Этот протокол описывает, как измерить кишечную проницаемость Caenorhabditis elegans. Этот метод полезен для фундаментальных биологических исследований по здоровью кишечника, связанных с взаимодействием кишечных бактерий и их хозяина и для скрининга для выявления пробиотических и химических агентов для лечения синдрома вытекающей кишечника и воспалительных заболеваний кишечника.
В живых организмах гиперпроницаемость кишечника является серьезным симптомом, который приводит ко многим воспалительным заболеваниям кишечника (IBD). Caenorhabditis elegans является немлекопитающим животных модель, которая широко используется в качестве системы анализа из-за его короткий срок службы, прозрачность, рентабельность и отсутствие вопросов этики животных. В этом исследовании был разработан метод для исследования воздействия различных бактерий и 3,3′-diindolylmethane (DIM) на проницаемость кишечника C. elegans с высокой пропускной способностью системы анализа изображений. Черви были инфицированы различными бактериями кишечника или cotreated с DIM в течение 48 ч и кормили флуоресцен изотиоцианат (FITC)-dextran ночь. Затем проницаемость кишечника была изучена путем сравнения флуоресценции изображений и интенсивности флуоресценции внутри червя органов. Этот метод может также иметь потенциал для выявления пробиотических и патогенных кишечных бактерий, которые влияют на проницаемость кишечника в животной модели и эффективен для изучения влияния вредных или способствующих здоровью химических веществ на проницаемость кишечника и кишечного здоровья. Однако, этот протокол также имеет некоторые значительные ограничения на генетическом уровне, особенно для определения того, какие гены изменяются для контроля болезни, потому что этот метод в основном используется для фенотипического определения. Кроме того, этот метод ограничивается определением того, какие именно патогенные субстраты вызывают воспаление или увеличивают проницаемость кишечника червей во время инфекции. Поэтому для полной оценки функции бактерий и химических веществ при определении проницаемости кишечника необходимы дальнейшие углубленные исследования, включая изучение молекулярно-генетического механизма с использованием мутантных бактерий и нематод, а также анализ химических компонентов бактерий.
Проницаемость кишечника считается одним из основных барьеров, связанных с кишечной микробиотой и слизистым иммунитетом и, вероятно, будет зависеть от нескольких факторов, таких как изменения микрофлоры кишечника, эпителиальные нарушения, или изменения слизистого слоя1. Последние документы сообщили эффективные протоколы для измерения кишечной проницаемости культивированных клеток кишечника человека путем анализа флуоресценции поток ставки через слой клеток кишечника2, но меньше научных работ представляют собой подходящую процедуру для измерения проницаемости кишечника в нематод, особенно в C. elegans, с помощью FITC-dextran пятен.
Есть два репрезентативных протокола для измерения проницаемости кишечника в C. elegans с использованием Нила красный3 и erioglaucine динайди (или Smurf асссе)4,5. В этом протоколе мы использовали FITC-dextran (средний молекулярный вес 10 000), который имеет гораздо более высокий молекулярный вес, чем красный Нил (МВс 318,37) и эриоглауцин динайоя (МВт 792,85). FITC-dextran больше похож, чем красный Нил или erioglaucine динатрия красителей фактических макромолекулярных питательных веществ, таких как углеводы, которые поглощаются через кишечный слой. Проницаемость кишечника C. elegans, питаемых с помощью erioglaucine disodium (голубой краситель Smurf), может быть легко оценена без флуоресценционной микроскопии. Однако, в анализе Smurf, количественный анализ кишечной проницаемости затруднен из-за отсутсвия стандартизации и должен быть оценен вручную4,5. В случае Красного нила, Красный Нил также пятна липидных капель в клетках, которые могут помешать точное определение проницаемости кишечника в C. elegans6. Настоящие протоколы позволяют быстро и точно анализировать проницаемость кишечника у C. elegans, обработанных различными кишечными бактериями и химическими веществами, избегая при этом неспецифических липидных окрашивания.
C. elegans является типичной моделью в биологических областях из-за своей доступной цене, легкой манипуляции, ограниченных вопросов этики животных, и короткий срок службы, что выгодно для быстрых экспериментов7. В частности, после публикации всего генома C. elegans, почти 40% генов гена c. elegans были признаны ортологичными для генов, вызывающих заболевания человека8. Кроме того, прозрачный организм позволяет наблюдать внутри организма, что выгодно для исследования клеточных событий и для применения флуоресценции в клеточной биологии, например, окрашивания стволовых клеток с помощью DAPI или иммуногистохимии9. C. elegans часто используется в качестве экспериментального животного для изучения взаимодействия микрофлоры кишечника и хозяина; кроме того, C. elegans используется для проверки здоровья поощрения пробиотических бактерий10,11,12, а также диетические химические вещества содействия здоровья кишечника13,14.
Pseudomonas aeruginosa и Enterococcus faecalis являются известными бактериями кишечника, которые негативно влияют на желудочно-кишечную систему, особенно на кишечные клетки кишечника15,16. Таким образом, измерение проницаемости кишечника, вызванного этими бактериями, необходимо для скрининга и разработки новых препаратов, которые могут восстановить и уменьшить ущерб, причиненный бактериальным воспалением и инфекцией. В этом протоколе мы проверили влияние этих кишечных бактерий на проницаемость кишечника C. elegans.
Мы также сообщаем об оптимизированном протоколе для тестирования химических веществ на проницаемости кишечника C. elegans. Для этой цели мы использовали 3,3′-diindolylmethane (DIM) в качестве модели химического вещества, потому что DIM является биологически активным метаболитом соединение, полученное из индола-3-карбинол, который присутствует в Brassica пищевых растений, и, как сообщается, терапевтическое воздействие на IBD у мышей17,18. Кроме того, мы недавно обнаружили, что DIM улучшает дисфункцию проницаемости кишечника как в культивированных клеток кишечника человека, а также модель нематод C. elegans19.
В этом исследовании мы использовали три различных экспериментальных условия. Во-первых, мы измерили влияние различных бактерий, P. aeruginosa и E. faecalis, на проницаемость кишечника(рисунок 1). Во-вторых, мы измерили влияние живой и теплоинактивированной P. aeruginosa на проницаемость кишечника(рисунок 2). В-третьих, мы измерили влияние DIM (модель химического) на кишечной проницаемости C. elegans кормили с P. aeruginosa (Рисунок 3).
Целью данного исследования было разработать оптимизированные протоколы, которые измеряют проницаемость кишечника C. elegans, которая изменяется путем лечения различными кишечными бактериями, а также с химическими веществами.
Используя этот новый метод определения проницаемости кишечника в C. elegans, который сочетает в себе автоматизированную флуоресцентную микроскопию и количественный анализ изображений, различия, вызванные кишечными микроорганизмами или химическими веществами, могут быть определены…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано Корейским институтом науки и техники в интрамуральных исследований грант (2E29563).
3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
Cholesterol | Sigma | C3045 | |
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |