akı oranları analiz ederek kültürlü insan bağırsak hücrelerinin bağırsak geçirgenliğini ölçmek için etkili protokoller bildirdin 2 , ama daha az araştırma kağıtları nematodlarda bağırsak geçirgenliğini ölçmek için uygun bir prosedür mevcut, Özellikle C. elegans, FITC-dextran boyama kullanarak.
Nil kırmızısı3 ve erioglaucine disodyum (veya Şirin tayini) 4,5kullanarak C. elegans bağırsak geçirgenliğini ölçmek için iki temsili protokol vardır. Bu protokolde, Nil kırmızısı (MW = 318,37) ve erioglaucin disodyum (MW = 792,85) çok daha yüksek molekül ağırlığına sahip FITC-dextran (ortalama molekül ağırlığı 10.000) kullanıldı. FITC-dextran, Nil kırmızısı veya erioglaucine disodyum boyalarından bağırsak tabakası yoluyla emilen karbonhidratlar gibi gerçek makromoleküler besinlere daha benzer. Erioglaucine disodyum (mavi Şirin boya) ile beslenen C. elegans bağırsak geçirgenliği kolayca floresan mikroskopi olmadan değerlendirilebilir. Ancak Şirin tahlillerinde, bağırsak geçirgenliğinin kantitatif analizi standardizasyon eksikliği nedeniyle zordur ve elle değerlendirilmelidir4,5. Nil kırmızısı tetkik durumunda, Nil kırmızısı da hücrelerde lipid damlacıkları lekeler, Hangi C. elegansbağırsak geçirgenliği tam belirlenmesi ni engelleyebilir6. Bu protokoller, spesifik olmayan lipid boyamakaçınArak çeşitli bağırsak bakteri ve kimyasallar ile tedavi Edilen C. elegans bağırsak geçirgenliğinin hızlı ve kesin kantitatif analizini sağlar.
C. elegans biyolojik alanlarda uygun fiyat, kolay manipülasyon, sınırlı hayvan etiği sorunları ve hızlı deneme 7için yararlı olan kısa ömrü nedeniyle tipik bir modeldir. Özellikle C. elegans genomunun tamamı yayınlandıktan sonra C. elegans genomundaki genlerin yaklaşık %40’ının insan hastalıklarına neden olan genler için ortolog olduğu bulunmuştur8. Ayrıca, şeffaf vücut hücresel olayları araştırmak ve hücre biyolojisi floresan uygulamaları için avantajlı organizma içinde gözlem sağlar, örneğin, DAPI veya immünohistokimya ile kök hücre boyama9. C. elegans genellikle bağırsak mikrobiyota ve konak arasındaki etkileşimi incelemek için deneysel bir hayvan olarak kullanılır; buna ek olarak, C. elegans tarama için kullanılır sağlık teşvik probiyotik bakteriler10,11,12 yanı sıra diyet kimyasallar bağırsak sağlığını teşvik13,14.
Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecalis olumsuz gastrointestinal sistemi etkileyen iyi bilinen bağırsak bakterileri, bağırsak sistemi özellikle kolon epitel hücreleri15,16. Bu nedenle, bu bakterilertarafından tetiklenen bağırsak geçirgenliğinin ölçülmesi, bakteriyel inflamasyon ve enfeksiyonun neden olduğu hasarı geri kazanabilen ve azaltabilecek yeni ilaçların taranması ve geliştirilmesi için gereklidir. Bu protokolde, bu bağırsak bakterilerinin C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini test ettik.
Ayrıca C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerinde kimyasallar test etmek için optimize edilmiş bir protokol rapor. Bu amaçla, dim indole-3-karbinol elde edilen bir biyoaktif metabolit bileşik olduğu için bir model kimyasal olarak 3,3′-diindolylmethane (DIM) kullanılan, Brassica gıda tesislerinde mevcut olan, ve farelerde IBD üzerinde tedavi edici etkileri olduğu bildirilmiştir17,18. Buna ek olarak, son zamanlarda DIM hem kültürlü insan bağırsak hücrelerinde bağırsak geçirgenliği disfonksiyonu yanı sıra model nematode C. elegans19geliştirir keşfetti.
Bu çalışmada üç farklı deneysel koşul kullandık. İlk olarak, farklı bakterilerin, P. aeruginosa ve E. faecalis’in bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 1). İkinci olarak, canlı ve ısıya bağlı P. aeruginosa’nın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 2). Üçüncü olarak, Dim ‘in (bir model kimyasal) P. aeruginosa ile beslenen C. elegans’ın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 3).
Bu çalışmanın amacı, çeşitli bağırsak bakterileri ile tedavi ile de değişen C. elegansbağırsak geçirgenliğini ölçmek optimize protokoller geliştirmek oldu yanı sıra kimyasallar ile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Otomatik floresan mikroskobu ve kantitatif görüntü analizini birleştiren C. elegans’ta bağırsak geçirgenliğini belirlemek için bu yeni yöntem kullanılarak, bağırsak mikroorganizmalarının veya kimyasallarının neden olduğu farklar özellikle C. elegans bağırsağında invivo olarak belirlenebilir. Bu protokol bağırsak geçirgenliği araştırmaları için yararlıdır ve rahatlığı ve kolay manipülasyonu nedeniyle reaktif oksijen türlerinin (ROS) stres koşulları altında belirle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Kore Bilim ve Teknoloji Enstitüsü intramural araştırma hibe (2E29563) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
